未知病原菌的分離鑒定

1、未知病原菌的分離鑒定 病原菌檢測(cè)程序藥物敏感試驗(yàn)直接涂片、染色、鏡檢分離、鑒定生化試驗(yàn)(書p17-18)血清學(xué)試驗(yàn)(玻片凝集法)動(dòng)物試驗(yàn)(產(chǎn)毒性、分離)初步診斷分子生物學(xué)技術(shù)(核酸雜交、PCR、基因芯片 核酸 ) 其他檢測(cè)技術(shù)觀察培養(yǎng)特征、形態(tài)特征病原菌抗原檢測(cè)形態(tài)結(jié)構(gòu)臨床標(biāo)本中未知病原性球菌的分離鑒定程序 臨床標(biāo)本直接涂片、革蘭染色、鏡檢(形態(tài),排列,染色性) 血瓊脂平板/巧克力血瓊脂平板(菌落性狀,溶血性,色素)可疑菌落 涂片,染色,鏡檢 純培養(yǎng) 生化反應(yīng) 致病性測(cè)定 藥敏試驗(yàn) 思考：如何從膿拭子、咽拭子中分離并鑒定病原性球菌？查病原標(biāo)本膿血便、肛拭子選擇/鑒別培基生化反應(yīng)血清學(xué)鑒定雙糖發(fā)

2、酵, 橘櫞酸鹽利用試驗(yàn),尿素,靛基質(zhì)試驗(yàn)玻片凝集試驗(yàn)SS平板,中國蘭,EMB未知腸道桿菌的分離鑒定程序 伊紅美藍(lán)平板- EMBEosin-methylene blue agar,EMB克氏雙糖鐵試驗(yàn)Double sugar iron slant枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)Citrate slant吲哚試驗(yàn)Indole broth玻片凝集一、材料： 5人/組 1.待檢標(biāo)本： 膿拭子、咽拭子、尿液標(biāo)本、肛拭子1#、肛拭子2# 2.培養(yǎng)基：血平板 3塊/組 EMB平板 3塊/組 克氏雙糖鐵斜面 3支/組 動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素半固體3支/組3.其他：革蘭染液、玻片、10%膽鹽、靛基質(zhì)試劑、NS、兔血漿、 3%H2O

3、2、沙門氏菌多價(jià)血清、志賀氏菌多價(jià)血清二、方法 (實(shí)驗(yàn)程序)三、結(jié)果四、討論設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)臨床標(biāo)本中病原菌的分離與鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉臨床標(biāo)本中常見病原菌的分離鑒定程序 學(xué)習(xí)膿汁、痰、糞便、尿液等臨床標(biāo)本的檢查方法實(shí)驗(yàn)要求 針對(duì)病例，對(duì)臨床標(biāo)本中的病原菌進(jìn)行分離和鑒定 實(shí)驗(yàn)前制定方案，實(shí)驗(yàn)后寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)分組 5人/組 1套標(biāo)本/組（膿汁、痰、尿液、糞便） 進(jìn)程安排 實(shí)驗(yàn)分3次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 膿汁 標(biāo)本：膿拭子 培養(yǎng)基：血瓊脂平板 其他：3%H2O2、兔血漿、生理鹽水、革蘭染液、玻片等 實(shí)驗(yàn)方實(shí)驗(yàn)方案案第1次課第2次課實(shí)驗(yàn)操作與觀察實(shí)驗(yàn)操作與觀察觸酶實(shí)驗(yàn)+-觸酶實(shí)驗(yàn)：1.挑取菌落置玻片上；

4、2.滴加12滴3%H2O2，觀察結(jié)果；實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)+-凝固酶實(shí)驗(yàn)：1.取生理鹽水于玻片上，挑取待檢菌置于生理鹽水中，制成菌懸液，觀察有無自凝現(xiàn)象。2.向菌懸液中加1滴兔血漿并混合，觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 痰 標(biāo)本：咽拭子 培養(yǎng)基：血瓊脂平板 其他：生理鹽水、10%膽鹽、Optochin紙片、革蘭染液、玻片等 實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)方案第1次第2次第3次實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作奧普托辛實(shí)驗(yàn)：1. 挑取菌落涂于血平板上，將optochin紙片貼于接種處；2. 37培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果。膽汁溶菌實(shí)驗(yàn)（平板法）：1.在血平板上標(biāo)記單個(gè)菌落2.直接在菌落上加一接種環(huán)去氧膽酸納溶液3

5、.將平板37孵育2030分鐘，觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作莢膜染色：石炭酸復(fù)紅單染 1.涂片、自然干燥、火焰固定； 2.1滴石炭酸復(fù)紅，立即沖去，鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 尿 標(biāo)本：尿液 培養(yǎng)基： EMB平板 克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基 動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基 其他：革蘭染液、靛基質(zhì)試劑、玻片等 實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)方案第1次第2次第3次實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 糞便 標(biāo)本：肛拭子（1#、2#） 培養(yǎng)基： EMB平板 克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基 動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基 其他：生理鹽水、靛基質(zhì)試劑、沙門菌多價(jià)血清、志賀菌多價(jià)血清、玻片等實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)方案第1次第2次第3次討論內(nèi)容 針對(duì)實(shí)

6、驗(yàn)步驟的討論； 對(duì)結(jié)果的分析； 還需要進(jìn)一步做哪些實(shí)驗(yàn)； 此次實(shí)驗(yàn)成功或需要改進(jìn)的地方； 其他預(yù)習(xí)：肥達(dá)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 臨床標(biāo)本中病原菌的分離與鑒定 班級(jí)_ 組別_ 姓名_ 學(xué)號(hào)_ 日期_ 材料 1. 待檢標(biāo)本： 2. 培養(yǎng)基： 3. 其他： 方法 結(jié)果 討論（包括對(duì)結(jié)果的分析、結(jié)論以及尚需追加實(shí)驗(yàn)等） 肥 達(dá) 試 驗(yàn)肥 達(dá) 試 驗(yàn) ( W i d a l test) 用已知的用已知的傷寒沙門菌傷寒沙門菌O O、H H抗原抗原、甲型副傷寒沙門菌甲型副傷寒沙門菌、肖氏肖氏、希希氏沙門菌氏沙門菌H H抗原抗原的診斷菌液，與的診斷菌液，與患者患者血清血清作作定量凝集試驗(yàn)定量凝集試驗(yàn)，檢測(cè)，檢測(cè)患者血清

7、中的相應(yīng)抗體，患者血清中的相應(yīng)抗體，輔助診輔助診斷傷寒、副傷寒?dāng)鄠?、副傷寒。Widal test 正常值正常值： 診斷傷寒：診斷傷寒：O凝集效價(jià)凝集效價(jià)1:80, H凝集效價(jià)凝集效價(jià)1:160; 診斷副傷寒：診斷副傷寒：O凝集效價(jià)凝集效價(jià)1:80, H凝集效價(jià)凝集效價(jià)1:80 才有診斷價(jià)值才有診斷價(jià)值. 動(dòng)態(tài)觀察動(dòng)態(tài)觀察：抗體效價(jià)隨病程延長而上升；：抗體效價(jià)隨病程延長而上升； 雙份血清升高雙份血清升高4倍或以上；倍或以上； O與與H抗體的診斷意義抗體的診斷意義： O，H-腸熱癥腸熱癥(傷寒或副傷寒傷寒或副傷寒)的可能性大的可能性大 O，H-患病的可能性小患病的可能性小 O不高，不高，H-預(yù)防

8、接種預(yù)防接種 / 非特異性回憶反應(yīng)非特異性回憶反應(yīng) O，H不高不高-感染早期或與傷寒沙門菌感染早期或與傷寒沙門菌O抗抗原有原有 交叉反應(yīng)的其他沙門菌感交叉反應(yīng)的其他沙門菌感染染 少數(shù)病例在整個(gè)病程中，肥達(dá)試驗(yàn)始終呈少數(shù)病例在整個(gè)病程中，肥達(dá)試驗(yàn)始終呈“-”: 早期使用抗生素治療或患者免疫功能低下早期使用抗生素治療或患者免疫功能低下Widal test (5人/組)材料：病人未知血清：1#，2#，3#菌液：O、H、PAH、PBH（已知Ag）方法：每組1塊多孔板/24支試管； 每人2支吸管； 棄0.5ml于消毒缸 1 2 3 4 5 6 NS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5ml未知

9、血清(1:10) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5菌液(搖勻) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5ml (4種,1種/人) 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 (陰性對(duì)照) 37，水浴過夜（完成一個(gè)完整的檢驗(yàn)）方法 TO TH TAH TBH TCH TO TH TAH TBH TCH 意義意義 1:640 1:320 1:640 1:320 1:640 1:160 1:640 1:160 發(fā)病早期不久前患過傷寒/菌苗接種/非特異回憶傷寒副傷寒甲肖氏副傷寒 “O”抗原凝集現(xiàn)象：（呈顆粒狀薄膜） 100100凝集：“”： 上層清亮，底部完全凝集，呈顆粒狀薄膜（有卷邊）。 7575凝集：“”： 上層不太清亮，底部凝集明顯。 5050凝集：“”： 上層混濁，下層凝集?？椎字醒胫虚g約 5050白色沉淀，周圍膜狀凝集，約5050。 2525凝集：“”：液體比較混濁，膜狀凝集少。 0 0凝集：“”：如第6 6孔，混懸后，混濁均勻，底部無凝集。 “H”抗原凝集現(xiàn)象：（呈絮狀凝集） 100凝集：“”：液體清亮，底部中央完全凝集，呈蓬松絮狀；混懸起來，液體仍然清亮，分散開的絮狀凝集塊漂浮于液體中。 75凝集：“”：上層不太清亮，底部絮狀凝集明顯。 50凝