第7章 親和層析

1、2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss1第七章第七章 親和層析親和層析Affinity chromatography2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss2技術(shù)背景技術(shù)背景一般純化蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的方一般純化蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的方法的主要依據(jù)是，各種大分子之間理化特法的主要依據(jù)是，各種大分子之間理化特性的差異性。性的差異性。如果這種差異性較小，要得到一種純度稍如果這種差異性較小，要得到一種純度稍高的物質(zhì)，常常需要進(jìn)行多次繁瑣的操作，高的物質(zhì)，常常需要進(jìn)行多次繁瑣的操作，耗費較長的時間，但最終收得率卻是很低。耗費較長的時間，但最終收得率卻是很低。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss32

2、022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss4內(nèi)容提要內(nèi)容提要第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理第二節(jié)第二節(jié) 操作操作第三節(jié)第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量提高吸附劑的操作容量第四節(jié)第四節(jié) 應(yīng)用實例應(yīng)用實例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss5第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)2 2與配體無與配體無生物學(xué)特異性生物學(xué)特異性L LMMS S2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss6親和層析的概念親和層析的概念 親和力親和力 根據(jù)生物體中高分子化合物能與之相對應(yīng)的專一分子根據(jù)生物體中高分子化合物能與之相對應(yīng)的專一分子特異識特異識別和可逆結(jié)合別和可逆結(jié)合的特征的特征, ,將生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力將生物

3、分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力. . 親和層析法親和層析法 利用生物大分子和固定相表面存在某種利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性吸附特異性吸附而進(jìn)行而進(jìn)行選選擇性分離擇性分離的一種生物大分子分離的層析方法。的一種生物大分子分離的層析方法。 親和層析法的實質(zhì)親和層析法的實質(zhì) 是在是在載體載體( (無機或有機填料無機或有機填料) )的表面先鍵和一種具有一般反應(yīng)的表面先鍵和一種具有一般反應(yīng)性能的性能的間隔臂間隔臂, ,隨后再連接隨后再連接配體配體（酶、抗原、激素等）組成（酶、抗原、激素等）組成固定固定相相, ,而固載的配體高選擇地吸附與其有生物特性的大分子而被保而固載的配體高選擇地吸附與其有生

4、物特性的大分子而被保留留, ,非特異的分子不被保留先流出層析柱非特異的分子不被保留先流出層析柱, ,保留在柱上的分子將以保留在柱上的分子將以純品形態(tài)洗脫下來。純品形態(tài)洗脫下來。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss72022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss82022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss92022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss102022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss112022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss12 親和層析法的作用機理：親和層析法的作用機理：固相載體固相載體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團親和基團配體配體XBAA2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院

5、wss132022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss14n特異性配體親和層析法和特異性配體親和層析法和通用性配體親和通用性配體親和層層析法：析法：方法方法配體配體性能性能特異性配體親和特異性配體親和層析法層析法復(fù)雜的生命大分子復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)（如抗體、受物質(zhì)（如抗體、受體和酶的類似底物體和酶的類似底物等）等）具有較強的吸附選具有較強的吸附選擇性和較大的結(jié)合擇性和較大的結(jié)合力力通用性配體親和通用性配體親和層析法層析法簡單的小分子物質(zhì)簡單的小分子物質(zhì)（如金屬、染料、（如金屬、染料、以及氨基酸等）以及氨基酸等）成本低廉，具有較成本低廉，具有較高的吸附容量，通高的吸附容量，通過改善吸附和脫附過改善吸附和

6、脫附條件可提高層析的條件可提高層析的分辨率分辨率2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss15親和層析具備的三要素親和層析具備的三要素 介質(zhì)介質(zhì)( (基質(zhì)基質(zhì))具有活化基團具有活化基團間隔臂 連接介質(zhì)與配體的分子 配體配體 具有識別能力具有識別能力 反配體反配體（分離物）（分離物） 與配體進(jìn)行可逆結(jié)合與配體進(jìn)行可逆結(jié)合2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss16 親和層析法的四要點：親和層析法的四要點：(2)SpecificBindingSubstance (S)溶溶 解解Elution(4)配配 體體Ligand (L)偶合反應(yīng)偶合反應(yīng) (3)Coupling Reaction雜雜 質(zhì)質(zhì)SSSS(1)

7、Solid MatrixS2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss17親和層析的特點：親和層析的特點： 條件溫和條件溫和: :不影響樣品的生不影響樣品的生物活性物活性, ,適合生物大分子的適合生物大分子的操作。操作。 純化效率高純化效率高: :一步法分離和一步法分離和純化混合物中的樣品純化混合物中的樣品, ,提純提純達(dá)幾千倍達(dá)幾千倍, ,得到高純度樣品。得到高純度樣品。 選擇性強選擇性強: :依據(jù)生物學(xué)特異依據(jù)生物學(xué)特異性性, ,而非物理化學(xué)性質(zhì)分離而非物理化學(xué)性質(zhì)分離原理原理. .故特異的層析圖為故特異的層析圖為2 2個峰個峰, ,第第1 1個為雜峰個為雜峰, ,第第2 2峰峰為純品。為純品。

8、柱層析柱小柱層析柱小 VtVt1 11.5ml1.5ml。上樣量大上樣量大, ,達(dá)達(dá) 1/2Vt1/2Vt體積并體積并對樣品的濃度與純度要求對樣品的濃度與純度要求不高。不高。 操作簡單操作簡單, ,時間快速。時間快速。 柱子填充載體昂貴柱子填充載體昂貴, ,配體的配體的特異性特異性, ,有時找不到適宜的有時找不到適宜的配體配體, ,不適合所有生物大分不適合所有生物大分子樣品。子樣品。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss18Activity 典型的親和層析操作：典型的親和層析操作：Elution volumeProteinpH 2.05*2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss19親和層析的特點：親

9、和層析的特點： 條件溫和條件溫和: :不影響樣品的生不影響樣品的生物活性物活性, ,適合生物大分子的適合生物大分子的操作操作 純化效率高純化效率高: :一步法分離和一步法分離和純化混合物中的樣品純化混合物中的樣品, ,提純提純達(dá)幾千倍達(dá)幾千倍, ,得到高純度樣品得到高純度樣品 選擇性強選擇性強: :依據(jù)生物學(xué)特異依據(jù)生物學(xué)特異性性, ,而非物理化學(xué)性質(zhì)分離而非物理化學(xué)性質(zhì)分離原理原理. .故特異的層析圖為故特異的層析圖為2 2個峰個峰, ,第第1 1個為雜峰個為雜峰, ,第第2 2峰峰為純品為純品 柱層析柱小柱層析柱小 VtVt1 11.5ml1.5ml。上樣量大上樣量大, ,達(dá)達(dá) 1/2Vt

10、1/2Vt體積并體積并對樣品的濃度與純度要求對樣品的濃度與純度要求不高。不高。 操作簡單操作簡單, ,時間快速。時間快速。 柱子填充載體昂貴柱子填充載體昂貴, ,配體的配體的特異性特異性, ,有時找不到適宜的有時找不到適宜的配體配體, ,不適合所有生物大分不適合所有生物大分子樣品子樣品。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss20內(nèi)容提要內(nèi)容提要第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理第二節(jié)第二節(jié) 操作操作第三節(jié)第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量提高吸附劑的操作容量第四節(jié)第四節(jié) 應(yīng)用實例應(yīng)用實例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss21第二節(jié)第二節(jié) 操作操作 一、理想基質(zhì)的性質(zhì)一、理想基質(zhì)的性質(zhì)結(jié)構(gòu)是松散的多孔網(wǎng)絡(luò)

11、，利于大分子的流動與滲透；結(jié)構(gòu)是松散的多孔網(wǎng)絡(luò)，利于大分子的流動與滲透；顆粒均勻的球形，剛性好顆粒均勻的球形，剛性好, ,不易溶性，操作壓的變化不易溶性，操作壓的變化不引起變形；不引起變形；物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；化學(xué)性質(zhì)是惰性，以降低非特異性的吸附；化學(xué)性質(zhì)是惰性，以降低非特異性的吸附；帶有豐富的化學(xué)基團易活化，以結(jié)合較多的配體；帶有豐富的化學(xué)基團易活化，以結(jié)合較多的配體；高度親水性，易與水溶液中的生物大分子結(jié)合；高度親水性，易與水溶液中的生物大分子結(jié)合；1.1. 抗微生物和酶的侵蝕?？刮⑸锖兔傅那治g。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss22具有實用價值的基質(zhì)具有實用價值的基質(zhì)

12、 纖維素：纖維素：用于抗體與酶的純化，如分離酪氨酸酶，酪用于抗體與酶的純化，如分離酪氨酸酶，酪氨酸酶的抑制劑連接到纖維素上，一步將酶純化幾百氨酸酶的抑制劑連接到纖維素上，一步將酶純化幾百倍。倍。 但其纖維性及非均一性限制了大分子的滲入但其纖維性及非均一性限制了大分子的滲入; ;有非有非專一性吸附。專一性吸附。 葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠：良好的化學(xué)及物理穩(wěn)定性，多孔性的結(jié)良好的化學(xué)及物理穩(wěn)定性，多孔性的結(jié)構(gòu)利于生物大分子的分離。構(gòu)利于生物大分子的分離。但其膨脹度變化大，應(yīng)用但其膨脹度變化大，應(yīng)用受限制。受限制。 聚丙烯酰胺凝膠：聚丙烯酰胺凝膠：物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，抗微生物侵蝕物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，抗微生

13、物侵蝕, ,可提供很多供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基，提高配基的濃度?？商峁┖芏喙┗瘜W(xué)反應(yīng)的酰胺基，提高配基的濃度。適合于配基和親和物之間親和力較弱的系統(tǒng)。適合于配基和親和物之間親和力較弱的系統(tǒng)。但不易但不易引入間隔臂，受到限制。引入間隔臂，受到限制。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss23其它實用性基質(zhì)其它實用性基質(zhì) 多孔玻璃：多孔玻璃：不受微生物的侵蝕，對有機溶劑和緩沖液的不受微生物的侵蝕，對有機溶劑和緩沖液的組成改變不敏感。保留表面含有羥基，在水溶液中顯輕組成改變不敏感。保留表面含有羥基，在水溶液中顯輕微負(fù)性的表面電荷，對酸性蛋白，病毒，多糖或核酸沒微負(fù)性的表面電荷，對酸性蛋白，病毒，多糖或核酸沒有

14、阻擋和吸附，而可以吸附所有的強堿性蛋白質(zhì)和一些有阻擋和吸附，而可以吸附所有的強堿性蛋白質(zhì)和一些中性蛋白質(zhì)及病毒。中性蛋白質(zhì)及病毒。 瓊脂糖：瓊脂糖：商品為商品為Sepharose 2B,4B,6BSepharose 2B,4B,6B表示表示2 2，4 4和和6 6的的瓊脂糖濃度的珠狀凝膠。其化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定性弱于葡聚瓊脂糖濃度的珠狀凝膠。其化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定性弱于葡聚糖和聚丙烯酰胺，熱穩(wěn)定性差，在糖和聚丙烯酰胺，熱穩(wěn)定性差，在pH4pH49 9的環(huán)境使用，的環(huán)境使用，在一定濃度的酸堿不導(dǎo)致凝膠顆粒的變化，不被有機溶在一定濃度的酸堿不導(dǎo)致凝膠顆粒的變化，不被有機溶劑（乙醇，丙酮）引起收縮，能經(jīng)受高濃度

15、變性劑而不劑（乙醇，丙酮）引起收縮，能經(jīng)受高濃度變性劑而不改變其吸附性能，故實用性廣。改變其吸附性能，故實用性廣。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss24二、配基（配體）的選擇二、配基（配體）的選擇 任何大分子或小分子蛋白、核酸（或其他分任何大分子或小分子蛋白、核酸（或其他分子）有特異結(jié)合的都可以作為配體；配體是子）有特異結(jié)合的都可以作為配體；配體是有一定局限性，只能特異性地與某一種物質(zhì)有一定局限性，只能特異性地與某一種物質(zhì)結(jié)合，而這種結(jié)合是可逆的，利用此性質(zhì)可結(jié)合，而這種結(jié)合是可逆的，利用此性質(zhì)可提取、純化與配體特異結(jié)合的物質(zhì)。提取、純化與配體特異結(jié)合的物質(zhì)。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院w

16、ss251.1.配體的選擇配體的選擇優(yōu)良的配體必須具備兩個條件：優(yōu)良的配體必須具備兩個條件： 配體與生物大分子具有合適的親和力配體與生物大分子具有合適的親和力; ; 配體具有與載體牢固地結(jié)合配體具有與載體牢固地結(jié)合, ,又不影響與生又不影響與生物大分子之間的親和力。物大分子之間的親和力。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss26配體的選擇配體的選擇 固定在固相載體上的配體具有與目的蛋白能夠選固定在固相載體上的配體具有與目的蛋白能夠選擇性地結(jié)合并形成穩(wěn)定復(fù)合物的能力。擇性地結(jié)合并形成穩(wěn)定復(fù)合物的能力。 復(fù)合物的穩(wěn)定性取決于配體與蛋白質(zhì)結(jié)合位點之復(fù)合物的穩(wěn)定性取決于配體與蛋白質(zhì)結(jié)合位點之間結(jié)合的緊密

17、程度。間結(jié)合的緊密程度。 足夠強的結(jié)合要求配體能夠精確的嵌合在結(jié)合位足夠強的結(jié)合要求配體能夠精確的嵌合在結(jié)合位點內(nèi)。點內(nèi)。 解離常數(shù)的范圍在解離常數(shù)的范圍在1010-5-51010-8-8/M/M時適合于親和層析時適合于親和層析過程。當(dāng)解離常數(shù)過程。當(dāng)解離常數(shù)1010-3-3 時，配體與蛋白質(zhì)的時，配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合力較弱，在層析過程中拉不牢目的蛋白，選結(jié)合力較弱，在層析過程中拉不牢目的蛋白，選擇性過低擇性過低; ;當(dāng)解離常數(shù)當(dāng)解離常數(shù) 1010-15-15 時，親和力太大，時，親和力太大，洗脫時得用激烈的和苛刻的、甚至是變性的條件。洗脫時得用激烈的和苛刻的、甚至是變性的條件。這對分離生物活性

18、樣品是忌諱的。這對分離生物活性樣品是忌諱的。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss272.2.配體的分類配體的分類 單特異性配體單特異性配體：只結(jié)合一個或很小數(shù)量的蛋白質(zhì)，識別：只結(jié)合一個或很小數(shù)量的蛋白質(zhì)，識別小分子的局限性強，甾體激素和酶抑制劑屬于此類配體。小分子的局限性強，甾體激素和酶抑制劑屬于此類配體。 大分子單特異性配體大分子單特異性配體：抗體抗原結(jié)合是大分子單特異：抗體抗原結(jié)合是大分子單特異性配體及其目的蛋白的最重要的例證。性配體及其目的蛋白的最重要的例證。 組特異性配體（通用性配體）：組特異性配體（通用性配體）：是指一類像輔酶、維生是指一類像輔酶、維生素素/ /輔因子或它們的類似物

19、，它們可以同幾種不同蛋白輔因子或它們的類似物，它們可以同幾種不同蛋白的共同位點相結(jié)合。是識別一類小分子物質(zhì)的配體。的共同位點相結(jié)合。是識別一類小分子物質(zhì)的配體。 大分子組特異性配體大分子組特異性配體: :是識別一類大分子物質(zhì)的配體。是識別一類大分子物質(zhì)的配體。凝集素和一些免疫球蛋白結(jié)合蛋白、伴刀豆球蛋白與糖凝集素和一些免疫球蛋白結(jié)合蛋白、伴刀豆球蛋白與糖蛋白結(jié)合等。蛋白結(jié)合等。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss28常用配體常用配體分離對象分離對象酶蛋白酶蛋白基質(zhì)類似物、抑制劑、輔酶、底物、產(chǎn)物等基質(zhì)類似物、抑制劑、輔酶、底物、產(chǎn)物等抗抗 體體抗原、病毒、細(xì)胞抗原、病毒、細(xì)胞外源凝集素外源凝集

20、素多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體、結(jié)合蛋白多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體、結(jié)合蛋白核核 酸酸互補堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶、結(jié)合互補堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶、結(jié)合蛋白蛋白激素及維生素激素及維生素受體、載體蛋白受體、載體蛋白細(xì)細(xì) 胞胞細(xì)胞表面特異性蛋白、外源凝集素細(xì)胞表面特異性蛋白、外源凝集素專一性結(jié)合的生物體系專一性結(jié)合的生物體系2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss29配體配體待純化的蛋白質(zhì)待純化的蛋白質(zhì)配體配體待純化的蛋白質(zhì)待純化的蛋白質(zhì)抗原抗原特定單克隆抗體或多特定單克隆抗體或多克隆抗體克隆抗體肝素肝素凝聚因子、脂酶、結(jié)凝聚因子、脂酶、結(jié)締組織蛋白酶、締組織蛋白酶、DNADNA聚聚合酶合酶單

21、克隆抗體單克隆抗體特定抗原特定抗原膽固醇膽固醇膽固醇受體、膽固醇膽固醇受體、膽固醇結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)A/A/蛋白蛋白質(zhì)質(zhì)G G免疫球蛋白免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸脂肪酸結(jié)合蛋白、白脂肪酸結(jié)合蛋白、白蛋白蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑蛋白酶蛋白酶核苷酸核苷酸核苷酸結(jié)合蛋白、需核苷酸結(jié)合蛋白、需核苷酸的酶核苷酸的酶磷酸磷酸磷酸酶磷酸酶苯基硼酸苯基硼酸鹽鹽糖蛋白糖蛋白三嗪染料三嗪染料脫氫酶、激酶、聚合脫氫酶、激酶、聚合酶、限制酶、干擾素酶、限制酶、干擾素凝集素凝集素糖蛋白糖蛋白抗生物素蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶含生物素的酶糖糖凝集素、糖苷酶凝集素、糖苷酶蛋白質(zhì)親和層析中的合適配體蛋白質(zhì)親和層析

22、中的合適配體2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss302022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss31三、親和吸附劑的制備三、親和吸附劑的制備 一般用一般用CNBrCNBr衍生載體的功能基衍生載體的功能基團，產(chǎn)生的親電基團可以同配團，產(chǎn)生的親電基團可以同配體的親核基團（體的親核基團（-NH-NH2 2,-SH,-SH，OHOH）反應(yīng)?；蛘呦喾础＃┓磻?yīng)。或者相反。 用物理與化學(xué)的方法把配體偶用物理與化學(xué)的方法把配體偶聯(lián)到基質(zhì)上?；瘜W(xué)偶聯(lián)法是通聯(lián)到基質(zhì)上。化學(xué)偶聯(lián)法是通過配體對活化的載體材料進(jìn)行過配體對活化的載體材料進(jìn)行親核攻擊實現(xiàn)的親核攻擊實現(xiàn)的. . 測定配體結(jié)合量，每測定配體結(jié)合量，每mLmL或每或每

23、g g載體束縛配體的量載體束縛配體的量mgmg（mg/mLmg/mL）。一般用直接法和）。一般用直接法和間接法測定。間接法測定。 測定方法測定方法 載體的活化載體的活化 配體的偶聯(lián)配體的偶聯(lián) 結(jié)合能力的測定結(jié)合能力的測定2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss32用溴化氰活化載體用溴化氰活化載體2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss332022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss34四、四、特異性吸附特異性吸附 欲分離物質(zhì)與親和吸附劑結(jié)合，當(dāng)結(jié)合量較欲分離物質(zhì)與親和吸附劑結(jié)合，當(dāng)結(jié)合量較強時，配體與有效成分緊密結(jié)合，隨著樣品的加強時，配體與有效成分緊密結(jié)合，隨著樣品的加入，親和成分恒定增加并不斷地吸附上柱，

24、形成入，親和成分恒定增加并不斷地吸附上柱，形成致密的復(fù)合物帶，使吸附容量增至最大，達(dá)到飽致密的復(fù)合物帶，使吸附容量增至最大，達(dá)到飽和。影響吸附容量除親和力外和還與和。影響吸附容量除親和力外和還與pHpH、離子強、離子強度有關(guān)。例：度有關(guān)。例：P120P120復(fù)合物帶復(fù)合物帶2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss35 樣品中有效成分樣品中有效成分在親和吸附劑上的在親和吸附劑上的吸附量，除了與它吸附量，除了與它們之間的親和力有們之間的親和力有密切關(guān)系外，還與密切關(guān)系外，還與樣品的樣品的pHpH值和離子值和離子強度強度有關(guān)系。有關(guān)系。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss36五、層析步驟五、層析步驟 樣

25、品制備樣品制備 結(jié)合步驟結(jié)合步驟 裝柱操作裝柱操作 流速控制流速控制 洗脫方法洗脫方法 淋洗淋洗 洗脫目標(biāo)樣品洗脫目標(biāo)樣品 柱子再生柱子再生選擇配體選擇配體凝膠與配體偶聯(lián)凝膠與配體偶聯(lián)柱子平衡柱子平衡2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss371.1.樣品制備樣品制備 除去顆粒、細(xì)胞碎片、膜片段等；除去顆粒、細(xì)胞碎片、膜片段等； 樣品的濃縮、除去蛋白酶及其抑制劑；樣品的濃縮、除去蛋白酶及其抑制劑； 可以通過鹽析方法沉淀雜蛋白或離子可以通過鹽析方法沉淀雜蛋白或離子交換層析法對樣品進(jìn)行預(yù)處理。交換層析法對樣品進(jìn)行預(yù)處理。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss382.2.結(jié)合步驟結(jié)合步驟 目標(biāo)蛋白質(zhì)對配體

26、的特異性結(jié)合需要最適合的目標(biāo)蛋白質(zhì)對配體的特異性結(jié)合需要最適合的pHpH、緩沖液鹽濃度、離子強度。緩沖液鹽濃度、離子強度。pHpH起著調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白起著調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子以及配體分子的電荷基團性質(zhì)的作用。質(zhì)分子以及配體分子的電荷基團性質(zhì)的作用。 中等鹽濃度（中等鹽濃度（0.10.10.15mol/L NaCl0.15mol/L NaCl）可以穩(wěn)定溶）可以穩(wěn)定溶液中的蛋白質(zhì)并防止非特異性的作用。液中的蛋白質(zhì)并防止非特異性的作用。 高鹽濃度（高鹽濃度（2mol/L(NH2mol/L(NH4 4) )2 2SOSO4 4）能特異性地提高配）能特異性地提高配體和靶蛋白的疏水作用。體和靶蛋白的疏水作用。

27、EDTA(10mmol/L)EDTA(10mmol/L)用以穩(wěn)定蛋白質(zhì)中能被重金屬催用以穩(wěn)定蛋白質(zhì)中能被重金屬催化氧化的化氧化的SHSH基?；?022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss393.3.柱操作柱操作 選用柱的大小依據(jù)選用柱的大小依據(jù)a.a.吸附劑的容量；吸附劑的容量；b.b.需要純化需要純化的蛋白質(zhì)的量。的蛋白質(zhì)的量。 由于親和原理，可分離的容量大。樣品量可達(dá)由于親和原理，可分離的容量大。樣品量可達(dá) 柱體積。為提高分離效率，一般選用粗、短柱。柱體積。為提高分離效率，一般選用粗、短柱?？傮w積只需總體積只需1 15ml5ml。 若靶蛋白是較低的結(jié)合常數(shù)若靶蛋白是較低的結(jié)合常數(shù)1010-4-4

28、/M/M可用較長的可用較長的柱，結(jié)合較牢、結(jié)合常數(shù)柱，結(jié)合較牢、結(jié)合常數(shù)1010-13-13 /M /M則選用短柱。則選用短柱。122022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss404.4.樣品上柱流速的控制樣品上柱流速的控制 在概念上，親和層析的流速比較快，要求不嚴(yán)格。在概念上，親和層析的流速比較快，要求不嚴(yán)格。但為了使純化的蛋白質(zhì)能得到尖的洗脫峰和最小但為了使純化的蛋白質(zhì)能得到尖的洗脫峰和最小的稀釋度及最大的回收率。故上樣品時使用低流的稀釋度及最大的回收率。故上樣品時使用低流速。速。A.A.太高的流速會降低分離效果和容量；太高的流速會降低分離效果和容量；B.B.用可溶性配體用可溶性配體/ /類似物進(jìn)

29、行競爭性洗脫時，解離動類似物進(jìn)行競爭性洗脫時，解離動力學(xué)可能成為速率限制；力學(xué)可能成為速率限制；C.C.親和柱的線性流速需進(jìn)行優(yōu)化達(dá)到最大的結(jié)合容親和柱的線性流速需進(jìn)行優(yōu)化達(dá)到最大的結(jié)合容量和最佳的分離。量和最佳的分離。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss415.5.洗脫方法洗脫方法2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss42 大體積的平衡緩沖液洗脫親和力較小的分子；大體積的平衡緩沖液洗脫親和力較小的分子； 親和力稍大時，線性梯度、階梯分步洗脫；親和力稍大時，線性梯度、階梯分步洗脫； 可改變可改變pHpH、離子強度實現(xiàn)特異性的競爭，解吸已結(jié)合的、離子強度實現(xiàn)特異性的競爭，解吸已結(jié)合的分子；分子；

30、對親和力特別大的復(fù)合物，除用高濃度的可溶性配體洗對親和力特別大的復(fù)合物，除用高濃度的可溶性配體洗脫外，還需脫外，還需6mol/L6mol/L鹽酸胍、鹽酸胍、pH1.5pH1.5，使復(fù)合物在合理的，使復(fù)合物在合理的時間內(nèi)解離。并不破壞靶蛋白的天然構(gòu)象及生物活性。時間內(nèi)解離。并不破壞靶蛋白的天然構(gòu)象及生物活性。以及洗脫后的除鹽。以及洗脫后的除鹽。用用NaClNaCl梯度洗脫特異的靜電作用結(jié)合的蛋白質(zhì)；梯度洗脫特異的靜電作用結(jié)合的蛋白質(zhì)；疏水結(jié)合的復(fù)合物，加入乙二醇降低水溶液的極性；疏水結(jié)合的復(fù)合物，加入乙二醇降低水溶液的極性；用變性劑解離疏水結(jié)合的復(fù)合物。用變性劑解離疏水結(jié)合的復(fù)合物。2022-5

31、-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss43A.特異性洗脫：特異性洗脫： 凡是能與配體競爭酶的游離配體，都十分強烈凡是能與配體競爭酶的游離配體，都十分強烈地影響著結(jié)合酶的洗脫過程。游離配體濃度若與地影響著結(jié)合酶的洗脫過程。游離配體濃度若與配體濃度相同，則可直接從基質(zhì)上洗脫小結(jié)合的配體濃度相同，則可直接從基質(zhì)上洗脫小結(jié)合的酶。同時應(yīng)根據(jù)酶與配體親和力的大小確定洗脫酶。同時應(yīng)根據(jù)酶與配體親和力的大小確定洗脫液的濃度。液的濃度。B.非特異性洗脫：非特異性洗脫： 通過改變洗脫液的條件（通過改變洗脫液的條件（pHpH、離子強度、溫度、離子強度、溫度和介電常數(shù)），即能改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，降低蛋和介電常數(shù)），即能改變蛋白質(zhì)的

32、構(gòu)象，降低蛋白質(zhì)與配體的親和力、不損害蛋白質(zhì)與吸附劑的白質(zhì)與配體的親和力、不損害蛋白質(zhì)與吸附劑的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss446.6.洗脫步驟洗脫步驟淋洗淋洗 樣品吸附上柱后，須用幾倍體積的起始緩沖液淋洗樣品吸附上柱后，須用幾倍體積的起始緩沖液淋洗柱子，去除所有不結(jié)合的物質(zhì)，非特異性結(jié)合的成分柱子，去除所有不結(jié)合的物質(zhì)，非特異性結(jié)合的成分可用稍微增加離子強度的條件除掉?？捎蒙晕⒃黾与x子強度的條件除掉。洗脫洗脫 為使靶蛋白在最小的體積內(nèi)回收，其生物化學(xué)性質(zhì)保為使靶蛋白在最小的體積內(nèi)回收，其生物化學(xué)性質(zhì)保持不變?；痉椒ㄊ怯弥械葷舛龋ǔ植蛔儭；痉椒ㄊ怯弥械葷舛龋?.20

33、.21mol/L1mol/L）的）的可溶性配體或類似物在溫和條件下（中性可溶性配體或類似物在溫和條件下（中性pHpH）競爭性）競爭性的結(jié)合蛋白。的結(jié)合蛋白。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss457.7.親和層析柱的再生親和層析柱的再生 當(dāng)洗脫結(jié)束后，應(yīng)連續(xù)用大量的洗脫液當(dāng)洗脫結(jié)束后，應(yīng)連續(xù)用大量的洗脫液或高濃度的鹽溶液徹底洗滌柱子，接著再用平或高濃度的鹽溶液徹底洗滌柱子，接著再用平衡緩沖液使層析柱重新平衡。經(jīng)過這樣處理的衡緩沖液使層析柱重新平衡。經(jīng)過這樣處理的柱子可再次上樣，進(jìn)行第二次親和層析。一般柱子可再次上樣，進(jìn)行第二次親和層析。一般親和層析柱都可以反復(fù)使用多次。親和層析柱都可以反復(fù)使用

34、多次。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss46內(nèi)容提要內(nèi)容提要第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理第二節(jié)第二節(jié) 操作操作第三節(jié)第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量提高吸附劑的操作容量第四節(jié)第四節(jié) 應(yīng)用實例應(yīng)用實例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss47第三節(jié)第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量提高吸附劑的操作容量親和吸附劑的操作容量，受以下因素的影響：親和吸附劑的操作容量，受以下因素的影響：l 配體性質(zhì)配體性質(zhì)l 配體在吸附劑中的含量配體在吸附劑中的含量l 配體與吸附物結(jié)合時的位阻效應(yīng)大小配體與吸附物結(jié)合時的位阻效應(yīng)大小l 基質(zhì)的多孔性基質(zhì)的多孔性l 操作條件等操作條件等2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss48一、

35、引入間隔手臂一、引入間隔手臂 親和層析中經(jīng)常使用親和層析中經(jīng)常使用小分子化合物小分子化合物作為配體作為配體制備親和吸附劑，但小分子配體直接連接于瓊脂制備親和吸附劑，但小分子配體直接連接于瓊脂糖上產(chǎn)生無效吸附劑，其原因是由于載體的空間糖上產(chǎn)生無效吸附劑，其原因是由于載體的空間位阻關(guān)系，使大分子化合物（親和物）不能直接位阻關(guān)系，使大分子化合物（親和物）不能直接接觸到配體。因此，通過在載體與配體之間引入接觸到配體。因此，通過在載體與配體之間引入適當(dāng)長度的適當(dāng)長度的“手臂手臂”減少載體的空間位阻，增加減少載體的空間位阻，增加配體的活動度。常見的間隔臂是配體的活動度。常見的間隔臂是6 68 8個碳原子的

36、個碳原子的碳?xì)滏?，基質(zhì)到配體的長度為碳?xì)滏?，基質(zhì)到配體的長度為0.50.51nm1nm；或用長；或用長達(dá)達(dá)1717個碳原子。個碳原子。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss492022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss50間隔臂間隔臂: :不同長度的間隔臂（不同長度的間隔臂（B B1nm1nm）(C=2.1nm)(C=2.1nm)對靶酶的親和力的差異對靶酶的親和力的差異對氨基苯對氨基苯-硫代吡喃半乳糖苷硫代吡喃半乳糖苷氨乙基乙酰胺氨乙基乙酰胺2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss51間隔臂的分類間隔臂的分類1.疏水間隔臂疏水間隔臂2.2.親水間隔臂親水間隔臂3.3.大分子間隔臂大分子間隔臂間隔臂與配體的

37、偶聯(lián)間隔臂與配體的偶聯(lián)親核基團（氨基、硫醇、羥基）；親核基團（氨基、硫醇、羥基）；親電子基團（還亞胺碳酸、還氧親電子基團（還亞胺碳酸、還氧乙烷、重氮鹽、酚、芳香胺及活乙烷、重氮鹽、酚、芳香胺及活性羰基）。性羰基）。通用配體：通用配體：腺嘌呤和核苷酸輔酶：腺嘌呤和核苷酸輔酶：用于純化用于純化各種激酶、脫氫酶。各種激酶、脫氫酶。多核苷酸：多核苷酸：純化與其親和的蛋白純化與其親和的蛋白質(zhì)、酶、動物病毒和病毒的質(zhì)、酶、動物病毒和病毒的RNARNA序列及互補的聚核苷酸。序列及互補的聚核苷酸。1.1. 輔酶：輔酶：用于純化親和性的各種酶用于純化親和性的各種酶類。類。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss52

38、二、增加配體取代的程度二、增加配體取代的程度 基質(zhì)的活性基團增多，配體結(jié)合量增加，操作基質(zhì)的活性基團增多，配體結(jié)合量增加，操作容量亦大；由于位阻效應(yīng)而影響配體的偶聯(lián)量，容量亦大；由于位阻效應(yīng)而影響配體的偶聯(lián)量，故控制偶聯(lián)反應(yīng)的條件可增加配體的偶聯(lián)數(shù)量。故控制偶聯(lián)反應(yīng)的條件可增加配體的偶聯(lián)數(shù)量。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss532022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss54三、減少結(jié)合鍵增加配體與蛋白質(zhì)的互補效三、減少結(jié)合鍵增加配體與蛋白質(zhì)的互補效應(yīng)應(yīng) 以蛋白質(zhì)與多肽為配體時，以最少的共價鍵連接至以蛋白質(zhì)與多肽為配體時，以最少的共價鍵連接至載體，利于保護(hù)蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)及生物活性；載體，利于保護(hù)

39、蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)及生物活性； 控制偶聯(lián)反應(yīng)的控制偶聯(lián)反應(yīng)的pHpH，減少蛋白質(zhì)分子與基質(zhì)連接的，減少蛋白質(zhì)分子與基質(zhì)連接的鍵；位點的減少，可以結(jié)合更多的蛋白質(zhì)，提高結(jié)鍵；位點的減少，可以結(jié)合更多的蛋白質(zhì)，提高結(jié)合容量。合容量。四、殘留活化基團的封閉四、殘留活化基團的封閉 封閉多余的活化基團，避免非特異性吸附。封閉多余的活化基團，避免非特異性吸附。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss55結(jié)結(jié) 論論 親和層析一般采用親和層析一般采用柱層析柱層析方法；方法； 親和柱的親和柱的平衡緩沖液的組成平衡緩沖液的組成、pHpH、離子強度；選擇親、離子強度；選擇親和物雙方作用強，有利于形成絡(luò)合物的條件；最緊密和

40、物雙方作用強，有利于形成絡(luò)合物的條件；最緊密的絡(luò)合物不容易解離，應(yīng)考慮避開某些條件；的絡(luò)合物不容易解離，應(yīng)考慮避開某些條件； 選用選用近中性近中性pHpH為親和吸附條件，上樣液與柱平衡液一為親和吸附條件，上樣液與柱平衡液一致致; ; 避免生物大分子的失活避免生物大分子的失活，親和吸附可在，親和吸附可在44進(jìn)行；進(jìn)行； 增加吸附容量增加吸附容量，上樣品速度盡量慢；，上樣品速度盡量慢； 用用大量的平衡緩沖液大量的平衡緩沖液洗去雜質(zhì)，及非專一性的吸附，洗去雜質(zhì)，及非專一性的吸附，柱上保留專一的親和樣品；柱上保留專一的親和樣品； 洗脫液的條件與吸附條件相反，減弱配體與蛋白的親洗脫液的條件與吸附條件相反

41、，減弱配體與蛋白的親和力，使絡(luò)合物完全解離。和力，使絡(luò)合物完全解離。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss56內(nèi)容提要內(nèi)容提要第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理第二節(jié)第二節(jié) 操作操作第三節(jié)第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量提高吸附劑的操作容量第四節(jié)第四節(jié) 應(yīng)用實例應(yīng)用實例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss57第四節(jié)第四節(jié) 應(yīng)用應(yīng)用A.A.不保留峰不保留峰B.B.脫附峰脫附峰縱坐標(biāo)示吸收值縱坐標(biāo)示吸收值橫坐標(biāo)示洗脫體積橫坐標(biāo)示洗脫體積 親和層析的基礎(chǔ)是對蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性的吸附親和層析的基礎(chǔ)是對蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性的吸附脫附，一般的結(jié)果是層析圖譜上出現(xiàn)二個層析峰，脫附，一般的結(jié)果是層析圖譜上出現(xiàn)二個層析峰，不保

42、留峰與脫附峰，脫附動力學(xué)一般較慢，脫附不保留峰與脫附峰，脫附動力學(xué)一般較慢，脫附的層析峰寬而拖尾。的層析峰寬而拖尾。VeVeA280A2802022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss58親和層析應(yīng)用親和層析應(yīng)用一、純化特異性生物分子一、純化特異性生物分子1.1.純化抗原、抗體及其結(jié)合物；純化抗原、抗體及其結(jié)合物；2.2.分離糖蛋白、各種凝集素；分離糖蛋白、各種凝集素；3.3.含巰基蛋白質(zhì)的分離；含巰基蛋白質(zhì)的分離；4.4.用寡聚核苷酸分離核酸；用寡聚核苷酸分離核酸；5.5.凝集素配體結(jié)合膜蛋白的分離技術(shù)。凝集素配體結(jié)合膜蛋白的分離技術(shù)。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss59親和吸附劑親和吸附劑 ：

43、基質(zhì)間隔臂抗體：基質(zhì)間隔臂抗體( (抗原抗原) )組成組成, ,用于鑒定、分離、純化樣品用于鑒定、分離、純化樣品中的抗原中的抗原( (抗體抗體) )1.1.抗原、抗抗原、抗體的純化體的純化2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss60Protein AProtein A對對IgGIgG類物質(zhì)有較大的束縛力，加之免疫球蛋白被類物質(zhì)有較大的束縛力，加之免疫球蛋白被束縛之后仍保留了束縛之后仍保留了IgGIgG束縛抗原的特性。所以利用結(jié)合束縛抗原的特性。所以利用結(jié)合IgGIgG的的Protein A-Sepharose CL-4BProtein A-Sepharose CL-4B吸附劑還可分離吸附劑還可分離

44、特異性的抗原。特異性的抗原。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss61免疫親和層析免疫親和層析 小鼠血清不同亞型小鼠血清不同亞型IgG IgG 的分離的分離1m1的的A蛋白蛋白Sepharose CL-4B柱用柱用1.5mol/L的甘氨酸的甘氨酸-NaOH，pH 8.9的緩沖液的緩沖液(內(nèi)含內(nèi)含3molL NaCl)平衡平衡 5m1小鼠血清同等體積的平衡液稀釋后上柱小鼠血清同等體積的平衡液稀釋后上柱 洗去不吸附的蛋白質(zhì)洗去不吸附的蛋白質(zhì) 用不同用不同pH的的0.1mol/L檸檬酸洗脫檸檬酸洗脫 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss62 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss632.2.純化糖類分子

45、純化糖類分子 配體為外源凝集素的配體為外源凝集素的Sepharose6BSepharose6B的的親和層析介質(zhì)，特異地結(jié)合碳水化親和層析介質(zhì)，特異地結(jié)合碳水化合物的糖類殘基或糖化細(xì)胞膜組分、合物的糖類殘基或糖化細(xì)胞膜組分、細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及糖蛋白等。細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及糖蛋白等。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss64凝集素和糖蛋白的親和層析分離凝集素和糖蛋白的親和層析分離 凝集素凝集素是在自然界廣泛存在的一大類糖是在自然界廣泛存在的一大類糖結(jié)合蛋白。它們結(jié)合蛋白。它們具有不同的糖結(jié)合專一性具有不同的糖結(jié)合專一性。利。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖鏈用天然存在的一些多糖和被固定化的不同

46、糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白，可以有效地分離純化不同型的結(jié)構(gòu)的糖蛋白，可以有效地分離純化不同型的凝集素，也可應(yīng)用固定化的凝集素分離純化各凝集素，也可應(yīng)用固定化的凝集素分離純化各種糖蛋白。種糖蛋白。 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss65用用10mmol/L的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液(pH7.0，含，含0.15mol/LNaCl)平衡酸處理平衡酸處理的的Sepharose 6B(AT-6B) 天花粉的丙酮粉制劑用平衡液抽提后，上天花粉的丙酮粉制劑用平衡液抽提后，上AT-6B柱柱 洗去不吸附的雜蛋白洗去不吸附的雜蛋白 用用0.2mol/L的半乳糖溶液洗脫花粉凝集素的半乳糖溶液洗脫花粉凝集素 .用含有半乳糖的天

47、然多糖用含有半乳糖的天然多糖- -瓊脂糖瓊脂糖的交聯(lián)產(chǎn)物分離天花粉凝集素的交聯(lián)產(chǎn)物分離天花粉凝集素2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss66 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss67.糖蛋白親和層析糖蛋白親和層析 不同的糖蛋白具有不同的單相組分和糖鏈結(jié)構(gòu)，不同的糖蛋白具有不同的單相組分和糖鏈結(jié)構(gòu)，它們和不同的凝集素呈現(xiàn)出不同的結(jié)合能力。它們和不同的凝集素呈現(xiàn)出不同的結(jié)合能力。 常用的凝集素常用的凝集素 ： Con A Con A 、LCA LCA 對甘露糖專一對甘露糖專一 WGA WGA 對對N-N-乙酰氨基葡萄糖專一乙酰氨基葡萄糖專一2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss68u人血色素結(jié)合蛋白人

48、血色素結(jié)合蛋白(hemopexin)(hemopexin)的分離的分離 用用50m mol/L的磷酸緩沖液，的磷酸緩沖液，pH 7.0(含含0.2mol/LNaCl)平衡平衡 固定固定化的化的WGA柱柱離子交換層析得到含有離子交換層析得到含有血血色素結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白色素結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的級分的級分上柱上柱平衡液洗脫不結(jié)合在柱上的轉(zhuǎn)平衡液洗脫不結(jié)合在柱上的轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵蛋白 含有含有100 mgm1 N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖的平衡液洗脫血色素結(jié)合蛋白的平衡液洗脫血色素結(jié)合蛋白 回收率達(dá)回收率達(dá)91 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss692022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss70AAAAA

49、AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA帶帶PolyU (T) 的親和吸附劑的親和吸附劑分離含分離含PolyA尾巴的尾巴的mRNA3.3.分離核酸分離核酸2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss712022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss72SDS-PAGE4.4.以親和層析法純化以親和層析法純化 TrypsinTrypsin：CHOMTrypsinA B C&D Disc-PAGEA B C = D以凝膠電泳鑒定親和層析以凝膠電泳鑒定親和層析操作過程各步驟的樣本操作過程各步驟的樣本Chitin2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss7

50、3酶和蛋白類型抑制劑的親和層析酶和蛋白類型抑制劑的親和層析 一些一些酶及其抑制劑間存在著非常專一的相互作酶及其抑制劑間存在著非常專一的相互作用用。一些酶的抑制劑被固定化以后，就可用于一些。一些酶的抑制劑被固定化以后，就可用于一些酶的分離純化。一些固定化的酶也被應(yīng)用于蛋白類酶的分離純化。一些固定化的酶也被應(yīng)用于蛋白類型的抑制劑的分離。型的抑制劑的分離。 為了避免為了避免位阻現(xiàn)象位阻現(xiàn)象，在酶類的小分子抑制劑固，在酶類的小分子抑制劑固定化時，常要定化時，常要插入一些不同長度的插入一些不同長度的“手臂手臂” ，如，如插入插入8-98-9個原子。個原子。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss745.5.受體蛋白的純化受體蛋白的純化 由于受體蛋白在激素與其互補的膜結(jié)合由于受體蛋白在激素與其互補的膜結(jié)合中的重要作用，同時其含量極低，使研中的重要作用，同時其含量極低，使研究受阻。利用親和層析法分離受體蛋白究受阻。利用親和層析法分離受體蛋白成為可能。成為可能。 例：胰島素受體蛋白的純化：將胰島素例：胰島素受體蛋白的純化：將胰島素偶聯(lián)到溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，結(jié)合偶聯(lián)到溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，結(jié)合受體蛋白，特異性洗脫，釋放出目標(biāo)蛋受體蛋白