第七章 高等動物基因1 哺乳動物表達系統(tǒng)

1、 陳武陳武cwy_生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院8n 基因治療n 轉(zhuǎn)基因動物與動物反應(yīng)器n 哺乳動物表達系統(tǒng)n 高等動物基因工程的基本概念第七章第七章 高等動物基因工程高等動物基因工程第一節(jié)第一節(jié) 高等動物基因工程的基本概念高等動物基因工程的基本概念高等動物基因工程高等動物基因工程哺乳動物細胞表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)高等動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)高等動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物個體轉(zhuǎn)基因動物個體動物工程細胞動物工程細胞n哺乳動物品種改良n疾病模型用于藥物篩選研究n基因治療n蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)n藥物篩選研究評價模型D 哺乳動物表達系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移方法第二節(jié)第二節(jié) 哺乳動物表達系統(tǒng)哺乳動物表達

2、系統(tǒng)C 哺乳動物表達系統(tǒng)的載體系統(tǒng)B 哺乳動物表達系統(tǒng)的受體系統(tǒng)A 哺乳動物表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點E 提高哺乳動物細胞表達重組蛋白的方法及應(yīng)用優(yōu)點：表達的蛋白優(yōu)點：表達的蛋白與天然蛋白在結(jié)構(gòu)、糖基化、磷酸化、寡聚體類型和方式上幾乎相同，且能正確組裝成多亞基蛋白。如EPO（促紅細胞生成素）缺點：哺乳動物細胞的表達水平低； 獲得高表達細胞株所需的時間長； 細胞大規(guī)模培養(yǎng)的成本高； 哺乳動物細胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)類藥物的成本較高； （一）哺乳動物細胞表達系統(tǒng)優(yōu)缺點：優(yōu)缺點：哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的構(gòu)成哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的構(gòu)成受體系統(tǒng)載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)（1）正常的哺乳類動物細胞具有四大生物學(xué)特征: （二

3、）哺乳動物宿主系統(tǒng)（二）哺乳動物宿主系統(tǒng)錨地依賴性錨地依賴性：細胞必須附在固體上或固定的表面才能：細胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂生長分裂血清依賴性血清依賴性：細胞必須具有生長因子才能生長：細胞必須具有生長因子才能生長接觸抑制性接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，生長便受到抑制：細胞與細胞接觸后，生長便受到抑制形態(tài)依賴性形態(tài)依賴性：細胞扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：細胞扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（2 2）高效表達外源基因受體細胞高效表達外源基因受體細胞應(yīng)具備下列條件：應(yīng)具備下列條件：細胞系特征細胞系特征 喪失細胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大規(guī)喪失細胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大規(guī)

4、模培養(yǎng)模培養(yǎng)合適的標(biāo)記合適的標(biāo)記 便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定性 外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存生長快且齊生長快且齊 分裂周期短，生長均一，便于控制分裂周期短，生長均一，便于控制安全性能好安全性能好 不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌(3) 常用的高等哺乳動物受體細胞常用的高等哺乳動物受體細胞1. 迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動物受體細胞主要是中國倉鼠卵巢細胞（CHO）其優(yōu)勢有如下幾個方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確

5、基因轉(zhuǎn)移和載體表達系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國FDA確認為安全的基因工程受體細胞（GRAS）2. 1981年，Gluzman用編碼野生型T抗原但復(fù)制起點缺失的SV40，轉(zhuǎn)化允許SV40裂解性生長的非洲綠猴腎細胞CV-1，獲得了三個細胞系：COS1、COS3、COS7。這三個細胞系均含有T抗原，保留完全的允許SV40裂解性生長的能力（被廣泛地用于瞬時表達系統(tǒng)）。 T抗原作用：當(dāng)表達產(chǎn)生的T抗原結(jié)合到SV40的復(fù)制點的DNA調(diào)控區(qū)，病毒DNA的復(fù)制即被啟動。 思考：COS細胞作宿主細胞表達的優(yōu)勢？3. BHK-21：1961年從地鼠幼鼠的腎臟分離而來成果：用它表達的重組凝血因子VIII

6、已獲準(zhǔn)投放市場。4. C127細胞：來自RIII小鼠乳腺腫瘤細胞，特別適用于帶有牛乳頭瘤病毒（BPV）載體的轉(zhuǎn)染：用C127細胞生產(chǎn)的重組人生長激素（hGH）已獲準(zhǔn)投放市場，用于治療生長激素缺乏癥。5. MDCK細胞：1958年從成年雌性的西班牙長耳狗的腎臟分離獲得的，是貼壁生長的上皮樣細胞：有報道用該細胞結(jié)合人巨細胞病毒早早期啟動子可高效表達分泌蛋白，表達量占細胞分泌蛋白質(zhì)總量的15%20%。(4) 高等哺乳動物受體細胞的遺傳標(biāo)記高等哺乳動物受體細胞的遺傳標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP次黃嘌呤（H）G

7、MPAMP）尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途徑嘧啶核苷酸生物合成途徑次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK）氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）從頭合成途徑補救合成途徑氨基喋呤（AP）二氫葉酸還原酶（二氫葉酸還原酶（DHRDHR）黃嘌呤黃嘌呤- -鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（XGPRTXGPRT）高等哺乳動物受體細胞的遺傳標(biāo)記高等哺乳動物受體細胞的遺傳標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的（tk -）受體細胞不能在含有次黃嘌呤、氨基喋呤、胸

8、腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的不能在含有次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補（hprt -）受體細胞高等哺乳動物受體細胞的遺傳標(biāo)記高等哺乳動物受體細胞的遺傳標(biāo)記哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標(biāo)記哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標(biāo)記遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機理APH 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 G418APH滅活G418DHFR- 二氫葉酸還原酶 氨甲喋呤DHFR變體抗氨甲喋呤 HPH- 潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素BHPH滅活潮霉素B TK-

9、 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK合成TMPXGPRT- 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMPADA- 腺嘌呤核苷脫氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA滅活Xyl-A (1)哺乳動物細胞表達載體應(yīng)具備的條件： 基本的元件：增強子、終止信號和poly(A)信號、多克隆位點、剪接信號、篩選標(biāo)記等； 易于擴增至足夠數(shù)量，能夠在哺乳動物細胞內(nèi)穩(wěn)定存在、不丟失：哺乳動物細胞無天然質(zhì)粒； 能夠在哺乳動物細胞內(nèi)高效表達的強啟動子：一般細胞不過量表達蛋白（1）病毒類載體）病毒類載體人腺病毒人腺病毒DNA猴空泡病毒猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒人牛痘病

10、毒DNA1. 人腺病毒人腺病毒DNA 腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒腺病毒的生物學(xué)特性有6個亞屬，其中常用來構(gòu)建載體的主要是C亞屬的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。 腺病毒感染人細胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。201.1.腺病毒結(jié)構(gòu)腺病毒結(jié)構(gòu)腺病毒感染細胞過程腺病毒感染細胞過程人腺病毒人腺病毒DNA腺病毒的基因組DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5 腺病毒基因組DNA全長36 kb，其包裝上限為原基因組的105%， DNA兩端各有

11、一個反向重復(fù)序列（ITR）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的表達調(diào)控有關(guān)，其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子， L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因；IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。E3區(qū)缺失只會影響病毒顆粒的成熟，不影響基因組的復(fù)制功能，因而在構(gòu)建載體時往往除去這個2.2 kb的片段，使得載體的裝載量提高到4 kb以上。重組腺病毒表達載體構(gòu)建原理重組腺病毒表達載體構(gòu)建原理1) 1) 腺病毒載體腺病毒載體2)2)轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)移載體3)3)構(gòu)建重組腺病構(gòu)建重組腺病毒表達載體毒表達載體( (續(xù)續(xù)) )人腺病毒人腺病毒DNA基因重排低 外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)

12、定復(fù)制幾個周期腺病毒DNA載體的特點安全性能好 不整合人的染色體DNA，不會導(dǎo)致惡性腫瘤宿主范圍廣 對受體細胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格使用效果好 外源基因在載體上容易高效表達2. 猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA（SV40） SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNASV40的生物學(xué)特性SV40可以與所有哺乳動物宿主細胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。 SV40感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA（S

13、V40）SV40的基因組DNA t / T基因編碼病毒的小抗原和大SV40 DNAoriVP2TVP3VP1t抗原與病毒的致癌作用密切相關(guān) SV40在裂解宿主細胞前的晚期狀態(tài)時，每個宿主細胞含有105個病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達外源蛋白猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40 DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建 重組的SV40 DNA分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。Aproriviral genegptS

14、V40 oripV2-GPTpBR322pBR322SV40 pV2-GPT是一種SV40 DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其中g(shù)pt為細菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細胞中表達有生物活性的兔b-珠蛋白.猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA（SV40）利用SV40 DNA載體表達外源基因的程序SV40 載體病毒晚期基因啟動子篩選標(biāo)記ori缺陷的SV40 輔助病毒去除細菌序列插入外源基因重組分子分離病毒DNA轉(zhuǎn)化篩選增殖感染猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表達好 外源基因能高效表達SV40 DNA載體的特點基因重排高 病毒基因組和重組分子常發(fā)生

15、重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄 只能轉(zhuǎn)染猴細胞裝載量較小3. 人乳多瘤病毒人乳多瘤病毒DNA（BKV） 人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細胞后基因不發(fā)生整合，獨立于染色體而自人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性主復(fù)制，每個宿主細胞最高可達500個拷貝。人乳多瘤病毒人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒表達載體的構(gòu)建BKV - E.coli 穿梭載體穿梭載體BKV oriBKV geneDREMMTPAp rE.coli oriSV40 PNeo r刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成穿梭載體，它不能整合，同時也不能形成成熟的病毒顆粒

16、裂解受體細胞。安裝細胞色素P450 dioxin介導(dǎo)的增強子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動子MMTP，由其帶動外源基因的表達。SV40來源的啟動子控制Neor 標(biāo)記基因，以G418篩選重組子。以此載體在人細胞系中表達b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。4. 人牛痘病毒人牛痘病毒DNA 人牛痘病毒是一個大型DNA病毒，基因組長185 kb，能在宿主細胞質(zhì)中自主復(fù)制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建人牛痘病毒的生物學(xué)特性出的重組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的病毒啟動子的控制下高效表達。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外DNA重組很困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進

17、行。人牛痘病毒人牛痘病毒DNA 目前廣泛使用的牛痘病毒表達系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒其基因組上插入了一個可表達的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在人牛痘病毒DNA表達載體的構(gòu)建外源基因?qū)胧荏w細胞之前，先以上述的重組病毒感染細胞，使其大量表達T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7啟動子的細菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物受體細胞，此時外源基因整合在受體細胞染色體DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達出重組蛋白。 人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達的。人牛痘病毒人牛痘病毒DNA利用人牛痘病毒載體表達外源基因的程序牛痘病毒啟動子T7 RNA聚合酶基因T7啟動子外源基因細菌重組質(zhì)粒感染

18、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)收集哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細胞的病毒轉(zhuǎn)染法哺乳動物細胞的病毒轉(zhuǎn)染法(1) 哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法 利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細胞的主要優(yōu)點是外源基因表達盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達產(chǎn)物的分離純化減輕了負擔(dān)。但外源基因表達盒進入受體細胞后，往往以多拷貝的形式隨機整合在染色體DNA上，導(dǎo)致受體細胞基因滅活、外源基因不表達。哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法 將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此時DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；此時細胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，D

19、NA便進入受體細胞；1. 磷酸鈣共沉淀法 將上述制備的顆粒懸浮液滴入細胞培養(yǎng)皿中，37保溫4-16小時 棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。 如果在外源DNA中摻入少量的受體細胞內(nèi)源性DNA可以提高轉(zhuǎn)化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒DNA，可使正常細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機制的最早理解。哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法 將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解受體細胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細胞膜產(chǎn)生細小的縫隙，此時 電擊轉(zhuǎn)化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細胞類型，如生長在懸浮液中的淋巴細胞等。2. 電擊轉(zhuǎn)化法DNA

20、片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進入受體細胞。電轉(zhuǎn)化設(shè)備電轉(zhuǎn)化設(shè)備哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法 將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。合，DNA隨即進入胞質(zhì)和核內(nèi)。 利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細胞和HeLa3. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細胞培養(yǎng)液中，便會與受體細胞膜融細胞。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體脂質(zhì)體(liposome)(liposome)是用人工方法將磷脂和相似的兩性脂質(zhì)在水溶液中形成一種脂質(zhì)雙層包圍水溶液的微球。哺乳動物細胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細

21、胞的物理轉(zhuǎn)化法 血影細胞是指哺乳動物的紅細胞在機械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細胞膜包裹的細胞同時，外源DNA也容易進入。當(dāng)上述外界條件消失后，紅細胞膜又可恢復(fù)原來的通透性。因此，可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細胞，然后再將4. 血影細胞介導(dǎo)法核結(jié)構(gòu)。在溶血過程中，紅細胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的血影細胞與受體細胞在適當(dāng)條件下發(fā)生融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入受體細胞。(2) 哺乳動物細胞的病毒轉(zhuǎn)染法哺乳動物細胞的病毒轉(zhuǎn)染法 以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細胞。這種方法具有定向性好、實驗重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高等優(yōu)點，但

22、也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟價值的家禽和牲畜細胞等。提高哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本方法提高哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本方法利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體人源化的小鼠抗體利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑人組織型纖溶酶原激活劑利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人凝血因子人凝血因子VIII(1) 提高哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本方法提高哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本方法 目的基因在哺乳動物細胞，如CHO中的高效表達的策略主要針對三個方面來進行考

23、慮：載體、目的基因和宿主細胞 一、載體改造一、載體改造 基因擴增是外源基因在哺乳動物細胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達的一種特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是動物細胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中，dhfr基因均得以擴增。這些抗性細胞正是通過增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶1.增加目的基因的拷貝數(shù)（DHFR）的特異性抑制劑，細胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多的表達水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴增的區(qū)哺乳動物細胞內(nèi)的基因擴增現(xiàn)象域遠遠大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時被擴增。1）運用共擴增基因做選擇標(biāo)記增加目的基因的拷貝數(shù)(1)

24、轉(zhuǎn)錄前水平轉(zhuǎn)錄前水平DHFR-MTX高效表達系統(tǒng)外源基因dhfr轉(zhuǎn)染dhfr -細胞系單克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)移0.05 m mM MTX培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移5 m mM MTX0.25 m mM MTX培養(yǎng)單克隆外源基因擴增至100拷貝GS-MSX高效表達系統(tǒng) 谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亞砜（MSX）對動物細胞的毒害作用。先將帶有GS編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動物細中不必使用GS缺陷型的受體細胞，而且在正常的MSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細胞，這是GS-MSX系統(tǒng)比DHFR-胞中，由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉(zhuǎn)染過程MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。具體實例：將

25、選擇基因通過一段寡聚核苷酸連在目的基因的3端（如圖）。前體mRNA 在翻譯時, 位于目的基因3端下游的共擴增基因的翻譯起始的效率大大降低, 導(dǎo)致翻譯水平明顯低于上游的目的基因.2 2）通過選擇基因的弱化表達增加拷貝數(shù)）通過選擇基因的弱化表達增加拷貝數(shù)1）在載體上添加染色體上的某些特定序列 在載體上添加染色體上的某些特定序列（如骨架/ 基質(zhì)附著區(qū)SAR/MAR) 使表達載體整合到宿主細胞的染色體后能模擬染色體的高轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，從而使形成的陽性克隆較均一地高效表達目的基因。2）基因定點整合至高表達區(qū) 類似基因打靶，在重組酶的介導(dǎo)下定點整合到染色體轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)2.2.整合位點的優(yōu)化整合位點的優(yōu)化(2)

26、轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控可以概括為順式作用元件與反式作用因子的相互作用。它們分別由表達載體和宿主細胞提供。因此,表達載體的元件組成及結(jié)構(gòu)是CHO 細胞高效表達外源基因的關(guān)鍵因素之一。 在載體上安裝病毒或細胞來源的強啟Ap rM13 oriColE1 oriCMVPPolylinkerGeneIntronSV40 TPolyA signal高效表達載體mRNA前體AAAAAAAAAmRNA動子和增強子，是使外源基因高效表達的一種手段，如： 細胞巨化病毒CMV的啟動子（CMVP)SV40的終止子（SV40T) 1.1.選擇強啟動子和增強子選擇強啟動子和增強子2.2.在目的基因編碼區(qū)尾端添加

27、強的終在目的基因編碼區(qū)尾端添加強的終止子區(qū)域止子區(qū)域 其它強終止子：T抗原、乙型肝炎病毒表面抗原序列或2珠蛋白終止子等。1、選擇高效多聚腺苷酸加尾信號( pA) 真核基因的hnRNA 的加工過程需要多聚腺苷酸加尾信號(pA)。前者多采用SV40 的晚期及早期pA、牛生長激素基因的pA 和人工合成的 pA.l PolyA是mRNA由核進入胞質(zhì)所必需的形式。l PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。 （3）轉(zhuǎn)錄后水平）轉(zhuǎn)錄后水平2.2.剪接信號的運用剪接信號的運用 絕大多數(shù)哺乳動物細胞的表達型載體上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因為mRNA前體的剪切能促進成熟mRNA向胞質(zhì)的運輸，有利于翻譯。 動物珠蛋白

28、基因的內(nèi)含子、SV40的內(nèi)含子2.2.提高轉(zhuǎn)錄因子的表達水平提高轉(zhuǎn)錄因子的表達水平 轉(zhuǎn)錄因子通過 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異識別并結(jié)合目標(biāo)基因的調(diào)控序列， 并通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活或募集轉(zhuǎn)錄作用因子(如RNA聚合酶)至啟動子從而增強基因的轉(zhuǎn)錄。(4) (4) 翻譯水平翻譯水平1、添加Kozak序列2、通過內(nèi)部核糖體進入位點IRES表達多亞基蛋白3、通過翻譯增強子提高翻譯效率1. 添加添加Kozak序列序列 Kozak系統(tǒng)分析了mRNA的5端的序列與翻譯效率的關(guān)系。結(jié)果表明：最有效的翻譯起始的共有序列是5 CCA/GCCATGG3(劃線的為起始密碼子) ，而且最重要的是3位的嘌呤，其次是+ 4 位的

29、G. 實驗表明： 具有Kozak 序列與否將使翻譯起始的差異在一個數(shù)量級。 內(nèi)部核糖體進入位點（IRES ）是從細小RNA 病毒中發(fā)現(xiàn)的，由它連接的開放閱讀框架可以同時翻譯。IRES 序列被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建雙順反子或多順反子哺乳動物細胞表達載體。 用IRES 構(gòu)建多個順反子表達載體， 可以表達多亞基蛋白。2. 通過通過 IRES 表達多亞基蛋白表達多亞基蛋白 翻譯增強子是具有與 IRES 不同二級結(jié)構(gòu)的另一類提高翻譯起始效率的順式調(diào)控元件。1998 年stein 等發(fā)現(xiàn)在組織缺氧情況下 VEGF mRNA壽命大為提高。 VEGF 翻譯增強的程度可高達40 倍，由此發(fā)現(xiàn)了翻譯增強子。（1) 利用密

30、碼子的偏好性 根據(jù)密碼子的偏好性，在不改變蛋白質(zhì)編碼序列的前提下盡量使用CHO細胞常用的密碼子對基因進行改造實例：Kim 等用人高表達基因偏愛的密碼子系統(tǒng)地設(shè)計了人的EPO 基因， 再以酵母偏愛的密碼子編碼人的EPO基因作對照來比較優(yōu)化后的人EPO 基因的表達效率。結(jié)果表明，優(yōu)化的人EPO 基因密碼子比非優(yōu)化的人EPO 基因密碼子的表達效率高23 倍。二、基因改造二、基因改造（2) 盡量使用基因組DNA 基因組DNA 比cDNA 表達量要高。 因此，在可能的條件下，盡量使用基因組DNA。 若用cDNA，則盡量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低轉(zhuǎn)錄、翻譯時不必要的能量消耗，另一方面減少5未翻

31、譯前導(dǎo)區(qū)和克隆中的GC 尾部對表達水平的不良影響。（1）增強 CHO 細胞抗細胞凋亡活性；（2）使 CHO 細胞可在無血清培養(yǎng)基（PFM） 中自分泌生長；（3）減少 CHO 細胞中有害代謝物的產(chǎn)生；（4）控制 CHO 細胞增殖速率； 迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進行臨床試驗，但在哺乳動物工程細胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：b 干擾素g 干擾素凝血因子VIII凝血因子IX促紅細胞生成素（EPO）人生長因子（hGH）白介素 2（IL-2）乙型肝炎表面抗原單克隆抗體 CD4受體組織型纖溶酶原激活劑（tPA）（2）利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)重組蛋白的實例）利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)重組蛋白的實例1. 利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體大多數(shù)惡性淋巴Neor鼠金屬硫蛋白啟動子b 肌動蛋白啟動子抗體輕鏈cDNAb 肌動蛋白終止子pLdhfrSV40啟動子b 肌動蛋白啟動子抗體重鏈cDNAb 肌動蛋白終止子pH瘤細胞表面上都有一種特異性的糖蛋白campath，用人源化的小鼠抗campath抗體治療非霍