食品衛(wèi)生微生物指標及微生物檢測

1、食品衛(wèi)生微生物學(xué)指標食品衛(wèi)生微生物學(xué)指標 食品衛(wèi)生標準食品衛(wèi)生標準是檢驗食品衛(wèi)生狀況的依據(jù)，包括是檢驗食品衛(wèi)生狀況的依據(jù)，包括感官指標感官指標理化指標理化指標微生物指標微生物指標指通過目視、鼻聞、手摸和口嘗檢指通過目視、鼻聞、手摸和口嘗檢查各種食品外觀的指標，一般包括查各種食品外觀的指標，一般包括色澤、氣味、口味和組織狀態(tài)等。色澤、氣味、口味和組織狀態(tài)等。指食品在原料、生產(chǎn)、加工過程中指食品在原料、生產(chǎn)、加工過程中帶入的有害物質(zhì)以及由于霉變和腐帶入的有害物質(zhì)以及由于霉變和腐敗變質(zhì)而產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)。敗變質(zhì)而產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)。目前實際應(yīng)用的指標菌可以分為以下三種：目前實際應(yīng)用的指標菌可以分為

2、以下三種：u一、一般衛(wèi)生狀況指標菌，包括菌落總數(shù)、一、一般衛(wèi)生狀況指標菌，包括菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)；霉菌和酵母菌總數(shù)；u二、糞便污染指標菌，包括大腸菌群、糞大二、糞便污染指標菌，包括大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、腸菌群、大腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、霍亂弧菌等；霍亂弧菌等；u三、致病菌，包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、三、致病菌，包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、銅綠假單胞菌等。沙門氏菌、志賀氏菌、銅綠假單胞菌等。 食品衛(wèi)生標準中的微生物指標食品衛(wèi)生標準中的微生物指標菌落總數(shù)菌落總數(shù)菌落總數(shù)菌落總數(shù)指食品檢樣經(jīng)處理，在一定條件下培養(yǎng)后，指食品檢樣經(jīng)處理

3、，在一定條件下培養(yǎng)后，所得所得1g食品或食品或1mL食品中或食品中或1cm2食品表面積食品表面積上所含有的細菌菌落總數(shù)。上所含有的細菌菌落總數(shù)。1.1菌落總數(shù)概念和其所指示的衛(wèi)生意義菌落總數(shù)概念和其所指示的衛(wèi)生意義v一定條件：如需氧情況、營養(yǎng)條件、一定條件：如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時間、培養(yǎng)溫度和時間等等v不能滿足厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中不能滿足厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細菌的生長溫的細菌的生長v因此菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細菌總數(shù)，菌落總數(shù)因此菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細菌的種類并不能區(qū)分其中細菌的種類

4、 v單位單位菌落形成單位叫做菌落形成單位叫做CFU（colony forming units）菌落總數(shù)所指示的食品衛(wèi)生意義菌落總數(shù)所指示的食品衛(wèi)生意義 ：它可以作為食品被污染程度的標志，一般食它可以作為食品被污染程度的標志，一般食品中菌落總數(shù)越多，則表明該食品污染程度越品中菌落總數(shù)越多，則表明該食品污染程度越深。深。它可以用來預(yù)測食品存放的期限或程度。它可以用來預(yù)測食品存放的期限或程度。檢測方法與步驟v平板菌落計數(shù)法平板菌落計數(shù)法v基本操作一般包括：基本操作一般包括： 樣品的稀釋傾注平皿培養(yǎng)樣品的稀釋傾注平皿培養(yǎng)48小時小時計數(shù)報告。計數(shù)報告。 vGB中國國家標準中國國家標準vSN 中國檢驗檢

5、疫行業(yè)標準中國檢驗檢疫行業(yè)標準vFDA BAM(Bacteriological analytical manual) 美國食品藥品管理局細菌學(xué)分析手美國食品藥品管理局細菌學(xué)分析手冊冊vISO(International Organization for Standardization )國際標準化組織國際標準化組織vAOAC國際分析化學(xué)家協(xié)會國際分析化學(xué)家協(xié)會細菌總數(shù)的常規(guī)檢驗方法細菌總數(shù)的常規(guī)檢驗方法-樣品的稀釋樣品的稀釋-傾注平皿傾注平皿-培養(yǎng)培養(yǎng)48（24）小時）小時-計數(shù)計數(shù)-報告報告稀釋平板菌落計數(shù)法稀釋平板菌落計數(shù)法(Plate Counter)操作步驟操作步驟9mL25g或或25

6、mL225mL無菌生無菌生理鹽水理鹽水1mL10-110-210-310-610-7稀釋平板菌落計數(shù)法稀釋平板菌落計數(shù)法稀釋液的選擇稀釋液的選擇v樣品稀釋液主要是樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水滅菌生理鹽水，有的采用，有的采用磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液（或（或0.1%蛋白胨水蛋白胨水），后者對），后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如。如對含鹽量較高的食品（如醬油醬油）進行稀）進行稀釋，可以采用釋，可以采用滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水。 培養(yǎng)溫度一般為培養(yǎng)溫度一般為37（水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度，由于其（水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，

7、故多采用生活環(huán)境水溫較低，故多采用30）培養(yǎng)時間一般為培養(yǎng)時間一般為48h，有些方法只要求，有些方法只要求24h的培養(yǎng)即的培養(yǎng)即可計數(shù)可計數(shù)培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15 在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養(yǎng)瓊脂中加入可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（氯化三苯四氮唑（TTC），），培培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）v胰蛋白胨胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉，酵母浸粉2.5g，葡萄，葡

8、萄糖糖1.0g，瓊脂，瓊脂15.0g，蒸餾水，蒸餾水1000ml，vpH7.00.2,v12115分鐘分鐘滅菌。滅菌。 若有二個稀釋度均在若有二個稀釋度均在30300之間時，按國家之間時，按國家標準方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或標準方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于等于2取平均數(shù)，比值大于取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報告）。的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報告）。計數(shù)原則計數(shù)原則到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于04，但不得超過，但不

9、得超過24h。中國國家標準中國國家標準GB計數(shù)時應(yīng)選取菌落數(shù)在計數(shù)時應(yīng)選取菌落數(shù)在30300cfu/g的平板（的平板（SN檢驗檢疫行業(yè)標準要求檢驗檢疫行業(yè)標準要求為為25250cfu/g）。）。 如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于1乘以乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。有的規(guī)定對上述幾種情況最低稀釋倍數(shù)報告之。有的規(guī)定對上述幾種情況計算出的菌落數(shù)按估算值報告。計算出的菌落數(shù)按估算值報告。若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。之。如均小于如

10、均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之。稀釋倍數(shù)報告之。如菌落數(shù)有的大于如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于，有的又小于30，但均，但均不在不在30300之間，則應(yīng)以最接近之間，則應(yīng)以最接近300或或30的平的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。n不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗中的差錯（數(shù)愈低

11、菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。樣計數(shù)報告的依據(jù)。 n當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則顯界限，則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不計數(shù)。

12、如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。代表全平板的菌落數(shù)。 n當(dāng)計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度當(dāng)計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于均大于300時），但分布很均勻，可取平板時），但分布很均勻，可取平板的一半或的一半或1/4計數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為計數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。該平板的菌落數(shù)。 菌落數(shù)的報告菌落數(shù)的報告按國家標準方法規(guī)定按國家標準方法規(guī)定菌落數(shù)在菌落數(shù)在1100時，按實有數(shù)字報告。時，按實有數(shù)字報告。如大于

13、如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。三位數(shù)按四舍五入計算。固體檢樣以克（固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升為單位報告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。）報告。 方法優(yōu)點方法簡便，較精確，重復(fù)性好。細菌總數(shù)的其它檢驗方法細菌總數(shù)的其它檢驗方法 涂布平板法點滴平板法螺旋平板法：螺旋平板法是由一臺機器完成的。 涂布平板法涂布平板法是將營養(yǎng)瓊脂制成平板、經(jīng)是將營養(yǎng)瓊脂制成平板、經(jīng)5012小時或小時或351820小時干燥后，在上面滴加檢樣稀釋液小時干燥后，在上面滴加

14、檢樣稀釋液0.2ml，用，用“L”棒涂布于整個平板的表現(xiàn)，放置約棒涂布于整個平板的表現(xiàn)，放置約10分鐘，將平板翻轉(zhuǎn)，放至分鐘，將平板翻轉(zhuǎn)，放至36+1溫箱內(nèi)培養(yǎng)溫箱內(nèi)培養(yǎng)242小時，（水產(chǎn)品用小時，（水產(chǎn)品用30C培養(yǎng)培養(yǎng)482小時小時)取出，取出，進行菌落計數(shù)，然后乘以進行菌落計數(shù)，然后乘以5(由由02ml換算為換算為1ml)，再乘以樣品稀釋液的倍數(shù)，即得每克或每升檢樣再乘以樣品稀釋液的倍數(shù)，即得每克或每升檢樣所含菌落數(shù)。所含菌落數(shù)。涂布法優(yōu)缺點比常規(guī)檢驗法效果好。因為菌落生長在表面，比常規(guī)檢驗法效果好。因為菌落生長在表面，便于識別和檢查其形態(tài)，雖檢樣中含有食品便于識別和檢查其形態(tài)，雖檢樣中

15、含有食品顆粒，也不會發(fā)生混淆但是本法取樣量比顆粒，也不會發(fā)生混淆但是本法取樣量比常規(guī)檢驗法少。常規(guī)檢驗法少。代表性會受到一定影響。代表性會受到一定影響。點滴平板法 與涂布平板法相似。不同的是點滴平板法只是用標定與涂布平板法相似。不同的是點滴平板法只是用標定好的微量吸管或注射器針頭按滴好的微量吸管或注射器針頭按滴( (使每滴相當(dāng)于使每滴相當(dāng)于0 0025m1)025m1)將檢樣稀釋液滴加于瓊脂平板上固定的區(qū)域?qū)z樣稀釋液滴加于瓊脂平板上固定的區(qū)域( (預(yù)預(yù)先在乎板背面用標記筆劃成四個區(qū)域先在乎板背面用標記筆劃成四個區(qū)域) )每個區(qū)域滴每個區(qū)域滴1 1滴，每個稀釋度滴兩個區(qū)域，作為平行試驗。滴加后

16、滴，每個稀釋度滴兩個區(qū)域，作為平行試驗。滴加后，將平板放平約，將平板放平約1010分鐘，然后翻轉(zhuǎn)平板，如涂布平板分鐘，然后翻轉(zhuǎn)平板，如涂布平板法法+ +樣移入溫箱中，培養(yǎng)樣移入溫箱中，培養(yǎng)6868小時后進行計數(shù)，將所得小時后進行計數(shù)，將所得菌落數(shù)乘以菌落數(shù)乘以40(40(由由0 0025m1025m1換算為換算為1ml)1ml)，再乘以樣品的，再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得每克或每毫升檢樣所含菌落數(shù)。稀釋倍數(shù)，即得每克或每毫升檢樣所含菌落數(shù)。螺旋平板儀糞便污染指示菌類糞便污染指示菌類理想的指示菌應(yīng)具備的性能理想的指示菌應(yīng)具備的性能必須與糞便或病原菌有密切關(guān)系。它們正常寄必須與糞便或病原菌有密切關(guān)系

17、。它們正常寄居場所應(yīng)是人或動物的腸道，在正常情況下不應(yīng)居場所應(yīng)是人或動物的腸道，在正常情況下不應(yīng)在一般檢樣中存在。在一般檢樣中存在。在普通培養(yǎng)基上易生長，用簡單的操作方法即能在普通培養(yǎng)基上易生長，用簡單的操作方法即能快速和準確地測定出數(shù)量?？焖俸蜏蚀_地測定出數(shù)量。它們與腸道致病菌應(yīng)有相同的對外界不良因素它們與腸道致病菌應(yīng)有相同的對外界不良因素的抵抗力。的抵抗力。大腸菌群大腸菌群糞便污染指示菌之一糞便污染指示菌之一-大腸菌群大腸菌群(coliforms)一、大腸菌群一、大腸菌群(coliforms)的定義的定義二、大腸菌群二、大腸菌群MPN值（大腸菌群數(shù)）所指示的值（大腸菌群數(shù)）所指示的衛(wèi)生意義

18、衛(wèi)生意義三、大腸菌群計數(shù)方法：國家標準法三、大腸菌群計數(shù)方法：國家標準法（一）大腸菌群（一）大腸菌群MPN計數(shù)法計數(shù)法（二）大腸菌群平板菌落計數(shù)法（二）大腸菌群平板菌落計數(shù)法大腸菌群大腸菌群大腸菌群大腸菌群(coliforms)的定義的定義具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌。具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌。指在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需指在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢的桿菌。氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢的桿菌。包括埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、腸桿菌屬和克雷包括埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬等的一些菌種。伯氏菌屬等的一些菌

19、種。分布廣泛：土壤、人和動物腸道。分布廣泛：土壤、人和動物腸道。大腸菌群大腸菌群MPN值值指每指每1g或或1ml食品檢樣中大腸菌群最可能數(shù)食品檢樣中大腸菌群最可能數(shù)（most probable number）。）。大腸菌群大腸菌群MPN值（大腸菌群數(shù)）所指示值（大腸菌群數(shù)）所指示的衛(wèi)生意義：的衛(wèi)生意義：1.它可作為糞便污染食品的指示菌。它可作為糞便污染食品的指示菌。2.它可作為腸道致病菌污染食品可能性的指示菌。它可作為腸道致病菌污染食品可能性的指示菌。樣品稀釋樣品稀釋初發(fā)酵試驗初發(fā)酵試驗復(fù)發(fā)酵試驗復(fù)發(fā)酵試驗大腸菌群計數(shù)方法：國家標準法大腸菌群計數(shù)方法：國家標準法方法一方法一-大腸菌群大腸菌群M

20、PN計數(shù)法：計數(shù)法：不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣產(chǎn)氣產(chǎn)氣不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣10 倍系列稀釋倍系列稀釋選擇適宜選擇適宜3 個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST 肉湯管肉湯管檢檢 樣樣25 g(mL)樣品樣品+225 mL 稀釋液，均質(zhì)稀釋液，均質(zhì)產(chǎn)氣產(chǎn)氣BGLB 肉湯肉湯大腸菌群陰性大腸菌群陰性大腸菌群陽性大腸菌群陽性查查MPN 表表報告結(jié)果報告結(jié)果36 1 48 h 2h36 1 48 h 2h圖圖 大大腸腸菌菌群群MPN計計數(shù)數(shù)法法檢檢驗驗程程序序樣品稀釋樣品稀釋平板計數(shù)典型和可疑菌落數(shù)平板計數(shù)典型和可疑菌落數(shù)證實試驗證實試驗大腸菌群計數(shù)方法：國家標準法大腸菌群計數(shù)方法：國家標準法方法二

21、方法二-大腸菌群平板計數(shù)法：大腸菌群平板計數(shù)法：圖圖 大大腸腸菌菌群群平平板板計計數(shù)數(shù)法法檢檢驗驗程程序序計數(shù)典型和可疑菌落計數(shù)典型和可疑菌落10 倍系列稀釋倍系列稀釋選擇適宜選擇適宜3 個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種VRBA 平板平板檢檢 樣樣25 g(mL)樣品樣品+225 mL 稀釋液，均質(zhì)稀釋液，均質(zhì)BGLB肉湯肉湯報告結(jié)果報告結(jié)果36 1 36 1 18 h 24h24h 48huVRBA結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基v成分：蛋白胨成分：蛋白胨7.0g；酵母膏；酵母膏3.0g；乳糖；乳糖10.0g；氯化鈉；氯化鈉5.0g；膽鹽或；膽鹽或

22、3號膽鹽號膽鹽1.5g；中性紅；中性紅0.03g；結(jié)晶紫；結(jié)晶紫0.002g；瓊；瓊脂脂15-18g；蒸餾水；蒸餾水1000mL；pH7.40.1。v制法：將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，制法：將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH。煮沸。煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至，將培養(yǎng)基冷卻至45-50傾注平板。傾注平板。使用前臨時制備，不得超過使用前臨時制備，不得超過3h。選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在15 CFU150 CFU 之間的之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的

23、膽典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大?；蚋?。大腸菌群在大腸菌群在VRBA上的菌落特征上的菌落特征證實試驗證實試驗從從VRBA 平板上挑取平板上挑取10 個不同類型的典型和個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，肉湯管內(nèi)，36 1 培養(yǎng)培養(yǎng)24 h48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。大腸菌群平板計數(shù)的報告大腸菌群平板計數(shù)的報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數(shù)的平板菌經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比

24、例乘以計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌）樣品中大腸菌群數(shù)。例：群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液樣品稀釋液1 mL，在，在VRBA平板上有平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種個接種BGLB肉湯管，證肉湯管，證實有實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。）。乳糖發(fā)酵試驗乳糖發(fā)酵試驗分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)證實試驗證實試驗大腸菌群的檢測：舊國家標準大腸菌群的檢測：舊國家標準-三步法三步法圖圖 大大腸腸菌菌群群檢檢驗驗

25、程程序序被檢樣品被檢樣品稀釋稀釋乳糖膽鹽發(fā)酵管乳糖膽鹽發(fā)酵管35 37 ，24 2小時小時不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陰性大腸菌群陰性報告報告伊紅美藍或遠藤或麥伊紅美藍或遠藤或麥康凱平板任意一種，康凱平板任意一種，35 37 ，18 24小小時時挑可疑菌落挑可疑菌落1-2個同時進行個同時進行革蘭氏染色革蘭氏染色革蘭氏陰性革蘭氏陰性無芽孢桿菌無芽孢桿菌革蘭氏陽性革蘭氏陽性大腸菌群陰性大腸菌群陰性報告報告乳糖發(fā)酵管乳糖發(fā)酵管35 37 ，24 2小時小時產(chǎn)氣產(chǎn)氣不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸菌大腸菌群陰性群陰性大腸菌群陽性大腸菌群陽性報告報告報告報告產(chǎn)氣實驗（伊紅美藍）（伊紅美藍）瓊脂培養(yǎng)基原理瓊脂培養(yǎng)基原理瓊

26、脂培養(yǎng)基中含有的伊紅和美藍染料，瓊脂培養(yǎng)基中含有的伊紅和美藍染料，可抑制革蘭氏陽性細菌。那些能發(fā)酵乳糖的細可抑制革蘭氏陽性細菌。那些能發(fā)酵乳糖的細菌，能將染料攝入細胞，從而使菌落呈現(xiàn)出紫菌，能將染料攝入細胞，從而使菌落呈現(xiàn)出紫色或邊緣無色、中央暗黑色的菌落。色或邊緣無色、中央暗黑色的菌落。培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分肉湯蛋白胨培養(yǎng)基毫升（肉湯蛋白胨培養(yǎng)基毫升（h.），），乳糖溶液毫升，伊紅溶液毫升，乳糖溶液毫升，伊紅溶液毫升，.美藍溶液毫升。美藍溶液毫升。配制方式配制方式將已滅菌的肉湯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基熔化將已滅菌的肉湯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基熔化以無菌操作加入預(yù)先滅菌的乳糖溶液以無菌操作加入預(yù)先滅菌的乳糖溶液

27、毫升、伊紅溶液毫升及毫升、伊紅溶液毫升及.美藍溶美藍溶液毫升。液毫升。培養(yǎng)結(jié)果觀察培養(yǎng)結(jié)果觀察大腸桿菌的菌落在透射光下呈紫黑色，在反射大腸桿菌的菌落在透射光下呈紫黑色，在反射光下常常有一種金屬光澤（亮綠色）光下常常有一種金屬光澤（亮綠色）產(chǎn)氣桿菌以粘質(zhì)狀菌落豐盛地生長，呈棕色產(chǎn)氣桿菌以粘質(zhì)狀菌落豐盛地生長，呈棕色一般腸道致病菌不發(fā)酵乳糖，故呈粉紅色或一般腸道致病菌不發(fā)酵乳糖，故呈粉紅色或蘭色的菌落蘭色的菌落中心黑色或中心黑色或紫紅色，有紫紅色，有或無綠色金或無綠色金屬光澤屬光澤糞便污染指示菌之二糞便污染指示菌之二-糞大腸菌群糞大腸菌群（faecal coliforms）或耐熱大腸菌群）或耐熱大

28、腸菌群首先由首先由Eijkman提出，指的是在高溫下發(fā)酵乳提出，指的是在高溫下發(fā)酵乳糖，是總大腸菌群的亞群，同時也稱為糖，是總大腸菌群的亞群，同時也稱為耐熱大耐熱大腸菌群腸菌群。大腸菌群包括：糞（便）大腸菌群和非糞（便）大腸菌群包括：糞（便）大腸菌群和非糞（便）大腸菌群。大腸菌群。糞大腸菌群（糞大腸菌群（faecal coliforms）或耐熱大腸菌群或耐熱大腸菌群糞大腸菌群定義在糞大腸菌群定義在44.5 條件下發(fā)酵乳糖產(chǎn)條件下發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，革蘭氏陰性兼性厭氧的小桿菌。包酸產(chǎn)氣，革蘭氏陰性兼性厭氧的小桿菌。包含絕大部分大腸桿菌，少數(shù)腸桿菌和克雷伯含絕大部分大腸桿菌，少數(shù)腸桿菌和克雷伯氏菌屬

29、的某些品系。氏菌屬的某些品系。 糞大腸菌群的檢測，除水、貝類、貝類養(yǎng)殖糞大腸菌群的檢測，除水、貝類、貝類養(yǎng)殖水在水在44.5進行，其他所有食品都在進行，其他所有食品都在45.5進行。進行。糞便污染指示菌之三糞便污染指示菌之三-大大腸桿菌腸桿菌是人類和大多數(shù)溫血動物腸道中的正常茵群是人類和大多數(shù)溫血動物腸道中的正常茵群條件致病菌條件致病菌大腸桿菌，學(xué)名為大腸埃希氏菌大腸桿菌，學(xué)名為大腸埃希氏菌（ Escherichia coli，E.coli ）大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、酸產(chǎn)氣、IMViCIMViC試驗（靛基質(zhì)、試驗（靛基質(zhì)、MR

30、MR、V-PV-P、檸檬酸、檸檬酸鹽試驗）為鹽試驗）為+-+-或或-+-+-的細菌。的細菌。與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETECETEC）、致病性）、致病性大腸桿菌（大腸桿菌（EPECEPEC）、出血性大腸桿菌（）、出血性大腸桿菌（EHECEHEC）、）、侵襲性大腸桿菌（侵襲性大腸桿菌（EIECEIEC）、黏附性大腸桿菌）、黏附性大腸桿菌（EAECEAEC）。）。檢檢 樣樣 LST肉湯肉湯 LST肉湯管陽性肉湯管陽性 （疑似大腸菌群）（疑似大腸菌群） EC肉湯肉湯 EC肉湯產(chǎn)氣管為陽

31、性肉湯產(chǎn)氣管為陽性（糞大腸菌群）（糞大腸菌群） 查查MPN表，報告糞大腸表，報告糞大腸菌群菌群MPN/g 陽性管再培養(yǎng)陽性管再培養(yǎng)24hBGLB肉湯管陽性肉湯管陽性 （證實大腸菌群）（證實大腸菌群） 按按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表，報告大腸菌群表，報告大腸菌群MPN/g 37，48h37，48h44.5，24h大腸菌群、糞大腸菌大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測群和大腸桿菌的檢測黑色菌落移種黑色菌落移種營養(yǎng)瓊脂斜面營養(yǎng)瓊脂斜面LST肉湯肉湯 IMViC生化試驗生化試驗 革蘭氏染色革蘭氏染色 產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸產(chǎn)氣 +-/-+- 無芽胞無芽胞G-桿菌桿菌大腸桿菌大腸桿菌 按按E

32、C肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表，報告大腸桿菌表，報告大腸桿菌MPN/g EMB平板分離平板分離 37，24h大腸菌群、糞大腸菌大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測群和大腸桿菌的檢測菌落總數(shù)和大腸菌群菌落總數(shù)和大腸菌群MPN的其的其他測定方法他測定方法疏水網(wǎng)膜法（膜過濾法）疏水網(wǎng)膜法（膜過濾法）TTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）氯化三苯四氮唑）顯色法顯色法DC(去氧膽酸鈉去氧膽酸鈉)半固體法半固體法紙片法紙片法等等 膜過濾法膜過濾法最適合于檢測水樣品，也可用于含微量顆最適合于檢測水樣品，也可用于含微量顆粒少的液體食品。粒少的液體食品。我國飲用水衛(wèi)生標準：我國飲用水衛(wèi)生標準： 3 3

33、個大腸菌群個大腸菌群/ /1L飲水飲水 100100個個細菌總數(shù)細菌總數(shù)/ /1ml飲水飲水水中大腸桿菌的檢測方法主要有多管發(fā)酵法和水中大腸桿菌的檢測方法主要有多管發(fā)酵法和濾膜法等。其中，多管發(fā)酵法是根據(jù)大腸桿菌濾膜法等。其中，多管發(fā)酵法是根據(jù)大腸桿菌能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，以及革蘭氏陰性、無能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，以及革蘭氏陰性、無芽孢、在伊紅美藍培養(yǎng)基上菌落呈深紫黑色并芽孢、在伊紅美藍培養(yǎng)基上菌落呈深紫黑色并具有金屬光澤等特性，通過初發(fā)酵實驗、平板具有金屬光澤等特性，通過初發(fā)酵實驗、平板分離和復(fù)發(fā)酵實驗三個步驟進行檢測，以求得分離和復(fù)發(fā)酵實驗三個步驟進行檢測，以求得水樣中的大腸桿菌數(shù)。用該法檢

34、測大腸桿菌雖水樣中的大腸桿菌數(shù)。用該法檢測大腸桿菌雖費時較久、手續(xù)較繁，但準確可靠，是經(jīng)典的費時較久、手續(xù)較繁，但準確可靠，是經(jīng)典的檢測方法。檢測方法。膜過濾TTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）氯化三苯四氮唑）顯色法顯色法v在計數(shù)瓊脂中加入適量的在計數(shù)瓊脂中加入適量的TTC(0.5% TTC 1ML加到加到100ML瓊脂中瓊脂中),細菌菌落長成紅細菌菌落長成紅顏色顏色,對去除食品本底顆粒物干擾非常有對去除食品本底顆粒物干擾非常有意義意義.酵母菌在TTC上的菌落特征 DC(去氧膽酸鈉去氧膽酸鈉)半固體法半固體法 （1 1）選擇三個稀釋度的樣品液，每個稀釋度分別?。┻x擇三個稀釋度的樣品液，每個稀釋

35、度分別取1ml1ml放入滅菌試管中放入滅菌試管中。 (2) (2)將溶化并冷至將溶化并冷至5050左右的左右的DCDC半固體培養(yǎng)基加入上述試管中，每管半固體培養(yǎng)基加入上述試管中，每管3m13m1。立即混合。立即混合) )，凝固后于，凝固后于3737培養(yǎng)培養(yǎng)18182424小時。小時。(3)(3)判定標準和記錄：判定標準和記錄：a a培養(yǎng)基變桔紅色，有氣泡產(chǎn)生或瓊脂崩裂。記錄為；培養(yǎng)基變桔紅色，有氣泡產(chǎn)生或瓊脂崩裂。記錄為；b b培養(yǎng)基為桔紅色，或有桔紅色菌落，無氣泡和瓊脂崩裂現(xiàn)象，記錄為培養(yǎng)基為桔紅色，或有桔紅色菌落，無氣泡和瓊脂崩裂現(xiàn)象，記錄為十；十；c c培養(yǎng)基為綠色，有黃色菌落，無氣泡和

36、瓊脂崩裂現(xiàn)象，記錄為；培養(yǎng)基為綠色，有黃色菌落，無氣泡和瓊脂崩裂現(xiàn)象，記錄為；d d培養(yǎng)基為綠色，記錄為培養(yǎng)基為綠色，記錄為。(4)(4)判定為判定為a a、d d反應(yīng)結(jié)果；記錄陽性管數(shù)，查反應(yīng)結(jié)果；記錄陽性管數(shù)，查MPNMPN表并報告之。若為表并報告之。若為b b、c c反應(yīng)結(jié)果，可挑大腸菌群可疑菌落接種乳糖復(fù)發(fā)酵管，根據(jù)產(chǎn)酸產(chǎn)氣管反應(yīng)結(jié)果，可挑大腸菌群可疑菌落接種乳糖復(fù)發(fā)酵管，根據(jù)產(chǎn)酸產(chǎn)氣管數(shù)查數(shù)查MPNMPN表，并報告之。表，并報告之。菌落為菌落為紅色，紅色，周圍有周圍有紅色的紅色的菌落膽菌落膽鹽沉淀鹽沉淀環(huán)，直環(huán)，直徑為徑為2-3mm或或更大更大糞便污染指示菌之四糞便污染指示菌之四-腸

37、球菌腸球菌（Enterococcus）是鏈球菌屬中的一個血清學(xué)群（是鏈球菌屬中的一個血清學(xué)群（D型群）型群）（Lancefield應(yīng)用鏈球菌細胞壁中多糖類應(yīng)用鏈球菌細胞壁中多糖類半抗原，將鏈球菌分成半抗原，將鏈球菌分成ABCD-十九個血十九個血清群）清群） 腸球菌分類腸球菌分類1989年，依據(jù)年，依據(jù)Facklam和和Collins的分類，腸球菌屬內(nèi)的分類，腸球菌屬內(nèi)包括十二個種及一個變異株，它們是：包括十二個種及一個變異株，它們是：糞腸球菌（糞腸球菌（E.faecalis） 屎腸球菌（屎腸球菌（E.faecium) 鳥腸球菌鳥腸球菌(E.avium) 酪黃腸球菌酪黃腸球菌(E.casseli

38、flavus) 堅忍腸球菌堅忍腸球菌(E.durans) 雞腸球菌雞腸球菌E.galinarum) 芒地腸球菌芒地腸球菌(E.mundii) 惡臭腸球菌惡臭腸球菌(E.maladoratum) 希拉腸球菌希拉腸球菌(E.hirae) 孤立腸球菌（孤立腸球菌（E.solitarius） 棉子糖腸球菌棉子糖腸球菌(E.raffinosus) 假鳥腸球菌假鳥腸球菌(E.pseudoavium) 糞腸球變異株糞腸球變異株(E.faecalis var)。糞腸球菌為該屬中最常見的即為代表種。糞腸球菌為該屬中最常見的即為代表種。 自然界分布廣，存活力持久自然界分布廣，存活力持久腸球菌普遍存在于自然界，一般

39、棲居在各種溫血腸球菌普遍存在于自然界，一般棲居在各種溫血和冷血動物的腔腸，甚至昆蟲體內(nèi)，也是健康人和冷血動物的腔腸，甚至昆蟲體內(nèi)，也是健康人體的上呼吸道，口腔或腸道的常居菌。本菌可以體的上呼吸道，口腔或腸道的常居菌。本菌可以引起心內(nèi)膜炎，膽囊炎，腦膜炎，尿路感染及傷引起心內(nèi)膜炎，膽囊炎，腦膜炎，尿路感染及傷口感染等多種疾病。在人類糞便中的數(shù)量僅次于口感染等多種疾病。在人類糞便中的數(shù)量僅次于大腸菌群，每克成人的糞便中約含大腸菌群，每克成人的糞便中約含108個。個。 腸球菌分布腸球菌分布腸球菌生物學(xué)性狀腸球菌生物學(xué)性狀 腸球菌屬的細菌為革蘭氏陽性球菌，多數(shù)菌種成腸球菌屬的細菌為革蘭氏陽性球菌，多數(shù)

40、菌種成雙或呈短鏈狀排列；一般無芽胞，無莢膜，少數(shù)雙或呈短鏈狀排列；一般無芽胞，無莢膜，少數(shù)菌種有鞭毛，陳舊培養(yǎng)物或在厭氧狀態(tài)下有時呈菌種有鞭毛，陳舊培養(yǎng)物或在厭氧狀態(tài)下有時呈革蘭氏陰性。革蘭氏陰性。 最適生長溫度最適生長溫度37，最適，最適pH為為4.7-7.6，屬內(nèi)各，屬內(nèi)各菌種均能在菌種均能在.5%氯化鈉肉湯氯化鈉肉湯,pH9.6葡萄糖肉湯葡萄糖肉湯及及生長，個別菌種在生長，個別菌種在50時生長快。時生長快。 抵抗力強及耐受性強抵抗力強及耐受性強 ，生長營養(yǎng)要求不高，生長營養(yǎng)要求不高 目前該菌多作為生活飲用水，管道水和一些水目前該菌多作為生活飲用水，管道水和一些水質(zhì)的指示菌。衛(wèi)生學(xué)家認為，

41、腸球菌類似于大質(zhì)的指示菌。衛(wèi)生學(xué)家認為，腸球菌類似于大腸菌群的生態(tài)活動，但其對惡劣的外環(huán)境和冷腸菌群的生態(tài)活動，但其對惡劣的外環(huán)境和冷凍條件具有較強的抵抗力，作為監(jiān)測水質(zhì)衛(wèi)生，凍條件具有較強的抵抗力，作為監(jiān)測水質(zhì)衛(wèi)生，環(huán)境衛(wèi)生質(zhì)量的污染指標更具有衛(wèi)生學(xué)意義。環(huán)境衛(wèi)生質(zhì)量的污染指標更具有衛(wèi)生學(xué)意義。 腸球菌抵抗性腸球菌抵抗性 致病菌致病菌三、致病菌（病原菌）三、致病菌（病原菌）根據(jù)根據(jù)不同食品不同食品的特點的特點選定一定的病原菌選定一定的病原菌作為檢作為檢驗的重點對象。例如蛋粉、冷凍禽類、肉類食驗的重點對象。例如蛋粉、冷凍禽類、肉類食品等常規(guī)定沙門氏菌是必須檢驗的重要項目；品等常規(guī)定沙門氏菌是必

42、須檢驗的重要項目；酸度不高的罐藏食品，肉毒桿菌是必須檢驗的酸度不高的罐藏食品，肉毒桿菌是必須檢驗的對象；酸牛奶則規(guī)定腸道致病菌和致病性球菌對象；酸牛奶則規(guī)定腸道致病菌和致病性球菌（鏈球菌和葡萄球菌）是檢測重點。（鏈球菌和葡萄球菌）是檢測重點。食品中常見的致病性微生物食品中常見的致病性微生物 能引起人類疾病和食物中毒的致病性微生物：能引起人類疾病和食物中毒的致病性微生物：沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌，沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等口蹄疫病毒等 能產(chǎn)生毒素并引起食物中毒的微生物：能產(chǎn)生毒素并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌，也包括一些真肉毒梭菌、葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌，也包括一些真菌，都會產(chǎn)生毒素。菌，都會產(chǎn)生毒素。致病性大腸桿菌致病性大腸桿菌病原性大腸桿菌（致病性大腸桿菌）分類：病原性大腸桿菌（致病性大腸桿菌）分類：腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（enterotoxigenic