基因組學 課件 2.遺傳作圖 3 物理圖

1、2021/6/16中英聯合實驗室1基本概念l基因組（基因組（GenomeGenome）：）：一個生物體、細胞器或病毒的一個生物體、細胞器或病毒的整套基因和染色體組成，即全部基因的總稱（包括整套基因和染色體組成，即全部基因的總稱（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)） l基因組學（基因組學（GenomicsGenomics）：）：以基因組分析為手段，對以基因組分析為手段，對所有基因進行基因組作圖、核苷酸序列分析、基因所有基因進行基因組作圖、核苷酸序列分析、基因定位、時序表達模式和基因功能分析的一門科學。定位、時序表達模式和基因功能分析的一門科學。l分子遺傳學的分支學科分子遺傳學的分

2、支學科l提供有關生物物種及其細胞功能的進化信息提供有關生物物種及其細胞功能的進化信息l生命科學的前沿和熱點領域生命科學的前沿和熱點領域2021/6/16中英聯合實驗室2基因組學l最早最早19861986年，由美國霍普金斯大學著名人年，由美國霍普金斯大學著名人類遺傳學家和內科教授類遺傳學家和內科教授McKusickMcKusick（1921-1921-20082008）提出來的）提出來的l隨著人類基因組計劃的實施，基因組學逐隨著人類基因組計劃的實施，基因組學逐漸成為漸成為一門以一門以結構基因組學結構基因組學為主的高度綜為主的高度綜合和跨學科的科學合和跨學科的科學l功能基因組學、比較基因組學、環(huán)境

3、基因功能基因組學、比較基因組學、環(huán)境基因組學、藥物基因組學等都紛紛出臺。組學、藥物基因組學等都紛紛出臺。2021/6/16中英聯合實驗室3 什么是基因組？一個物種中所有基因的整體組成。一個物種中所有基因的整體組成。人類基因組的兩層意義：遺傳信息和人類基因組的兩層意義：遺傳信息和遺傳物質。遺傳物質。揭開生命的奧秘，需要從整體水平研揭開生命的奧秘，需要從整體水平研究基因的存在、基因的結構與功能、究基因的存在、基因的結構與功能、基因之間的相互關系?；蛑g的相互關系。 2021/6/16中英聯合實驗室4 基因組研究內容基因表達研究，即比較不同組基因表達研究，即比較不同組織和不同發(fā)育階段、正常狀態(tài)織和

4、不同發(fā)育階段、正常狀態(tài)與疾病狀態(tài)，以及體外培養(yǎng)的與疾病狀態(tài)，以及體外培養(yǎng)的細胞中基因表達模式的差異。細胞中基因表達模式的差異。基因產物基因產物- -蛋白質功能研究，包蛋白質功能研究，包括單個基因的蛋白質體外表達括單個基因的蛋白質體外表達方法。方法。蛋白質蛋白質- -蛋白質功能研究。蛋白質功能研究。2021/6/16中英聯合實驗室5基因組學的分類l分類：分類：l結構基因組學結構基因組學(Structural Genomics) (Structural Genomics) l比較基因組學比較基因組學(Comparative Genomics) (Comparative Genomics) l功能基

5、因組學功能基因組學(Functional Genomics) (Functional Genomics) l藥物基因組學藥物基因組學(Medical Genomics) (Medical Genomics) l營養(yǎng)基因組學營養(yǎng)基因組學(Nutritional Genomics) (Nutritional Genomics) l生物信息學生物信息學(Bioinformatics) (Bioinformatics) l蛋白質組學蛋白質組學(Proteomics) (Proteomics) 2021/6/16中英聯合實驗室6基本概念l結構基因組學：結構基因組學：l通過基因作圖、核苷酸序列分析確定基因

6、組成、基通過基因作圖、核苷酸序列分析確定基因組成、基因定位的科學。因定位的科學。l將基因組分解成小的易操作的結構區(qū)域，構建高分將基因組分解成小的易操作的結構區(qū)域，構建高分辨率的遺傳圖、物理圖、轉錄本圖，一個生物體基辨率的遺傳圖、物理圖、轉錄本圖，一個生物體基因組的最終圖就是它的全部因組的最終圖就是它的全部DNADNA序列序列 。l人類基因組計劃人類基因組計劃l果蠅基因組果蠅基因組l擬南芥菜基因組擬南芥菜基因組2021/6/16中英聯合實驗室7基本概念l遺傳連鎖圖：通過遺傳重組所得到的基因線性排列遺傳連鎖圖：通過遺傳重組所得到的基因線性排列圖稱為遺傳連鎖圖。通過計算連鎖的遺傳標志之間圖稱為遺傳連

7、鎖圖。通過計算連鎖的遺傳標志之間的重組頻率的重組頻率, ,確定它們的相對距離。確定它們的相對距離。 l物理圖譜：是利用限制性內切酶將染色體切成數個物理圖譜：是利用限制性內切酶將染色體切成數個片段，根據重疊序列把片段連接成染色體，確定遺片段，根據重疊序列把片段連接成染色體，確定遺傳標志之間物理距離傳標志之間物理距離 堿基對堿基對(bp)(bp)或千堿基或千堿基(kb)(kb)或或兆堿基兆堿基(Mb)(Mb)的圖譜。的圖譜。l轉錄本圖譜：由基因轉錄本轉錄本圖譜：由基因轉錄本mRNAmRNA反轉錄建立反轉錄建立cDNAcDNA文文庫，通過庫，通過cDNAcDNA克隆測序得到基因組的表達序列圖譜?？寺?/p>

8、測序得到基因組的表達序列圖譜。2021/6/16中英聯合實驗室8基本概念l比較基因組學：比較基因組學：l在基因組圖譜和測序基礎之上，對已知的基因和基在基因組圖譜和測序基礎之上，對已知的基因和基因組結構進行比較，了解基因的功能、表達機理和因組結構進行比較，了解基因的功能、表達機理和物種的進化的學科。物種的進化的學科。l比較分析比較分析7 7種生物的基因組，結果表明：在進化上，古細種生物的基因組，結果表明：在進化上，古細菌、真菌和真核生物有一個共同的具有自養(yǎng)能力的最近菌、真菌和真核生物有一個共同的具有自養(yǎng)能力的最近祖先。祖先。 2021/6/16中英聯合實驗室9基本概念l功能基因組學功能基因組學l

9、后基因組學后基因組學(Post genomics)(Post genomics)，利用結構基因組，利用結構基因組學提供的信息和產物，通過在基因組系統(tǒng)水平上學提供的信息和產物，通過在基因組系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能。全面分析基因的功能。l基因功能發(fā)現、基因表達分析、突變檢測、基因基因功能發(fā)現、基因表達分析、突變檢測、基因組的表達與調控研究。組的表達與調控研究。l單一基因單一基因-蛋白質蛋白質 基因組基因組-蛋白質組，系蛋白質組，系統(tǒng)研究。統(tǒng)研究。l對成千上萬的基因表達進行分析和比較，從基因對成千上萬的基因表達進行分析和比較，從基因組組整體整體水平上對基因的活動規(guī)律進行闡述。水平上對基因的活動規(guī)

10、律進行闡述。l一個細胞的轉錄表達水平能夠精確特異地反映類一個細胞的轉錄表達水平能夠精確特異地反映類型、發(fā)育階段以及狀態(tài)。型、發(fā)育階段以及狀態(tài)。 2021/6/16中英聯合實驗室10細胞總 DNA細胞總 RNA輸卵管細胞成紅細胞胰島細胞輸卵管細胞成紅細胞胰島細胞卵清蛋白基因 +- - -珠蛋白基因 +- -+- -胰島素基因 +- - -+實驗方法 Southern 雜交 Northern 雜交2021/6/16中英聯合實驗室11基本概念l藥物基因組學藥物基因組學：l根據不同個體間的基因組差異與基因多態(tài)性，闡明個體間在藥物代謝和效應方面發(fā)生差別的遺傳基礎。l不同的個體間藥物的療效和副作用存在差異

11、。l促使新藥的發(fā)現。l根據個體的遺傳背景來優(yōu)化藥物治療方案，即“個體化治療”。2021/6/16中英聯合實驗室12基本概念l營養(yǎng)基因組學營養(yǎng)基因組學：l研究對人類營養(yǎng)有重要作用的植物研究對人類營養(yǎng)有重要作用的植物次級代謝次級代謝途徑的途徑的相關基因。相關基因。l與鐵吸收轉運有關的基因與鐵吸收轉運有關的基因l與生物素、維生素與生物素、維生素B1B1和維生素和維生素E E合成有關酶的基因合成有關酶的基因2021/6/16中英聯合實驗室13基本概念l生物信息學生物信息學：l以計算機為工具，用數學和信息科學的觀點、理論和方法去以計算機為工具，用數學和信息科學的觀點、理論和方法去研究生命現象，對生物信息

12、進行儲存、檢索和分析的科學。研究生命現象，對生物信息進行儲存、檢索和分析的科學。l以基因組以基因組DNADNA序列信息分析作為源頭，破譯隱藏在序列信息分析作為源頭，破譯隱藏在DNADNA序列中序列中的遺傳語言發(fā)現新的基因和新的功能的遺傳語言發(fā)現新的基因和新的功能 ，進行蛋白質空間結，進行蛋白質空間結構模擬和預測。構模擬和預測。l認識生命的起源、進化、遺傳和發(fā)育的本質。認識生命的起源、進化、遺傳和發(fā)育的本質。l揭示人體生理和病理過程的分子基礎，為人類疾病的預測、揭示人體生理和病理過程的分子基礎，為人類疾病的預測、診斷、預防和治療提供合理有效的方法。診斷、預防和治療提供合理有效的方法。l依據特定蛋

13、白質的功能進行必要的藥物設計依據特定蛋白質的功能進行必要的藥物設計l2021/6/16中英聯合實驗室14基本概念l蛋白質組學蛋白質組學：l蛋白質組蛋白質組(Proteome)(Proteome)：在一種細胞內存在的全部蛋：在一種細胞內存在的全部蛋白質。白質。l蛋白質組學：研究細胞內所有蛋白質及其動態(tài)變化蛋白質組學：研究細胞內所有蛋白質及其動態(tài)變化規(guī)律的科學。規(guī)律的科學。l功能蛋白質組功能蛋白質組(Functional Proteome)(Functional Proteome)：在特定時：在特定時間、特定環(huán)境和實驗條件下基因組活躍表達的蛋白間、特定環(huán)境和實驗條件下基因組活躍表達的蛋白質。功能蛋

14、白質組是總蛋白質組的一部分。蛋白質質。功能蛋白質組是總蛋白質組的一部分。蛋白質組和功能蛋白質組是生命科學的新的研究內容。組和功能蛋白質組是生命科學的新的研究內容。2021/6/16中英聯合實驗室15基因組計劃基因組計劃l模式微生物基因組計劃模式微生物基因組計劃l模式植物基因組計劃模式植物基因組計劃l模式動物基因組計劃模式動物基因組計劃l人類基因組計劃人類基因組計劃2021/6/16中英聯合實驗室16 基因組計劃基因組計劃 ？l獲得全基因組序列：獲得全基因組序列：為基因組的全面測序提為基因組的全面測序提供工作框架供工作框架l構建基因組圖：在長鏈構建基因組圖：在長鏈DNA分子上尋找特征分子上尋找特

15、征性標記，根據分子標記將包括這些序列的克性標記，根據分子標記將包括這些序列的克隆進行連鎖定位，繪制基因組圖。隆進行連鎖定位，繪制基因組圖。l根據基因組圖，基因組區(qū)段分解、逐個測序，根據基因組圖，基因組區(qū)段分解、逐個測序，最后進行組裝最后進行組裝2021/6/16中英聯合實驗室17l重疊群法重疊群法：contig，指相互間存在重疊順序的，指相互間存在重疊順序的一組克隆。根據重疊順序的相對位置將各個克一組克隆。根據重疊順序的相對位置將各個克隆首尾連接，覆蓋的物理長度可達百萬級堿基隆首尾連接，覆蓋的物理長度可達百萬級堿基對。在單個的重疊群中，采用鳥槍法測序，然對。在單個的重疊群中，采用鳥槍法測序，然

16、后在重疊群內進行組裝。后在重疊群內進行組裝。由上至下由上至下。l直接鳥槍法直接鳥槍法：首先進行全基因組鳥槍法：首先進行全基因組鳥槍法測序測序，再以基因組圖的再以基因組圖的分子標記分子標記為起點，將鳥槍法為起點，將鳥槍法DNA片段進行片段進行組裝組裝。根據高密度的基因組圖分。根據高密度的基因組圖分子標記，檢測組裝片段是否處在正確的位置，子標記，檢測組裝片段是否處在正確的位置，校正因重復順序的干擾產生的序列誤排。由下校正因重復順序的干擾產生的序列誤排。由下至上至上2021/6/16中英聯合實驗室182021/6/16中英聯合實驗室19 基因組作圖的方法l遺傳作圖遺傳作圖l物理作圖物理作圖l序列作圖

17、序列作圖l基因作圖基因作圖2021/6/16中英聯合實驗室20基因組學（genomes）l基因組圖基因組圖l遺傳作圖（遺傳作圖（genetic mapping）：采用遺傳）：采用遺傳學分析方法（雜交實驗和家系分析），將基學分析方法（雜交實驗和家系分析），將基因或其他因或其他DNA順序標定在染色體上，構建連順序標定在染色體上，構建連鎖圖。遺傳圖距單位為厘摩（鎖圖。遺傳圖距單位為厘摩（cM），每單位），每單位厘摩定義為厘摩定義為1%交換率。交換率。l物理作圖（物理作圖（ phisical mapping ）：采用分）：采用分子生物學技術，直接將子生物學技術，直接將DNA分子標記、基因分子標記、基因

18、或克隆標定在基因組實際位置。限制性片段或克隆標定在基因組實際位置。限制性片段作圖與克隆作圖的圖距單位為堿基對。作圖與克隆作圖的圖距單位為堿基對。2021/6/16中英聯合實驗室21第二章第二章 遺傳作圖遺傳作圖1.基因組作圖的方法基因組作圖的方法2.遺傳作圖中使用的標記遺傳作圖中使用的標記3.遺傳作圖的方法遺傳作圖的方法2021/6/16中英聯合實驗室222.1 基因組作圖的方法l遺傳圖譜遺傳圖譜( (genetic map)genetic map)又稱又稱連鎖圖譜連鎖圖譜( (linkage map)linkage map)或遺傳或遺傳連鎖圖譜連鎖圖譜( (genetic linkage m

19、ap)genetic linkage map)：指基因組內基因和專一：指基因組內基因和專一的多態(tài)性的多態(tài)性DNADNA標記標記( (marker)marker)相對位置的圖譜相對位置的圖譜l遺傳作圖遺傳作圖(genetic mapping)(genetic mapping)：采用遺傳學分析方法將基因：采用遺傳學分析方法將基因或其它或其它DNADNA順序標定在染色體上構建成連鎖圖順序標定在染色體上構建成連鎖圖l遺傳圖譜表明基因之間連鎖關系和相對距離遺傳圖譜表明基因之間連鎖關系和相對距離, ,早期早期 繪制繪制的經典遺傳圖譜的單位是重組率，的經典遺傳圖譜的單位是重組率，1%1%的重組率為的重組率為

20、1 1個遺個遺傳單位。現代遺傳圖譜的單位為厘摩傳單位?，F代遺傳圖譜的單位為厘摩( (centi Morgancenti Morgan，cM)cM)，1cM1cM相當于相當于1%1%的重組率，約為的重組率，約為1 000 0001 000 000個堿基對個堿基對( (base base pairspairs，bp)bp)2021/6/16中英聯合實驗室232.1 基因組作圖的方法l通過遺傳圖譜，我們可以大致了解各個基因或通過遺傳圖譜，我們可以大致了解各個基因或DNADNA片斷片斷之間的相對距離與方向，如哪個基因更靠近著絲粒，那個之間的相對距離與方向，如哪個基因更靠近著絲粒，那個更靠近端粒等更靠近

21、端粒等l遺傳距離是通過遺傳連鎖分析獲得的，使用的遺傳距離是通過遺傳連鎖分析獲得的，使用的DNADNA厘摩厘摩標志越多，越密集，所得到的遺傳連鎖圖的分辨率就越高標志越多，越密集，所得到的遺傳連鎖圖的分辨率就越高l遺傳圖譜不僅是現階段定位基因的重要手段，即使在人類遺傳圖譜不僅是現階段定位基因的重要手段，即使在人類基因組全物理圖譜建立起來之后，它依然是研究人類基因基因組全物理圖譜建立起來之后，它依然是研究人類基因組遺傳與變異的重要手段組遺傳與變異的重要手段2021/6/16中英聯合實驗室242.2遺傳作圖中使用的標記l遺傳標記（遺傳標記（Genetic MarkersGenetic Markers）

22、：）：遺傳圖有特征性遺傳圖有特征性的位置標記，用于表示基因組中特定順序所在的位置標記，用于表示基因組中特定順序所在的位置。這些標記按孟德爾方式遺傳，標記位的位置。這些標記按孟德爾方式遺傳，標記位點應是多態(tài)的點應是多態(tài)的l基因標記基因標記lDNADNA標記標記2021/6/16中英聯合實驗室252.2.1 基因標記l表型（表型（phenotype) phenotype) ：一個遺傳性狀必須以兩種替換形式一個遺傳性狀必須以兩種替換形式或表型存在才能用于遺傳學分析或表型存在才能用于遺傳學分析l等位基因（等位基因（alleleallele）：每種表型是由不同的等位基因控制每種表型是由不同的等位基因控制

23、l肉眼分辨的表型：肉眼分辨的表型：顏色、形狀等。如用于果蠅遺傳圖的顏色、形狀等。如用于果蠅遺傳圖的構建構建l生化表型：生化表型：微生物遺傳學研究微生物遺傳學研究2021/6/16中英聯合實驗室262.2.1 基因標記l人類的生化性狀人類的生化性狀lABOABO血型血型lHLAHLA（人類白細胞抗原）人類白細胞抗原）l復等位基因（復等位基因（multiple allelesmultiple alleles）：人類白細胞人類白細胞抗原（抗原（HLAHLA）是最復雜最具多態(tài)性的體系，位是最復雜最具多態(tài)性的體系，位于于6 6 號染色體號染色體lHLA-DRBIHLA-DRBI（human leukoc

24、yte antigens-DRBIhuman leukocyte antigens-DRBI）基因位基因位點至少有點至少有5959個等位基因個等位基因lHLA-BHLA-B抗原編碼位點有抗原編碼位點有6060多個等位基因多個等位基因2021/6/16中英聯合實驗室27ABO 血型基因座上具有編碼不同半乳糖轉移酶復等位基因血型基因座上具有編碼不同半乳糖轉移酶復等位基因其特異性決定了血型的差別其特異性決定了血型的差別2021/6/16中英聯合實驗室282.2.2 DNA（分子）標記l基因標記：有用、有效，并非理想?；驑擞洠河杏谩⒂行?，并非理想。l高等生物，可用作標記的基因十分有限高等生物，可用作

25、標記的基因十分有限l許多性狀都涉及多基因。許多性狀都涉及多基因。l高等生物基因組中存在大量的基因間隔區(qū)，用基因高等生物基因組中存在大量的基因間隔區(qū)，用基因標記將在遺傳圖中留下大片的標記將在遺傳圖中留下大片的無標記無標記區(qū)段。區(qū)段。l并非所有等位基因可以通過常規(guī)實驗予以區(qū)分，因并非所有等位基因可以通過常規(guī)實驗予以區(qū)分，因而是而是l產生的遺傳圖不完整，產生的遺傳圖不完整，必須必須尋找其他更有效的尋找其他更有效的標記標記2021/6/16中英聯合實驗室292.2.2 DNA（分子）標記l限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length restrict

26、ion fragment length polymorphisms,RFLPpolymorphisms,RFLP）l簡單序列長度多態(tài)性簡單序列長度多態(tài)性（simple sequenece length simple sequenece length polymorphisrns,SSLPs)polymorphisrns,SSLPs)l小衛(wèi)星序列：（小衛(wèi)星序列：（Minisatellite DNAMinisatellite DNA）l微衛(wèi)星序列：（微衛(wèi)星序列：（Microsatellite DNA, MSMicrosatellite DNA, MS）l單核苷酸多態(tài)性標記單核苷酸多態(tài)性標記（sin

27、gle nucleotide polymorphisms,SNPsingle nucleotide polymorphisms,SNP）2021/6/16中英聯合實驗室302.2.3 遺傳作圖中標記的發(fā)展l遺傳標記的發(fā)展：遺傳標記的發(fā)展：l第一代標記第一代標記l 經典的遺傳標記（蛋白質和免疫學的標記）經典的遺傳標記（蛋白質和免疫學的標記）l 70 70年代中后期，限制酶片段長度多態(tài)性（年代中后期，限制酶片段長度多態(tài)性（RFLPRFLP）l第二代標記第二代標記l 85 85年，年，“小衛(wèi)星序列小衛(wèi)星序列 （minisatelliteminisatellite）l 89 89年，年，“微衛(wèi)星序列微

28、衛(wèi)星序列 （microsatellitemicrosatellite）l第三代標記第三代標記l 單核苷酸多態(tài)性標記（單核苷酸多態(tài)性標記（single nucleotidesingle nucleotide polymorphism polymorphism ，SNPSNP）2021/6/16中英聯合實驗室312.2.3 遺傳標記中的第一代標記l經典的遺傳標記（蛋白質和免疫學的標記）經典的遺傳標記（蛋白質和免疫學的標記）lABOABO血型位點標記血型位點標記lHLAHLA位點標記位點標記l存在問題：存在問題：l已知多態(tài)的蛋白質很少已知多態(tài)的蛋白質很少l等位基因的數目有限等位基因的數目有限l無法獲

29、得足夠的信息量無法獲得足夠的信息量l檢測技術的繁瑣等檢測技術的繁瑣等限制了人類基因組的遺傳分析工作限制了人類基因組的遺傳分析工作促使人們直接在促使人們直接在DNADNA上尋找新的遺傳標記上尋找新的遺傳標記2021/6/16中英聯合實驗室322.2.3 遺傳標記中的第一代標記l7070年代發(fā)展起來的年代發(fā)展起來的DNADNA重組技術、重組技術、DNADNA克隆技術和克隆技術和DNADNA探針技術探針技術l為拓展遺傳圖譜的構建途徑創(chuàng)造了技術條件為拓展遺傳圖譜的構建途徑創(chuàng)造了技術條件l使人類基因定位的方法從使人類基因定位的方法從細胞及染色體細胞及染色體水平過渡到水平過渡到分子水平分子水平lDNADN

30、A水平的多態(tài)性標記位點作為繪制現代遺傳圖譜的主要界標，提高水平的多態(tài)性標記位點作為繪制現代遺傳圖譜的主要界標，提高圖譜的圖譜的 精確度、準確性。遺傳圖譜的繪制進入了一個嶄新的時代精確度、準確性。遺傳圖譜的繪制進入了一個嶄新的時代 l現代遺傳圖譜的概念現代遺傳圖譜的概念由由Botstein DBotstein D等等(1980)(1980)首先提出，在此基礎首先提出，在此基礎上，限制性片段長度多態(tài)性（上，限制性片段長度多態(tài)性（RFLPRFLP）作為遺傳圖譜的第一代嶄新作為遺傳圖譜的第一代嶄新標記得以問世標記得以問世 。l限制性位點限制性位點能夠用作基因標記。廣泛應用到基因組研究中。基因或能夠用作

31、基因標記。廣泛應用到基因組研究中。基因或基因組可以用基因組可以用重疊的限制性片段重疊的限制性片段來作圖。最終擴展到整個序列，構來作圖。最終擴展到整個序列，構建連鎖圖譜建連鎖圖譜2021/6/16中英聯合實驗室33l同源染色體同一區(qū)段DNA 序列的差異，l限制酶識別的堿基順序有專一性2021/6/16中英聯合實驗室342.2.3遺傳標記中的第二代標記簡單序列長度多態(tài)性簡單序列長度多態(tài)性 SSLPsl發(fā)現：發(fā)現：l小衛(wèi)星序列小衛(wèi)星序列minisatellite minisatellite （19851985年）年）l微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列microsatellite microsatellite （

32、19891989年）年）lmicrosatellite markermicrosatellite marker又稱簡單串連重復（又稱簡單串連重復（short tandem repeatshort tandem repeat，STRSTR），），最重要的優(yōu)點是高度多態(tài)性，提供的信息量相對很大；另外可用最重要的優(yōu)點是高度多態(tài)性，提供的信息量相對很大；另外可用PCRPCR技術使操作實現自動化，遺傳圖與物理圖研究中非常有用的工具技術使操作實現自動化，遺傳圖與物理圖研究中非常有用的工具l2020世紀世紀8080年代后期年代后期, ,人們開始應用人們開始應用微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列( (microsatell

33、ite,MS)microsatellite,MS)繪制圖繪制圖譜。譜。19941994年底，美、法完成了以年底，美、法完成了以RFLPRFLP及微衛(wèi)星為標志的遺傳及微衛(wèi)星為標志的遺傳圖譜圖譜. .圖譜包含了圖譜包含了58265826位點，覆蓋位點，覆蓋40004000cMcM，分辨率高達分辨率高達0.70.7cMcM19961996年年法國報道了完全以微衛(wèi)星法國報道了完全以微衛(wèi)星DNADNA標志構建的遺傳連鎖圖，包含標志構建的遺傳連鎖圖，包含23352335位位點，分辯率為點，分辯率為1.61.6cMcM2021/6/16中英聯合實驗室352021/6/16中英聯合實驗室362.2.3遺傳標記

34、中的第三代標記單核苷酸多態(tài)性標記（單核苷酸多態(tài)性標記（single nucleotide single nucleotide polymorphismspolymorphisms，SNPsSNPs）l點突變，位于密碼子的搖擺位置，表現為沉默突變而被點突變，位于密碼子的搖擺位置，表現為沉默突變而被大量保留下來。大多數不能被限制酶識別，必須采取測大量保留下來。大多數不能被限制酶識別，必須采取測序或寡聚核苷酸雜交檢測序或寡聚核苷酸雜交檢測l在人類基因組中可達到在人類基因組中可達到300300萬個，平均每萬個，平均每10001000個堿基對個堿基對就有一個就有一個l數目多，覆蓋密度大，它的開發(fā)和應用摒

35、棄了遺傳標記數目多，覆蓋密度大，它的開發(fā)和應用摒棄了遺傳標記分析技術的分析技術的 瓶頸瓶頸 凝膠電泳，為凝膠電泳，為DNADNA芯片技術應用于遺芯片技術應用于遺傳作圖提供了基礎傳作圖提供了基礎2021/6/16中英聯合實驗室372021/6/16中英聯合實驗室382.3 遺傳作圖的方法l連鎖分析是遺傳作圖的基礎：連鎖分析是遺傳作圖的基礎：1905，Bateson，Saunder和和Punnett；1911年年Morgan揭示了連鎖分析的意義揭示了連鎖分析的意義l在同一條染色體上的基因間表現出在同一條染色體上的基因間表現出遺傳連鎖遺傳連鎖(Genetic linkage)，因為它們都是在同一條長

36、的因為它們都是在同一條長的DNA分子上分子上l部分連鎖與重組：部分連鎖與重組：l比利時細胞學家比利時細胞學家Janssens發(fā)現減數分裂時同源染色體的交換發(fā)現減數分裂時同源染色體的交換lSturtevant：2 個彼此靠近的基因之間因交換而分離的頻率，要個彼此靠近的基因之間因交換而分離的頻率，要比相互遠離的比相互遠離的2個基因之間發(fā)生分離的頻率要小個基因之間發(fā)生分離的頻率要小l重組率則可成為測量基因之間相對距離的尺度，只要獲得不同重組率則可成為測量基因之間相對距離的尺度，只要獲得不同基因之間的重組率，就可繪制一份基因位于染色體上相對位置基因之間的重組率，就可繪制一份基因位于染色體上相對位置的地

37、理圖的地理圖2021/6/16中英聯合實驗室392021/6/16中英聯合實驗室40部分連鎖與遺傳作圖l構建遺傳圖譜的基本原理構建遺傳圖譜的基本原理l真核生物遺傳過程中會發(fā)生減數分裂，此過程中染色體要進行重組真核生物遺傳過程中會發(fā)生減數分裂，此過程中染色體要進行重組和交換，這種重組和交換的概率會隨著染色體上任意兩點間相對距和交換，這種重組和交換的概率會隨著染色體上任意兩點間相對距離的遠近而發(fā)生相應的變化。根據概率大小，人們就可以推斷出同離的遠近而發(fā)生相應的變化。根據概率大小，人們就可以推斷出同一條染色體上兩點間的相對距離和位置關系。正因為如此，我們得一條染色體上兩點間的相對距離和位置關系。正因

38、為如此，我們得到的這張圖譜也就只能顯示標記之間的相對距離。我們稱這一距離到的這張圖譜也就只能顯示標記之間的相對距離。我們稱這一距離( (概率概率) )為遺傳距離為遺傳距離( (cM)cM)，由此構建的圖譜也稱為遺傳圖譜。由此構建的圖譜也稱為遺傳圖譜。2021/6/16中英聯合實驗室41連鎖遺傳圖的做法l一般以最左端的基因位置為一般以最左端的基因位置為0，如發(fā)現有新的基因在更左端的位置，如發(fā)現有新的基因在更左端的位置時，把時，把0點讓給新基因，其余的基因座位作相應移動點讓給新基因，其余的基因座位作相應移動l重組率在重組率在0-50%之間，但圖譜上出現之間，但圖譜上出現50以上的圖距。這是由于較以

39、上的圖距。這是由于較遠的兩基因之間發(fā)生偶數次交換，但沒有出現重組類型，所以交換遠的兩基因之間發(fā)生偶數次交換，但沒有出現重組類型，所以交換值要大于重組率。繪制連鎖遺傳圖時，需根據重組率進行圖距的校值要大于重組率。繪制連鎖遺傳圖時，需根據重組率進行圖距的校正正l公式為公式為 RF=1/2(1-e-m) RF為重組率為重組率 m：平均交換數平均交換數 m值說明在兩值說明在兩個基因座之間每次減數分裂有個基因座之間每次減數分裂有8次交換，因每次交換只包括次交換，因每次交換只包括4條染色條染色單體中的兩條非姐妹染色體，所以由單體中的兩條非姐妹染色體，所以由m轉換成的真實圖距應為轉換成的真實圖距應為1/2m

40、2021/6/16中英聯合實驗室42不同模式生物的連鎖分析l有性雜交實驗有性雜交實驗l系譜分析系譜分析lDNA轉移轉移2021/6/16中英聯合實驗室43雜交實驗的連鎖分析l選擇已知基因型的親本，設計雜交方案，獲得交配的子選擇已知基因型的親本，設計雜交方案，獲得交配的子代并分析其表型和基因型代并分析其表型和基因型l對于高等真核生物的常規(guī)連鎖分析并不是直接檢查配子，對于高等真核生物的常規(guī)連鎖分析并不是直接檢查配子，而是檢測分別來自兩個親本配子融合形成的二倍體基因而是檢測分別來自兩個親本配子融合形成的二倍體基因型，即進行遺傳雜交型，即進行遺傳雜交l兩點雜交和多點雜交兩點雜交和多點雜交2021/6/

41、16中英聯合實驗室44系譜分析l系譜分析法即對某家庭性狀相關成員進行系譜分析法即對某家庭性狀相關成員進行 統(tǒng)計，分析統(tǒng)計，分析性狀之間的連鎖關系，通過重組率進行相關基因定位，性狀之間的連鎖關系，通過重組率進行相關基因定位，這種方法又稱這種方法又稱家系分析法家系分析法(pedigree method) l不能進行有計劃的遺傳實驗，只能收集家系成員的相關不能進行有計劃的遺傳實驗，只能收集家系成員的相關資料進行連鎖分析，主要涉及人類和多年生樹木資料進行連鎖分析，主要涉及人類和多年生樹木l優(yōu)勢對數值（優(yōu)勢對數值（lod score）分析：分析：lod值是基因連鎖可能性值是基因連鎖可能性的對數，用于判定

42、所研究的兩個標記是否在同一染色體的對數，用于判定所研究的兩個標記是否在同一染色體上，換句話說就是基因是否連鎖。如果優(yōu)勢對數分析確上，換句話說就是基因是否連鎖。如果優(yōu)勢對數分析確定了連鎖，然后可以提供最可能的重組頻率程度。理想定了連鎖，然后可以提供最可能的重組頻率程度。理想的情況是資料來自不同系譜的情況是資料來自不同系譜2021/6/16中英聯合實驗室45細菌的遺傳作圖l轉化（轉化（ transformation ）：）：供體細胞釋放的一段供體細胞釋放的一段DNA（通常小于通常小于50kb），），經受體細胞攝取后整合到基經受體細胞攝取后整合到基因組中，可借助抗性培養(yǎng)基篩選重組克隆因組中，可借助抗

43、性培養(yǎng)基篩選重組克隆l轉導（轉導（transduction)：通過噬菌體將小片段通過噬菌體將小片段DNA從從供體細胞轉移到受體細胞供體細胞轉移到受體細胞l接合轉移接合轉移(conjugation)：兩個細菌形成物理接觸，兩個細菌形成物理接觸，DNA從供體轉移到受體從供體轉移到受體2021/6/16中英聯合實驗室46細菌的遺傳重組細菌的遺傳重組2021/6/16中英聯合實驗室47l細菌遺傳作圖中采用的都是細菌遺傳作圖中采用的都是生化標記生化標記（如合成色氨酸的（如合成色氨酸的能力、對抗生素的敏感性等），隱性表型（如不能合成能力、對抗生素的敏感性等），隱性表型（如不能合成色氨酸）是可以互補的性狀。

44、色氨酸）是可以互補的性狀。l基因轉移在具有基因轉移在具有野生野生型等位基因的型等位基因的供體供體品系與具有品系與具有隱性隱性等位基因的等位基因的受體受體品系之間進行，根據受體細胞是否獲得品系之間進行，根據受體細胞是否獲得基因指令的生化功能來監(jiān)測轉移的基因指令的生化功能來監(jiān)測轉移的DNA是否進入受體細是否進入受體細胞胞l接合：根據野生型基因進入受體的時間表，可以確定基接合：根據野生型基因進入受體的時間表，可以確定基因所在的位置因所在的位置l轉導及轉化：依據所研究的基因是否同時出現在受體細轉導及轉化：依據所研究的基因是否同時出現在受體細胞中，緊密連鎖的基因總是有最高的機率被同時轉移。胞中，緊密連鎖

45、的基因總是有最高的機率被同時轉移。2021/6/16中英聯合實驗室48RFLP連鎖圖lRFLP是第一種用于研究的是第一種用于研究的DNA標記（標記（David Bostein，1980）l基本設想：基本設想：由于同源染色體同一區(qū)段由于同源染色體同一區(qū)段DNA順序的差異，順序的差異，用限制酶消化時，會得到長度各不相同的限制性片段。用限制酶消化時，會得到長度各不相同的限制性片段。經過瓊脂糖凝膠電泳分離，可直接顯示不同個體同一位經過瓊脂糖凝膠電泳分離，可直接顯示不同個體同一位點點DNA組成的差異組成的差異l由于限制酶的專一性，用不同的限制酶處理同一由于限制酶的專一性，用不同的限制酶處理同一DNA樣樣

46、品時，可以產生與之對應的不同限制性片斷，從而提供品時，可以產生與之對應的不同限制性片斷，從而提供大量位點多態(tài)性信息大量位點多態(tài)性信息2021/6/16中英聯合實驗室49DNA限制酶分析限制酶分析2021/6/16中英聯合實驗室50l親本：親本：A1/B1和和A2/B2，個體，個體231；新組合：；新組合：A1/B2和和A2/B1，個體，個體39l交換率：交換率：39/（231+39）=14%；A與與B相距相距14cM2021/6/16中英聯合實驗室51RFLP連鎖圖l我們直接檢驗由限制圖譜獲得的基因型，而不是檢測其表型的特點l左圖表示三個世代限制圖譜之間的血緣關系，其限制片段長限制片段長度多態(tài)

47、性度多態(tài)性(RFLP)可以按孟德爾方式遺傳，四種等位基因在每代中獨立地分離，但圖中經限制酶消化后所有等位基因之間的組合在凝膠電泳中都存在2021/6/16中英聯合實驗室52基因與分子標記的共分離l共分離：共分離：如果限制酶多態(tài)性在基因組中自由發(fā)生，則有如果限制酶多態(tài)性在基因組中自由發(fā)生，則有些會在特定基因附近產生。我們可以確定這樣的限制性些會在特定基因附近產生。我們可以確定這樣的限制性標記，因為該標記與突變表型密切相關。如果比較患病標記，因為該標記與突變表型密切相關。如果比較患病者的和正常人的者的和正常人的DNA DNA 限制圖譜，可能發(fā)現一個特定的限制圖譜，可能發(fā)現一個特定的限制性位點通常出

48、現限制性位點通常出現( (或者丟失或者丟失) )在患者在患者DNA DNA 中，原因是中，原因是限制性標記與表型間限制性標記與表型間100%100%相關。它暗示限制性標記與相關。它暗示限制性標記與突變基因距離很緊，以至于它們在重組中不能分離突變基因距離很緊，以至于它們在重組中不能分離2021/6/16中英聯合實驗室53簡單序列長度多態(tài)性簡單序列長度多態(tài)性l小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNADNA的核心序列一般為幾個到幾十個核苷酸，不同個體的核心序列一般為幾個到幾十個核苷酸，不同個體的不同基因座位重復次數不同的不同基因座位重復次數不同 ，每個重復單位的組成可略有變異。，每個重復單位的組成可略有變異。這類重復單位

49、數目分布有限，有些染色體上還未發(fā)現這類這類重復單位數目分布有限，有些染色體上還未發(fā)現這類 小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNADNA。它的位置一般在染色體端粒部位。亦已證明，這一序列廣它的位置一般在染色體端粒部位。亦已證明，這一序列廣泛存在于人體基因組中泛存在于人體基因組中2021/6/16中英聯合實驗室542021/6/16中英聯合實驗室552.4 人類遺傳圖l人類基因組計劃的最初目標人類基因組計劃的最初目標-完成一份遺完成一份遺傳圖，其密度至少為每傳圖，其密度至少為每1000kb 一個標記一個標記l1994年完成，密度達到年完成，密度達到600kb一個標記一個標記l含有含有5264個微衛(wèi)星序列個微衛(wèi)星序列l(wèi)

50、不久，另一份物理圖也隨之問世，其密度不久，另一份物理圖也隨之問世，其密度為每為每100kb一個標記一個標記l含有含有7000個微衛(wèi)星序列個微衛(wèi)星序列2021/6/16中英聯合實驗室56第三章 物理作圖l限制酶作圖限制酶作圖l基于克隆的基因組作圖基于克隆的基因組作圖l熒光原位雜交（熒光原位雜交（FISH）l序列標記位點（序列標記位點（STS)l人類基因組物理圖人類基因組物理圖2021/6/16中英聯合實驗室57l遺傳圖的分辨率有限：基因組大，人類及遺傳圖的分辨率有限：基因組大，人類及大多數高等真核生物不可能獲得大量的子大多數高等真核生物不可能獲得大量的子代代l遺傳圖的精確性低：重組熱點遺傳圖的精

51、確性低：重組熱點2021/6/16中英聯合實驗室583.1 限制性作圖l比較不同限制酶產生的比較不同限制酶產生的DNA片段的大小片段的大小l單酶切、雙酶切、對比組裝單酶切、雙酶切、對比組裝l部分酶切：多個相同酶切位點區(qū)段只發(fā)生一部分酶切：多個相同酶切位點區(qū)段只發(fā)生一次酶切次酶切l(wèi)末端同位素標記（或其他標記）結合部分酶末端同位素標記（或其他標記）結合部分酶切：形成梯形分布帶切：形成梯形分布帶2021/6/16中英聯合實驗室59l樣品中僅存在較少的限制性位點樣品中僅存在較少的限制性位點/小分子量小分子量DNA分子，用常規(guī)的限制酶即可繪制物理圖分子，用常規(guī)的限制酶即可繪制物理圖l稀有切點限制酶稀有切

52、點限制酶2021/6/16中英聯合實驗室60l稀有切點限制酶稀有切點限制酶l特殊的凝膠電泳技術：脈沖凝膠電泳特殊的凝膠電泳技術：脈沖凝膠電泳PFGE（電場方（電場方向不斷變換）向不斷變換）2021/6/16中英聯合實驗室612021/6/16中英聯合實驗室623.2 基于克隆的基因組作圖基于克隆的基因組作圖3.2.1 載體載體l質粒、噬菌體、粘粒質粒、噬菌體、粘粒l啤酒酵母基因組主要是先構建粘粒文庫，啤酒酵母基因組主要是先構建粘粒文庫，然后建立克隆重疊群完成測序然后建立克隆重疊群完成測序l高等生物基因組高等生物基因組l擬南芥擬南芥1.2X105bp，需要，需要25000個克隆個克隆l人類基因組

53、是擬南芥基因組的人類基因組是擬南芥基因組的33倍倍2021/6/16中英聯合實驗室63l大分子大分子DNA的克隆載體的克隆載體l酵母人工染色體酵母人工染色體YAC：重組：重組YAC分子只能在分子只能在酵母細胞中擴增酵母細胞中擴增l著絲粒：在細胞分裂時負責染色體均等分配著絲粒：在細胞分裂時負責染色體均等分配l端粒：位于染色體端部的特異序列，保持人工染端粒：位于染色體端部的特異序列，保持人工染色體的穩(wěn)定性色體的穩(wěn)定性l自主復制起始點：在細胞中啟動染色體的復制自主復制起始點：在細胞中啟動染色體的復制2021/6/16中英聯合實驗室642021/6/16中英聯合實驗室65l缺陷：插入子穩(wěn)定性問題、同一

54、酵母細胞多個缺陷：插入子穩(wěn)定性問題、同一酵母細胞多個YAC引起交換產生嵌合引起交換產生嵌合l噬菌體噬菌體P1載體：與載體：與載體相似，將天然噬菌體載體相似，將天然噬菌體基因組中的一段區(qū)域缺失，容量達基因組中的一段區(qū)域缺失，容量達125kbl細菌人工染色體細菌人工染色體BAC：由大腸桿菌中：由大腸桿菌中F質粒衍質粒衍生，容量達生，容量達300kb，單拷貝復制，穩(wěn)定，不會，單拷貝復制，穩(wěn)定，不會因重組發(fā)生嵌合因重組發(fā)生嵌合lP1人工染色體人工染色體PAC：結合：結合P1載體和載體和BAC載體的載體的優(yōu)點優(yōu)點2021/6/16中英聯合實驗室662021/6/16中英聯合實驗室672021/6/16中

55、英聯合實驗室68質粒*受體細胞受體細胞結構結構插入片斷插入片斷舉例舉例 E.coli環(huán)狀 8*pUC18/19 , T-載體pGEM- 3z等 噬菌體E.coli線狀9 - 24kbEMBL系列， gt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀 10 kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)E.coli環(huán)狀300 kbPel oBAC系列PAC (P1-derived Artificial chromosome)E.coli環(huán)狀100

56、- 2000 kbPCYPAC1YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母細胞線性染色體100 - 2000 kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳類細胞線性染色體 1000 kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40 載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質粒，PBV,Ti質粒載體的種類和特征載體的種類和特征2021/6/16中英聯合實驗室693.2.2 重疊群組建重疊群組建l重疊群重疊群contigcontig：相互間存在重疊順序的一：相互間存在重疊順序的一組克隆。組克隆。l最早組建重疊群方法最早組建重疊群

57、方法染色體步移染色體步移：從基：從基因組文庫中挑取一個指定的或隨機的克隆，因組文庫中挑取一個指定的或隨機的克隆，然后在文庫中尋找與之重疊的第二個克隆。然后在文庫中尋找與之重疊的第二個克隆。在此基礎上再尋找第三個克隆，依次延伸在此基礎上再尋找第三個克隆，依次延伸l染色體步移的速度緩慢，僅適合于小基因組染色體步移的速度緩慢，僅適合于小基因組及小區(qū)段染色體的物理圖繪制及小區(qū)段染色體的物理圖繪制2021/6/16中英聯合實驗室702021/6/16中英聯合實驗室71l指紋作圖指紋作圖l指紋指紋fingerprinting：DNA樣品所具有的特定樣品所具有的特定DNA片片段段組成，限定的組成，限定的序列

58、特征序列特征。指紋重疊，表明。指紋重疊，表明2個克隆具個克隆具有共同的區(qū)段有共同的區(qū)段l限制性帶型指紋：用不同限制性酶處理樣品，凝膠分限制性帶型指紋：用不同限制性酶處理樣品，凝膠分析，析，DNA條帶有部分相同，說明它們含有重疊的序列條帶有部分相同，說明它們含有重疊的序列l(wèi)重復序列重復序列DNA指紋：不同克隆酶解電泳，轉移到雜交指紋：不同克隆酶解電泳，轉移到雜交膜中，用一種或幾種基因組范圍的重復序列作為膜中，用一種或幾種基因組范圍的重復序列作為探針探針雜交雜交，出現相同的雜交帶型，說明重疊，出現相同的雜交帶型，說明重疊l重復序列重復序列DNA PCR：設計與重復序列互補的引物，對：設計與重復序列

59、互補的引物，對檢測的克隆進行檢測的克隆進行PCR擴增，相同的產物，說明重疊擴增，相同的產物，說明重疊lSTS目錄作圖：目錄作圖：STS是已知的單一序列。設計引物，是已知的單一序列。設計引物，對大量的單個克隆進行對大量的單個克隆進行PCR擴增擴增2021/6/16中英聯合實驗室722021/6/16中英聯合實驗室733.3 熒光標記原位雜交熒光標記原位雜交lFISH：與同位素雜交的原理相同，：與同位素雜交的原理相同，DNA熒光染熒光染料。熒光標記信號在顯微鏡下觀測，直接顯示料。熒光標記信號在顯微鏡下觀測，直接顯示探針與染色體雜交的位置探針與染色體雜交的位置l雜交技術的一種延伸，雜交靶子是完整的染

60、色體，雜交技術的一種延伸，雜交靶子是完整的染色體，由雜交信號提供作圖信息。將樣品涂抹在載玻片上由雜交信號提供作圖信息。將樣品涂抹在載玻片上自然干燥，然后用甲酰胺處理使其變性。自然干燥，然后用甲酰胺處理使其變性。l中期染色體：主要用于確定新發(fā)現的分子標記屬于中期染色體：主要用于確定新發(fā)現的分子標記屬于哪條染色體，給出十分粗略的染色體定位哪條染色體，給出十分粗略的染色體定位l機械伸展的染色體：分離與制備中期細胞核，離心，機械伸展的染色體：分離與制備中期細胞核，離心，獲得伸展的染色體，長度增加獲得伸展的染色體，長度增加20倍。倍。l間期染色體：已獲得基本的位置信息，極度松馳的間期染色體：已獲得基本的