細胞培養(yǎng)與細胞生物學常用技術(shù)

1、細胞培養(yǎng)與細胞生物學常用技術(shù)目 錄實驗一 軟瓊脂克隆形成2實驗二 細胞劃痕愈合4實驗三 細胞活力檢測6實驗四 細胞免疫熒光8實驗五 細胞轉(zhuǎn)染12實驗六 細胞總RNA提取15實驗七 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)18實驗八 Real Time PCR20實驗一 軟瓊脂克隆形成【原理】正常情況下，貼壁生長的細胞必須依附在固體基質(zhì)上才能生長，將其懸浮于液體或半固體基質(zhì)中培養(yǎng)則難以增殖，這種現(xiàn)象稱為錨定依賴性生長（anchorage dependent growth）。而某些細胞在在被轉(zhuǎn)化后，例如惡性腫瘤細胞，可以不依賴固體基質(zhì)，在半固體（瓊脂、甲基纖維素）培養(yǎng)基中也可增殖并形成細胞集落，這種現(xiàn)象稱為錨定非依賴性生長（a

2、nchorage independent growth）。錨定非依賴性生長是腫瘤細胞的一種標識，也是檢測惡性轉(zhuǎn)化細胞較為準確的標志之一。軟瓊脂克隆形成技術(shù)，則是在體外水平檢測腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞系錨定非依賴性生長能力最常用的手段之一。該技術(shù)利用低熔點瓊脂糖模擬體內(nèi)細胞所處的半固體狀態(tài)，并將細胞消化成單細胞，使細胞處于不貼壁及單細胞狀態(tài)。經(jīng)過三周左右的生長，通過比較克隆形成率，來比較不同細胞或同一種細胞在不同的處理之后的轉(zhuǎn)化及錨定非依賴生長的能力。因此，軟瓊脂克隆形成實驗是腫瘤研究領(lǐng)域一種重要的體外檢測技術(shù)。【材料】 1、儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、酒精燈、高壓滅菌鍋、水浴鍋；2、

3、試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、無水乙醇、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、低熔點瓊脂糖；3、細胞株：肝癌細胞系HepG2；【步驟】1、配制1.2%和0.7%的低熔點瓊脂糖，高壓滅菌后置于42水浴鍋（或者恒溫溫箱）中，使其保持融化狀態(tài)；2、配制2x DMEM培養(yǎng)基（含20%FBS、2x抗生素），37預(yù)熱；3、將1.2%的低熔點瓊脂糖膠與2x DMED培養(yǎng)基等體積混合，將混合液加入到6孔板中，每孔1.5mL，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，室溫放置待其凝固；4、取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后盡量吹散細胞，制成單細胞懸液，取出10L，細胞懸液進行細胞計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞至1x104個/m

4、L；5、待下層膠完全凝固后，各取1.5mL的0.7%瓊脂糖膠與2x培養(yǎng)基進行等體積混合，加入300L細胞懸液，充分混勻后入6孔板中，每孔1mL（即1000個細胞/孔），每種細胞設(shè)置3個平行孔；6、將6孔板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)2-3周后，每孔加入1mL 0.1%結(jié)晶紫染色，室溫染色10min，再用清水洗30min，鏡下拍照，計數(shù)并分析克隆形成情況。實驗二 細胞劃痕愈合【原理】細胞遷移是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后而產(chǎn)生的移動。細胞遷移是正常細胞的基本功能之一，是機體正常生長發(fā)育的生理過程，也是活細胞普遍存在的一種運動形式。胚胎發(fā)育、血管生成、傷口愈合、免疫應(yīng)答、炎癥反

5、應(yīng)、動脈粥樣硬化、癌癥轉(zhuǎn)移等過程中都涉及細胞遷移。細胞劃痕愈合實驗（wound healing）簡稱劃痕實驗，是最早用來研究細胞遷移的體外實驗，操作簡單，經(jīng)濟實惠，因而被廣泛應(yīng)用。細胞劃痕愈合的操作過程十分簡單，基本的步驟包括“劃痕”的制造，細胞遷移期間圖像的獲得以及后期數(shù)據(jù)的處理。具體過程為：當細胞長到融合成單層狀態(tài)時，在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕”；然后置于顯微鏡下連續(xù)拍照，記錄劃痕邊緣的細胞逐漸進入空白區(qū)域，即“劃痕”愈合的過程，最后根據(jù)“劃痕”愈合的速率反映細胞遷移的速率?！静牧稀?、儀器：CO2培養(yǎng)箱、活細胞工作站、超凈工作臺、酒精燈；2、試劑及耗材：DMEM培

6、養(yǎng)基、胎牛血清、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、30mm直徑細胞培養(yǎng)皿、尺子、記號筆；3、細胞株：肝癌細胞系HepG2；【步驟】1、培養(yǎng)皿接種細胞前，先用直尺測量，并在培養(yǎng)皿背面做“橫線”標記，大約每隔0.51.0cm一條，一共5條線；2、取處于指數(shù)生長的細胞，胰酶消化后收集細胞沉淀，細胞計數(shù)后稀釋至2.5x105個/mL；3、取背面做好標記的培養(yǎng)皿（直徑30mm），每皿接種2mL細胞，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)34h；4、取出細胞培養(yǎng)皿，用10L槍頭比著直尺，垂直于底面的橫線劃痕；5、加入1mL PBS緩沖液，清洗細胞3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細胞碎片；6、加入2mL無血清培養(yǎng)基，置于活細胞工作站

7、下拍照24h，每小時拍一張照片；7、根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果，計數(shù)細胞遷移率。遷移率=【（T0時劃痕寬度值-Tt時劃痕寬度值）/T0時劃痕寬度值】x100%實驗三 細胞活力檢測【原理】最常用的細胞活力檢測方法為噻唑藍比色法（MTT法）。MTT全稱為3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學名為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍，是一種黃顏色的染料。活細胞線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶可以將外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚，并沉積在細胞中，但死細胞沒有此功能，因此結(jié)晶

8、形成的量與活細胞數(shù)成正比。DMSO能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反應(yīng)活細胞數(shù)量。由于該方法靈敏度較高，而且相對比較經(jīng)濟，因此廣泛應(yīng)用于藥物篩選等細胞毒性檢測領(lǐng)域。【材料】1、儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、酒精燈、多功能酶標儀；2、試劑：細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT（5mg/mL）、DMSO、75%乙醇、PBS溶液、順鉑母液3、細胞株：肝癌細胞系HepG2；【步驟】一、細胞接種1、從CO2培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，胰酶消化后，加入培養(yǎng)基重懸細胞并轉(zhuǎn)移至離心管中；2、800rpm離心2min，棄上清；3、加入35mL新鮮

9、培養(yǎng)基重懸細胞（以25cm2培養(yǎng)瓶為例），吸取10L細胞懸液，滴加至血球計數(shù)板上進行細胞計數(shù)；4、根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，將細胞濃度稀釋至4x104個/mL；5、將細胞懸液按100L/孔加至96孔細胞培養(yǎng)板；6、將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)過夜。二、細胞荷藥1、用新鮮培養(yǎng)基將5mM順鉑母液的藥物濃度稀釋至15M；2、從CO2培養(yǎng)箱中取出96孔板，吸棄培養(yǎng)基，實驗組更換為上述含藥物的新鮮培養(yǎng)基，對照組更換為新鮮培養(yǎng)基；3、將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng)24h。三、MTT法檢測1、從CO2培養(yǎng)箱中取出96孔板，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入90L新鮮培養(yǎng)基及10L 5mg/mL MTT；2、將9

10、6孔板置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng)4h；3、吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100L DMSO，震蕩混勻10min；4、用酶標儀測定490nm處的吸光值（A490），計算細胞活力。實驗四 細胞免疫熒光【原理】免疫細胞化學（immunohistochemistry），是利用抗原抗體間特異性結(jié)合的原理，同時借助特殊的標記技術(shù)，實現(xiàn)對細胞內(nèi)目的抗原或抗體進行定位、定性或定量檢測的一種技術(shù)。它不僅特異性強、靈敏度高，而且克服了傳統(tǒng)免疫學檢測技術(shù)只能定性和定量，而不能定位的缺點，可以實現(xiàn)定性定量的同時對目的蛋白進行精確定位，因此又被稱為原位免疫檢測技術(shù)。也正由于具備這些優(yōu)勢，免疫細胞化學技術(shù)已在免疫學、微生物學、

11、病理學、腫瘤學以及臨床檢驗等諸多領(lǐng)域中得以被廣泛應(yīng)用。免疫細胞化學技術(shù)有多種染色方式，根據(jù)標記物的種類，分為免疫熒光法、免疫酶標法、免疫鐵蛋白法及免疫膠體金發(fā)等。其中，免疫熒光法結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡拍照技術(shù)，大大提高了檢測分辨率，可以更為精確地檢測抗原的細胞定位及分布。目前可選用的熒光素較多，其中較為成熟的熒光素標記物包括異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、四甲基異硫氰酸羅丹明 （tetramethyl rhodamin isothiocyanate，TRITC）、四乙基羅丹明（rhodamine，RB200）等，更有利于實現(xiàn)同時對兩種或多種抗

12、原進行檢測，即雙染和多染技術(shù)。另外，免疫熒光可以對活細胞進行染色，在流式細胞術(shù)（flowcytomitry，F(xiàn)CW）方面有更多的應(yīng)用，因而成為最為常用的免疫細胞化學技術(shù)之一。免疫熒光技術(shù)是先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細胞中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，受激發(fā)光的照射后，由低能態(tài)進入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài)的過程中可以發(fā)出明亮的熒光，利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。根據(jù)熒光素標記的

13、位置，可以分為直接法與間接法。直接法是最早的標記方法，是利用熒光素直接標記待測蛋白第一抗體的標記方法，這種方法特異性高，但靈敏度較低，而且每種抗體均需要單獨標記，十分不便且成本相對較高，因此逐漸被其他方法所替代；間接法是對直接法的改進，它不再標記直接與抗原結(jié)合的特異性一抗，而是標記與一抗結(jié)合的二抗，由于與一抗結(jié)合的二抗分子往往不是一個，因此間接法可以大大提高檢測的靈敏度，與直接法相比，熒光亮度可增強3-4倍。除靈敏度高外，間接法所需要的種屬間接熒光抗體，可以適用于同一種屬產(chǎn)生的多種第一抗體的標記顯示，大大降低了檢測成本，因此成為現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的免疫熒光技術(shù)之一?！静牧稀?、儀器：CO2培養(yǎng)箱、

14、倒置顯微鏡、超凈工作臺、酒精燈、正置熒光顯微鏡、高壓滅菌鍋；2、試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、無水乙醇、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、4%多聚甲醛、P53一抗、FITC熒光二抗、抗熒光衰減封片劑、Triton X-100；3、細胞株：肝癌細胞系HepG2；【步驟】一、準備工作1、切片處理：將蓋玻片置于濃酸浸泡過夜，自來水沖洗20遍，蒸餾水清洗5遍，高壓滅菌，烘干備用；2、細胞懸液制備：胰酶消化HepG2細胞，收集細胞沉淀，培養(yǎng)基重懸，制成單細胞懸液，計數(shù)后稀釋至2x105個/mL備用。二、細胞爬片1、在6孔板孔中央滴加100L培養(yǎng)基，每孔放入一張經(jīng)過處理的蓋玻片，使其恰好覆蓋在

15、孔內(nèi)培養(yǎng)基上；2、每孔緩慢逐滴加入2mL稀釋后的細胞懸液，輕柔混勻；3、將6孔板置于CO2孵箱中，培養(yǎng)過夜。三、免疫熒光1、取出6孔板，棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS輕柔清洗3次，每次3min；2、每孔加入1mL預(yù)冷的4%多聚甲醛，4固定20min；3、PBS清洗3次，每次3min；4、每孔加入1mL含0.2%Triton X-100的PBS，冰上靜置10min；5、PBS清洗3次，每次3min；6、每孔加入1mL含1%BSA的PBS，室溫封閉1h；7、將P53一抗以1:100的比例稀釋后，取出100L滴加在封口膜上，從培養(yǎng)孔中取出蓋玻片，用吸水紙吸去背面及細胞面邊緣處的液體后，輕輕放在封口膜上，細胞

16、面與抗體均勻接觸，4孵育過夜；8、取下蓋玻片，置于6孔板相應(yīng)孔中，PBS清洗3次，每次3min；9、滴加熒光素二抗，37孵育30min（注意避光操作）；10、PBS清洗3次，每次3min；11、每孔加入500L DAPI染色液，室溫染色5min；12、PBS清洗3次，每次3min；13、取一張潔凈載玻片，中心位置滴加50L抗熒光淬滅封片劑，從6孔板中取出蓋玻片，控干液體，貼有細胞的一面朝下，放置在封片液上，盡量避免氣泡；14、顯微鏡下觀察、拍照。實驗五 細胞轉(zhuǎn)染【原理】細胞轉(zhuǎn)染是將外源DNA或RNA導入真核細胞，用來研究真核細胞基因功能、基因表達調(diào)控和蛋白質(zhì)表達的專門技術(shù)。根據(jù)實驗?zāi)康?，細胞轉(zhuǎn)

17、染技術(shù)分為兩大類嗎，分別為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染是指外源基因進入受體細胞后，不整合到宿主染色體上，以游離的形式存在，一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，因此可產(chǎn)生高水平的表達。但由于無法復制，表達時間有限，僅持續(xù)2-4天，最終在細胞分裂過程中逐漸丟失。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染則是指外源基因整合到宿主細胞染色體上，成為宿主細胞基因組的一部分，可以復制并穩(wěn)定地遺傳給子代細胞，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。因此，瞬時轉(zhuǎn)染一般用于短期研究，例如研究基于或基于產(chǎn)物的短期表達，基于敲出或RNA介導的基于沉默，以及蛋白質(zhì)小規(guī)模表達等；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染則用于需要基因長期持續(xù)的表達情況，例如大規(guī)模蛋白表達、長期藥理學研究、基因治療研究和長期

18、遺傳調(diào)控機制研究等。相較于瞬時轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所需要時間更長，成本更高。細胞轉(zhuǎn)染過程中，僅有部分細胞可以成功轉(zhuǎn)入外源基因，這部分細胞占總細胞的百分比被稱為轉(zhuǎn)染效率。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，其中包括：細胞培養(yǎng)基、細胞狀態(tài)、細胞密度、DNA質(zhì)量、血清含量、抗生素、DNA質(zhì)量（g）/轉(zhuǎn)染試劑體積（L）比、轉(zhuǎn)染方法等。一般情況下，處于指數(shù)生長中后期的細胞，生長狀態(tài)越良好越容易轉(zhuǎn)染；細胞密度最好控制在70%-90%之間；血清的存在會影響DNA-轉(zhuǎn)染復合物的形成；轉(zhuǎn)染過程中使用抗生素可能增加細胞的死亡率；推薦DNA質(zhì)量（g）/轉(zhuǎn)染試劑體積（L）比為1:21:3；DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大，DNA不純，如

19、帶少量的鹽離子、蛋白、脂多糖、內(nèi)毒素等都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行；轉(zhuǎn)染技術(shù)較多但各有利弊，如DEAE右旋糖苷法、磷酸鈣法、電穿孔法、脂質(zhì)體法等。目前最為常用的方法為脂質(zhì)體法、病毒介導法及電穿孔法。脂質(zhì)體法是利用帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物，沉積于細胞表面，通過內(nèi)吞作用進入細胞，這種方法幾乎適用于所以細胞，轉(zhuǎn)染效率高，適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染尤其適用于一些難轉(zhuǎn)染的細胞，例如原代細胞、活體細胞等，但需要考慮安全因素；電穿孔法利用短暫的高電場電脈沖處理細胞，破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔進入細胞，可用于各種細胞，且不需要另外采購特殊試劑，但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀，而且此

20、方法對細胞損傷很大，細胞的死亡率高，每次轉(zhuǎn)染需要大量的細胞和DNA。本實驗采用多價陽離子脂質(zhì)體介導的瞬時轉(zhuǎn)染方法?！静牧稀?、儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、酒精燈、離心機、血球計數(shù)板、計數(shù)器；2、試劑：細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine®2000、75%乙醇、PBS緩沖液、0.25%胰酶溶液、質(zhì)粒（pcDNA3.1（-）空載體、pcDNA3.1（-）-P53重組載體、pEGFP-C1空載體）；3、細胞株：肝癌細胞系HepG2；【步驟】一、細胞接種1、從CO2培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，胰酶消化后，加入培養(yǎng)基重懸細胞并轉(zhuǎn)移至離心管中；

21、2、800rpm離心2min，棄上清；3、加入35mL新鮮培養(yǎng)基重懸細胞（以25cm2培養(yǎng)瓶為例），吸取10L細胞懸液，滴加至血球計數(shù)板上進行細胞計數(shù)；4、根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，將細胞濃度稀釋至2x105個/mL；5、按2mL/孔將細胞懸液加入至6孔細胞培養(yǎng)板；6、將6孔板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)過夜。二、細胞轉(zhuǎn)染1、配制A液：2.5g質(zhì)粒DNA加入到100L Opti-EME培養(yǎng)基（或無血清培養(yǎng)基）配成A液，上下顛倒混勻，孵育5min；2、配制B液：將7.5L的Lipofectamine ® 2000加至100L Opti-EME培養(yǎng)基（或無血清培養(yǎng)基）配成B液，上下顛倒混勻，孵育5

22、min；3、配制C液：將A液加入B液，充分混勻為C液，室溫孵育15min；4、在孵育過程中，取出過夜培養(yǎng)于6孔板的HepG2細胞，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入2mL新鮮培養(yǎng)基（不含雙抗）；5、孵育結(jié)束后，每孔加入500L C液，逐滴多位置加入，輕輕搖動6孔板；6、置37培養(yǎng)箱孵育；7、孵育6小時后，更換新鮮培養(yǎng)基（不含雙抗）。實驗六 細胞總RNA提取【原理】利用高濃度強變性劑異硫氰酸胍迅速破壞細胞結(jié)構(gòu)，使存在于細胞質(zhì)及核中的RNA釋放出來，并使核糖體蛋白與RNA分子解離。同時，高濃度異硫氰酸胍和-巰基乙醇還可以使細胞內(nèi)的各種RNA酶失活，保護釋放出的RNA不被降解。細胞裂解后的裂解溶液內(nèi)除RNA以外，

23、還有核DNA、蛋白質(zhì)以及細胞殘片，通過氯仿等有機溶劑抽提、離心，可將RNA與其它細胞組份分離開來，得到純化的總RNA。TRIzol是一種抽提總RNA的復合試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破壞細胞，抑制細胞釋放出RNA酶，適用于多種組織和細胞總RNA的提取。【材料】1、試劑：TRIzol、RNase-free水、氯仿、異丙醇、75%乙醇、PBS緩沖液；2、細胞株：肝癌細胞系HepG2；【步驟】一、準備工作1、操作人員：戴口罩、手套；2、工作區(qū)域：實驗室事先經(jīng)紫外線照射過夜，實驗開始前用75%乙醇擦拭臺面。實驗過程中不要隨意接觸非實驗物品并盡量減少走動；3、實驗器具：用75%乙醇擦拭移液器和EP

24、管架；低溫離心機預(yù)冷；-20預(yù)冷的75%乙醇。二、總RNA的提取1、從CO2培養(yǎng)箱中取出實驗五轉(zhuǎn)染過的6孔板，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)；2、吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次；3、按1mL/孔加入TRIzol試劑，使其充分接觸細胞，室溫靜置2min；4、用移液器輕輕吹起細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至無RNase的1.5mL EP管中；5、按0.2mL/1mL TRIzol比例加入氯仿，蓋緊EP管蓋，用手劇烈震蕩混勻，直至溶液呈乳白色，無分相現(xiàn)象；6、室溫靜置5min，4 12000rpm離心15min（離心過程中，準備新的1.5mL EP管）；7、從離心機中小心取出EP管，此時勻漿液分為三層，上層是透明的

25、水相，RNA溶解在此層中；半固體狀的中間層，此層含有DNA；下層為粉紅色的有機相，蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)溶解在此層中；8、將上層溶液小心轉(zhuǎn)移至新的EP管中，每個EP管中約能取出400L（要求謹慎操作，切勿吸到中間層）；9、往水相中加入等體積異丙醇（純化RNA），上下顛倒EP管，充分混勻；10、室溫靜置10min后，4 12000rpm離心15min；11、小心棄去上清，白色沉淀即為總RNA；向含有沉淀的EP管中加入1mL -20預(yù)冷的75%乙醇，輕輕上下顛倒，洗滌沉淀；12、4 12000rpm離心5min；13、用移液器除去上清，盡量不要接觸沉淀；14、將EP管再次瞬時離心，用移液器將殘存在EP

26、管底部的少量液體除去；15、打開EP管蓋，室溫放置5min干燥（時間太長，RNA不易溶解）；16、用30L RNase-free水溶解沉淀；17、RNA溶液保存在-80冰箱中；三、RNA質(zhì)量檢測1、吸光度測定方法原理：核酸在260nm附近有強吸收，蛋白質(zhì)在280nm附近有強吸收，因此常利用此性質(zhì)，使用紫外分光光度計測定核酸溶液在260nm和280nm下的吸光度，根據(jù)A260的吸光度，計算提取的核酸收量，根據(jù)A260/A280的比值來評價提取的核酸純度。理想的RNA純度A260/A280應(yīng)在1.82.2范圍內(nèi)；步驟：按照1:50的比例，用RNase-free水稀釋RNA樣品；利用分光光度計測定2

27、60nm、280nm及320nm波長下的光密度，計算其A260/A280的比值和RNA濃度；RNA濃度計算公式如下：RNA濃度（g/L）=（A260-A320）x稀釋倍數(shù)x0.04；2、凝膠電泳方法原理：根據(jù)1%瓊脂糖凝膠電泳（總RNA上樣量1000ng左右）結(jié)果，對提取的總RNA進行RNA完整性以及是否有基因組DNA污染的評價；如果可以清晰觀察到兩條rRNA條帶（真核生物：28S和18S；原核生物：23S和16S），且其濃度比值大約為2:11:1，則RNA未降解，否則有部分降解；若觀察到smear，則RNA已發(fā)生完全降解；如果觀察到大于28S或23S的條帶，則樣品可能有基因組污染，這時可以考

28、慮使用DNase處理。實驗七 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)【原理】RNA自身不能作為PCR反應(yīng)的模板，所以必須先將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄酶可以用mRNA作為模板產(chǎn)生與之互補而不含內(nèi)含子的cDNA，后者可用于構(gòu)建cDNA文庫。此時可應(yīng)用兩種引物，一種是特異性互補于mRNA 3末端的寡聚腺苷酸的oligo dT引物，另一種是隨機核苷酸的寡聚體。將PCR與逆轉(zhuǎn)錄結(jié)合應(yīng)用，可以進行目的基因的特異性擴增，檢測組織或細胞中mRNA的表達水平。【材料】試劑：PrimerScript RT reagent；【步驟】1、總RNA溶液稀釋至200ng/L；2、配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液（要求冰上操作），反應(yīng)體系如下：試劑 體積（L）

29、RNase-free ddH2O 1.5L5xPrimer Script Buffer 2.0LOligo dT Primer（50M） 0.5LRandom 6 mers（100M） 0.5LPrimer Script RT Enzyme Mix 0.5LTotal RNA（200ng/L） 5.0L總體積 10.0L注：10L逆轉(zhuǎn)錄體系中加入1000ng的Total RNA3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在PCR儀中進行，反應(yīng)條件如下：37 15min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85 5sec（加熱使逆轉(zhuǎn)錄酶失活）4 Hold4、反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA溶液放置于4保存（長期保存需置于-20）實驗八 Real Time PCR【原理】利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，通過