冷凍干燥或交聯(lián)制胰島素-殼聚糖納米顆粒的設(shè)計(jì),表征和生物效率譯文

1、冷凍干燥或交聯(lián)制胰島素-殼聚糖納米顆粒的設(shè)計(jì),表征和生物效率M.Diopa,N.Aubervalb,A.Viciglioa,A.Langloisa,W.Bietigera,C.Muraa,C.Peroneta,A.Bekel,D.JulienDavid,M.Zhao,M.Pinget,N.Jeandidier,C.Vauthier,E.Marchionic,Y.Frere）S.Sigrista*摘要：胰島素口服給藥是理想的給藥方式，但是由于胃腸道的苛刻條件沒(méi)有效果。使用封裝在自組裝顆粒中的胰島素的保護(hù)是有希望的方法。然而，這種顆粒在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性缺乏導(dǎo)致口服給藥后封裝的胰島素的生物利用度低

2、。這項(xiàng)研究的目的是評(píng)價(jià)冷凍干燥和交聯(lián)兩種穩(wěn)定策略的單獨(dú)或聯(lián)合作用，對(duì)胰島素負(fù)載的殼聚糖納米粒的影響，并確定其體外和體內(nèi)的生物有效性。通過(guò)胰島素和殼聚糖之間的復(fù)合凝聚制備納米粒，通過(guò)與三聚磷酸鈉溶液（TPP）交聯(lián)或冷凍-干燥或兩種方法同時(shí)處理而穩(wěn)定。體外納米顆粒吸收的生物有效性通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)上皮模型（Caco-2/RevHT29MTX（粘液分泌細(xì)胞）評(píng)估。在體內(nèi)，納米顆粒通過(guò)導(dǎo)管注射在對(duì)胰島素缺乏的大鼠的腹膜或十二指腸。與不影響納米顆粒電荷但降低納米顆粒尺寸（-25%）的交聯(lián)相比，凍干在尺寸和電荷上增加（+15%vscontrol4127而；+36仕3mV）。當(dāng)兩種方法組合時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)水平相比，

3、連續(xù)處理降低納米顆粒大小并增加電荷。沒(méi)有冷凍干燥的，其中60%的納米顆粒在2小時(shí)后被破壞，與沒(méi)有冷凍干燥的相比，冷凍干燥是必需的，用以防止納米顆粒在腸環(huán)境中的破壞。另外冷凍干燥結(jié)合交聯(lián)處理時(shí)提高了納米顆粒的生物效率，當(dāng)存在粘液時(shí)細(xì)胞中的攝取增加。在體內(nèi)兩種處理的組合顯示了其對(duì)胰島素的保護(hù)，當(dāng)施用納米顆粒時(shí)具有降低血糖的作用。這項(xiàng)工作表明，冷凍干燥和交聯(lián)處理的組合是必要的，以在體外和體內(nèi)胰島素的遞送中穩(wěn)定（冷凍干燥）和增加自組裝納米顆粒的生物效率（交聯(lián)）。關(guān)鍵詞：殼聚糖胰島素納米顆?？诜?fù)合凝聚1 .介紹皮下胰島素注射廣泛用于糖尿病治療。然而，注射通常是痛苦的，導(dǎo)致患者依從性低（Al-Tabak

4、haandArida,2008）。通過(guò)最大限度地減少注射，可以增加患者依從性，從而提高治療療效。口服給藥是遞送藥物方便舒適的方法，因?yàn)槠湎伺c注射相關(guān)的疼痛和創(chuàng)傷。然而，由于胃腸道的惡劣條件，口服給藥會(huì)使胰島素在到達(dá)血流之前使蛋白質(zhì)變性。例如，小于0.1%的口服胰島素可以完好的地到達(dá)血流(FossandPeppas,20Q4。止匕外，低pH和蛋白酶介導(dǎo)的水解限制了完整胰島素的腸吸收(Aokietal.,2005)和轉(zhuǎn)運(yùn)到體循環(huán)中。因此，為了開發(fā)有效的口服糖尿病治療劑，保護(hù)胰島素抵抗胃腸環(huán)境是必要的。已經(jīng)開發(fā)了改善胰島素?cái)z取的方法，包括吸收促進(jìn)劑，化學(xué)修飾和納米膠囊或納米球中的包封。聚合物膠體

5、系統(tǒng)在治療性蛋白質(zhì)的口服遞送中表現(xiàn)出一定程度的成功。正在進(jìn)行許多研究以改善使用遞送系統(tǒng)的生物活性大分子的口服生物利用度。由天然聚合物，例如殼聚糖配制的納米顆粒(NPs)作為蛋白質(zhì)的載體是有利益的(Sarmentoetal.,2007)。殼聚糖對(duì)于納米顆粒開發(fā)具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括生物相容性，生物降解性，低免疫原性和毒性(Agnihotrietal.,2004；Pandeyetal.,2005)。殼聚糖的粘膜粘附性質(zhì)與其高正電荷密度有關(guān)(Plapiedetal.,2010)。因此，殼聚糖是藥物遞送到粘膜組織的理想物質(zhì)(Sayinetal.,2009)。殼聚糖主鏈上的許多游離胺基團(tuán)產(chǎn)生有利的性質(zhì)，允許

6、在藥物遞送應(yīng)用中廣泛使用。在酸性環(huán)境中，納米顆粒自發(fā)形成，由于帶正電荷和帶負(fù)電荷的物質(zhì)之間的分子內(nèi)和分子間連接(Veis,2011),其形成聚電解質(zhì)復(fù)合物(復(fù)合凝聚)。這個(gè)過(guò)程基于自組裝的殼聚糖和胰島素納米顆粒，似乎有希望在不使用苛刻的有機(jī)化學(xué)品的情況下制備納米顆粒。通過(guò)離子對(duì)和靜電相互作用形成的納米顆粒保留聚合物完整性。包括胰島素在內(nèi)的蛋白質(zhì)的胃腸攝取可以通過(guò)包裹在納米顆粒中來(lái)改善，納米顆粒保護(hù)胰島素免于降解。這些載體具有改善的口服肽遞送，這是由于它們?cè)谖改c道中的長(zhǎng)期保留和由游離氨基介導(dǎo)的對(duì)粘液層的良好滲透(Renukuntlaetal.,201。正電荷可以與許多帶負(fù)電荷的表面反應(yīng)，包括細(xì)胞

7、膜，粘液襯里中的唾液酸和陰離子聚合物。這些顆粒系統(tǒng)還對(duì)帶負(fù)電荷的大分子(Mohammadpourdounighietal.,2010)顯示高親和力，例如粘膜表面上的粘蛋白。止匕外，它們被腸細(xì)胞吸收，腸吸收是主要的吸收途徑。然而，殼聚糖是非腸溶聚合物。因此，殼聚糖納米顆粒不能在胃環(huán)境中保護(hù)胰島素。在專利CA2522868(Belcourtetal.,2004)中提出了一種解決方案，其描述了基于含有保護(hù)腸中活性成分的納米顆粒的胃阻力制劑的雙重包封系統(tǒng)。在以前的研究中，我們開發(fā)了適合于大鼠十二指腸特異性藥物遞送的腸溶膠囊(Reixetal.,2012),其可以填充胰島素-殼聚糖納米顆粒。在本研究中，

8、我們?cè)u(píng)估了殼聚糖納米顆粒在腸道條件下保護(hù)胰島素的能力(ChaudhuryandDas,2010)。然而，眾所周知，在含有磷酸鹽的環(huán)境中，復(fù)合凝聚是不穩(wěn)定的。因此，這些復(fù)合物用作藥物載體穩(wěn)定。與三聚磷酸鈉（TPP）的交聯(lián)和冷凍干燥可能是一個(gè)有利的解決方案。三聚磷酸鈉是具有三個(gè)帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)的多價(jià)陰離子。該性質(zhì)使其能夠交聯(lián)殼聚糖（RekhaandSharma,2009。冷凍干燥是在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保存不穩(wěn)定分子的公認(rèn)方法，包括生物技術(shù)-藥物，例如蛋白質(zhì)和肽（Sametietal.,2003）。納米顆?？梢栽谌哿姿徕c，殼聚糖和胰島素的混合物中通過(guò)三聚磷酸鈉磷酸酯和殼聚糖氨基之間的分子間和分子內(nèi)連接自發(fā)

9、形成（Wuetal.,2005）。本研究試圖使用交聯(lián)和冷凍干燥法制備穩(wěn)定的胰島素負(fù)載的殼聚糖納米顆粒，并進(jìn)行體外和體內(nèi)生物效率的驗(yàn)證。2 .材料和方法2.1. 材料超純的殼聚糖氯化物（CSProtasanUPCL113,75-90%脫乙?；?，分子量70-150kDa）購(gòu)自NovaMatrix（FMCBioPolymer,德拉門，挪威）。商業(yè)人胰島素溶液（Umuline1100IU/mL）由EliLillyPharma（Indianapolis,IN,USA）大量提供。由Sigma-Aldrich（St.Louis,MO）提供人重組胰島素，異硫氟酸熒光素標(biāo)記的胰島素，三聚磷酸鈉溶液，D-甘露醇，

10、異丙醇，胎牛血清（FBS）,胰蛋白酶，鏈月尿佐菌素，24孔板（CELLSTAR1organicGreiner）MO,USA）。用于高效液相色譜（HPLC）的化學(xué)品是液相色譜級(jí)。乙月青來(lái)自VWR（Fontenay-sous-BoisFrance）,無(wú)水硫酸鈉來(lái)自SDS（Peypin,France）。人腺癌細(xì)胞系Caco-2獲自ATCC（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ManassasVA,USA）,RevHT29MTX細(xì)胞系由Dr.ThclaLesuffleur（INSERMU505,Villejuif,Franc8提供。從Invitrogen（CergyPontoise,France）購(gòu)買改良伊格爾培

11、養(yǎng)基（DMEM）,抗生素和抗真菌劑，非必需氨基酸溶液，谷氨酰胺，磷酸鹽緩沖液（PBS）和Hanks平衡鹽緩沖溶液（HBSS）。碘化丙呢和膜聯(lián)蛋白-V試劑盒購(gòu)自Clinisciences（Nanterre,France）。2.2. 納米顆粒制備將殼聚糖氯化物CL113溶解于重蒸水（1mg/mLw/v）中。在微量磁力攪拌（300rpm）下，通過(guò)注射器向殼聚糖溶液（500mL）中滴加等體積的胰島素。將混合物在室溫下緩慢攪拌下維持30分鐘以獲得標(biāo)準(zhǔn)（STD）納米顆粒。交聯(lián)，將粉末溶解在重蒸水中來(lái)制備三聚磷酸鈉溶液溶液（27mM）。三聚磷酸鈉溶液溶液（50pL）引入到絡(luò)合介質(zhì)中并攪拌30分鐘（300rp

12、m）以獲得交聯(lián)的納米顆粒。在存在或不存在用作凍干保護(hù)劑的甘露醇的情況下，對(duì)天然或交聯(lián)的納米顆粒進(jìn)行過(guò)夜冷凍干燥。甘露醇直接溶在納米顆粒制劑（5mg/mL）中，然后冷凍干燥。冷凍干燥后，將納米顆粒以目標(biāo)濃度分散在重蒸水中用于進(jìn)一步分析。2.3. 納米顆粒表征納米顆粒的物理化學(xué)參數(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射使用MalvernNanoZS（Malvern,Instruments,Worcestershire,UnitedKingdom）在25c下在重蒸水中稀釋至1:500。通過(guò)從納米顆粒光散射強(qiáng)度的累積函數(shù)計(jì)算直徑來(lái)確定平均納米顆粒尺寸。還確定了全局表面電荷（工電位）和多分散指數(shù)（PDI）。通過(guò)透射電子顯微鏡（

13、TEM;HitachiHighTechnologiesCorporation,Tokyo,Japarj）檢查形態(tài)。在離心納米顆粒分散體后測(cè)定包封效率（20,000Xg,4C1小時(shí)）并通過(guò)高效液相色譜法定量上清液中沒(méi)有包封的藥物。該系統(tǒng)由兩個(gè)Prostar210溶劑遞送系統(tǒng)，Prostar410自動(dòng)進(jìn)樣器和Prostar330光電二極管陣列（PDA）UV/vis檢測(cè)器（Varian,LesUlis,法國(guó)）和SymmetryC18（4.6mmx250mm,5（m,300A）柱（Waters,Milford,MA,USA）。洗脫液A由pH2.3的0.2MNa2SO4水溶液組成，洗脫液B是洗脫液A和乙

14、月青（55:45,v/v）的混合物。流動(dòng)相由洗脫液A/洗脫液B（42:58,v/v）的混合物組成，流速為1mL/min。柱溫度保持在40C,檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。使用以下等式計(jì)算包載功效（EE）:EE（%）=（胰島素的封裝量/胰島素的理論總量）X1002.3.1, 滲透壓計(jì)算我們使用以下VantHoff方程計(jì)算滲透壓H（mmHg）：n=E（M/用于粒度測(cè)量的稀釋因子）xrxt其中M是溶解物質(zhì)的濃度（單位mol/L）0R是理想氣體常數(shù)（0.08206Latmmol-1K-1）。T是在開爾文（293K）上表示的溫度。物種濃度：殼聚糖3.3X10-9M.胰島素3.01X10-4M,三聚磷酸鈉溶液1.

15、28x10-3M,D-甘露醇0.027M.2.4. 透射電子顯微鏡使用在真空下的電碳沉積物使云母片親水化。將合成的納米顆粒（2mL）置于切片上1分鐘，并除去過(guò)量的懸浮液。鈾1%的尿酸乙酯（1%）加入到切片中，1分鐘后取出。通過(guò)TecnaiG2Sphera（FEI公司，Hillsboro,NC,USA）分析樣品。2.5. 藥物釋放在37c緩慢攪拌下，與磷酸鹽緩沖液孵育預(yù)定時(shí)間：Tx=0,0.25,0.5,1,2和4小時(shí)。在1280nm測(cè)量從納米顆粒釋放的胰島素的量。結(jié)果表示為胰島素濃度的增加百分比，如下：（胰島素T0/胰島素Tx）X100。2.6. 穩(wěn)定性測(cè)試制備胃液（35mMNaCl,80mM

16、HCl,pH1.2）和腸內(nèi)培養(yǎng)基（50mMKH2PO4,15mMNaOH,pH6.8）。將納米顆粒與培養(yǎng)基在室溫下孵育預(yù)定量的時(shí)間：To=0小時(shí)，Tx=0.5,1,1.5,2,4和7小時(shí)。在入500nm（Abs）下測(cè)量樣品的光密度。結(jié)果表示為光密度的降低百分比，如下：（Abs.Tx/Abs.To）X1002.7.納米顆粒的生物驗(yàn)證2.7.1. 體外驗(yàn)證2.7.1.1, 模型和細(xì)胞培養(yǎng)。使用兩種細(xì)胞培養(yǎng)模型：Caco-2細(xì)胞和與75%Caco-2和25%RevHT29MTX細(xì)胞的共培養(yǎng)物，以獲得體外腸上皮模型，如Nollevauxetal.（2006方細(xì)胞培養(yǎng)如Reixetal.（2012）。簡(jiǎn)

17、言之，將細(xì)胞接種（73000個(gè)細(xì)胞/cm2）于補(bǔ)充有20%胎牛血清，1%抗生素-抗真菌溶液和1%非必需氨基酸（10mM儲(chǔ)備溶液）的DMEM中。使細(xì)胞在含有5%CO2的氣氛中在37c下生長(zhǎng)21天以獲得腸細(xì)胞表型，并從第30代至第60代使用。將體外使用的納米顆粒冷凍干燥，并且結(jié)果表示為幾何平均值乘以熒光細(xì)胞的百分比。2.7.1.2, 殼聚糖的吸收為了研究細(xì)胞中納米顆粒的攝取，如Reix等人所述進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（2012）。將細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)21天，并與不含磷酸鹽緩沖液的改良伊格爾培養(yǎng)基中的異硫氟酸熒光素-胰島素負(fù)載的納米顆粒（10IU/孔）孵育4小時(shí)。孵育后，用不含鈣和鎂的Hanks平衡鹽緩沖溶

18、液溶液洗滌細(xì)胞3次（10分鐘），并通過(guò)胰蛋白酶消化，離心并在Hanks平衡鹽緩沖溶液中的懸浮分離。懸浮后加入2山碘化丙呢和2L膜聯(lián)蛋白V-APC用以評(píng)估細(xì)胞活力。通過(guò)BDLSRII流式細(xì)胞儀（BectonDickinsonandCompanyPiscataway,NJ,USA）一式三份分析樣品，每孔記錄50,000個(gè)事件。結(jié)果表示為熒光強(qiáng)度的幾何平均值乘以異硫氟酸熒光素標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。2.7.2. 體內(nèi)驗(yàn)證所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)根據(jù)歐洲健康指導(dǎo)委員會(huì)關(guān)于動(dòng)物的護(hù)理和使用的實(shí)驗(yàn)程序（批準(zhǔn)號(hào)：AL/60/67/02/13）進(jìn)行。將雄性Wistar大鼠（120-140g）置于具有調(diào)節(jié)溫度（23士C）室的

19、房間中的標(biāo)準(zhǔn)集體籠中。將大鼠保持在12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)中，并喂以顆粒形式的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物飲食（SAFEA04,Villemoisson-sur-Orge,France。食物和水隨意獲得。通過(guò)腹膜內(nèi)單次注射鏈U霉素（75mg/kg）誘導(dǎo)糖尿病。3天后形成糖尿病（血糖6g/L和C-肽100pM）。糖尿病大鼠經(jīng)歷手術(shù)以植入腹膜內(nèi)（IP）和十二指腸（ID）導(dǎo)管。導(dǎo)管的近端皮下穿透以在頸部后部離開，并縫合。手術(shù)后兩天，通過(guò)十二指腸途徑向動(dòng)物施用10IU胰島素，通過(guò)腹膜內(nèi)途徑施用2IU胰島素。納米顆粒生物功能通過(guò)在腹膜內(nèi)治療的大鼠中每30分鐘評(píng)價(jià)空腹血糖4小時(shí)，并且每小時(shí)治療12小時(shí)治療的十

20、二指腸。2.8.統(tǒng)計(jì)分析使用Statistica版本10（StatSoft,USA）和GraphPadPrism4（USA）分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤。所有數(shù)據(jù)通過(guò)單因素方差分析TukeyHSD檢驗(yàn)法，事后檢驗(yàn)進(jìn)行物理化學(xué)和體外分析。進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析測(cè)試用于體內(nèi)研究。當(dāng)p0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著。3 .結(jié)果3.1. 納米顆粒表征標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒為412貨nm,工電位為+36tmV（表1）。沒(méi)有甘露醇的冷凍干燥顯著增加了納米顆粒尺寸（49026nm）和工電位（+441mV）。用甘露醇凍干顯著減小尺寸至368i5nm和工電位至+422mV。交聯(lián)的納米顆粒為346立nm,工電位為+36X.8

21、mV。具有或不具有甘露醇的冷凍干燥和交聯(lián)的組合保持了納米顆粒大?。ǚ謩e為313i2和32619nm）和工電位（分別為+421和+421mV）。所有的納米顆粒具有小于或等于0.4的多分散指數(shù)。透射電子顯微鏡圖像顯示平滑和球形的納米顆粒，并且該形態(tài)在冷凍干燥后保留（圖1）。高效液相色譜法測(cè)量表明標(biāo)準(zhǔn)和交聯(lián)的納米顆粒的截留效率分別為61%和69%（圖2）。表格1冷凍干燥和交聯(lián)過(guò)程對(duì)負(fù)載胰島素的殼聚糖顆粒的物理化學(xué)特性的影響。標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒米顆粒冷凍干燥甘露醇凍干標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒交聯(lián)納米顆粒標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒交聯(lián)的納米顆粒尺寸標(biāo)準(zhǔn)差（nm）4127346立;a490及6313節(jié)a,b368節(jié)a,b3269b,c多

22、分散指數(shù)0.3=0.060.31:0.040.4=0.080.30060.3).070.3).05工電位標(biāo)準(zhǔn)差（mV）+361+361+44至1+0.3空1+42年2+43至1動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量，數(shù)據(jù)以平均值班準(zhǔn)差表示。應(yīng)用單因素方差分析Tukey法比較所有組a.p0.05與標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒比較.b.p0.05與不含甘露醇的冷凍干燥的納米顆粒比較c.p0.05與冷凍干燥的具有甘露醇的納米顆粒比較圖1.胰島素負(fù)載殼聚糖的透射電子顯微鏡。冷凍干燥前（A）和冷凍干燥（B）后裝載胰島素的殼聚糖顆粒的結(jié)構(gòu)。交聯(lián)顆粒具有相同的方面（未示出）。P-JJNcolB-nsdBUUUJFreeze-dried圖2.殼聚糖

23、顆粒的包封效率。）代表標(biāo)包封的胰島素的高效液相色譜法定量（歐洲藥典方案），象形圖（準(zhǔn)納米顆粒，（口）是用于交聯(lián)的納米顆粒。通過(guò)平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示顆粒，進(jìn)行t檢驗(yàn)（n=3批合成）*p0.001。3.2. 納米顆粒穩(wěn)定性測(cè)試當(dāng)不同的納米顆粒制劑在水中孵育7小時(shí)時(shí)，沒(méi)有觀察到光密度的變化（圖3）。納米顆粒立即溶解在模擬胃介質(zhì)中，不管配方法（圖3,紅色）。在模擬的腸介質(zhì)（圖3,綠色）中，標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒在1小時(shí)后迅速破壞，84%在7小時(shí)溶解。相比之下，20%的冷凍干燥的納米顆粒，有或沒(méi)有甘露醇，在30分鐘內(nèi)溶解。這些納米顆粒穩(wěn)定7小時(shí)。DeiontzedwaterSimulatediut總式iualmed

24、iumSimulatedgastricmedium100090807060鈍題配2010011oL/xl)guEqwaTime(hours)圖3.模擬胃和腸介質(zhì)中殼聚糖顆粒制劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)。（對(duì)于文本中對(duì)顏色的引用的解釋，讀者參考本文的web版本。）通過(guò)在模擬介質(zhì)中隨時(shí)間推移濁度的演變進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)量。去離子水中顆粒的穩(wěn)定性表示為黑色，腸介質(zhì)為綠色，胃介質(zhì)為紅色。模式（一）是用于非冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)或交聯(lián)的納米顆粒，（*）用于冷凍干燥的納米顆粒和（）用于用甘露醇納米顆粒冷凍干燥。結(jié)果以比率表示：通過(guò)測(cè)量的吸光度T0在Tx處測(cè)量的吸光度。數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用方差分析（重復(fù)測(cè)量）以比較所有組，與

25、去離子水相比，*p0.05和*p0.01,相對(duì)于冷凍干燥的納米顆粒腸介質(zhì)，#p0.05和#p0.01。3.3. 藥物釋放無(wú)凍干標(biāo)準(zhǔn)交聯(lián)納米顆粒在37c下在磷酸鹽緩沖液中孵育時(shí)立即倒轉(zhuǎn)（圖4）。當(dāng)顆粒冷凍干燥時(shí)，在磷酸鹽緩沖液中溫育15分鐘后釋放50%包封的胰島素，4小時(shí)后釋放70%。施用甘露醇的冷凍干燥時(shí)減少爆發(fā)釋放25%并在4小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。Time(hours)圖4.從殼聚糖顆粒釋放胰島素。通過(guò)紫外吸光法測(cè)量評(píng)價(jià)了在磷酸鹽緩沖液中殼聚糖的藥物釋放。（,）用于冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)顆粒，（日）用于冷凍干燥交聯(lián)的顆粒，（）用于加入D-甘露醇冷凍干燥交聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)顆粒，（O）用于加入D-甘露醇冷凍干燥交聯(lián)的

26、顆粒，（*；*）分別為干燥納米顆粒（標(biāo)準(zhǔn)和交聯(lián)）。結(jié)果以百分比標(biāo)準(zhǔn)差表示，幾何平均值乘以熒光細(xì)胞的百分比。3.4. 使用Caco-2細(xì)胞的體外驗(yàn)證和共培養(yǎng)與陰性對(duì)照相比，異硫氟酸熒光素-胰島素?zé)晒庠诩{米顆粒孵育后在Caco-2細(xì)胞和共培養(yǎng)物中增加。在Caco-2細(xì)胞中，標(biāo)準(zhǔn)和沒(méi)有甘露醇的交聯(lián)冷凍干燥的納米顆粒都與細(xì)胞高度相關(guān)（圖5）o甘露醇誘導(dǎo)熒光的顯著降低。在共培養(yǎng)（圖6）中，與具有或不具有甘露醇的標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒相比，具有或不具有甘露醇的冷凍干燥的交聯(lián)的納米顆粒是高度相關(guān)的。有趣的是，Caco-2細(xì)胞呈現(xiàn)比共培養(yǎng)物更高的熒光。這可以通過(guò)共培養(yǎng)物中粘液的存在來(lái)解釋。+UJULLC2E05中圖5.

27、在Caco-2模型上負(fù)載胰島素的殼聚糖顆粒通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行相關(guān)熒光測(cè)量，每孔記錄50,000個(gè)事件，并且數(shù)據(jù)由Geo平均值乘以每個(gè)孔n=3的熒光細(xì)胞的百分比（每n次9次測(cè)量）表示。模式（LI）代表的陰性對(duì)照,）代表冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)顆粒，（。）代表冷凍干燥的交聯(lián)顆粒,）代表具有D-甘露醇的凍干標(biāo)準(zhǔn)顆粒,（日）代表施用D-甘露醇的交聯(lián)顆粒。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤顯示，應(yīng)用單因素方差分析Tukey法比較所有組與陰性對(duì)照ap0.001,與凍干標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒bp0.001,與凍干交聯(lián)的納米顆粒cp0.001。圖6.在共培養(yǎng)模型上負(fù)載胰島素的殼聚糖顆粒通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行相關(guān)熒光測(cè)量，每孔記錄50,000個(gè)事件

28、，并且數(shù)據(jù)由Geo平均值乘以每個(gè)孔n=3的熒光細(xì)胞的百分比（每個(gè)n,9次測(cè)量）表示。模式（1-1）代表的陰性對(duì)照,）代表冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)顆粒,匚1）代表冷凍干燥的交聯(lián)顆粒的,代表具有D-甘露醇的凍干標(biāo)準(zhǔn)顆粒的,（白）代表施用D-甘露醇的交聯(lián)顆粒。數(shù)據(jù)以平均值項(xiàng)準(zhǔn)誤顯示，應(yīng)用單因素方差分析Tukey法以比較所有組,與陰性對(duì)照ap0.001,與冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒bp0.05,與凍干交聯(lián)的納米顆粒cp0.05。3.5. 納米顆粒毒性與對(duì)照細(xì)胞（37%）相比，在標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒孵育后觀察到細(xì)胞活力的顯著降低（表2）。具有甘露醇的冷凍干燥的納米顆粒降低細(xì)胞凋亡（23%）。使用在存在或不存在甘露醇（分別為2

29、2%和20%）的情況下冷凍干燥的交聯(lián)的納米顆粒，也降低了凋亡。使用共培養(yǎng)模型，除了在甘露醇（17%）存在下冷凍干燥的交聯(lián)的納米顆粒，沒(méi)有觀察到活力的降低。表2評(píng)價(jià)胰島素負(fù)載的殼聚糖顆粒對(duì)體外模型的毒性。陰性對(duì)照.凍干用甘露醇凍干標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒納米顆粒交聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒納米顆粒交聯(lián)Caco-210063737779共培養(yǎng)1001009510083在流式細(xì)胞術(shù)中通過(guò)逆染色與納米顆粒孵育細(xì)胞后評(píng)價(jià)細(xì)胞活力，每孔記錄50,000個(gè)事件，并且數(shù)據(jù)以百分比n=3（每個(gè)n,9次測(cè)量）表示。數(shù)據(jù)以平均值表示，應(yīng)用單因素方差分析Tukey法比較所有組。與陰性對(duì)照相比，p0.001,與冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒相比，bp

30、0.001,與陰性對(duì)照相比，cp0.001。3.6. 納米顆粒的腹膜內(nèi)施用與接受鹽溶液的大鼠相比，納米顆粒的腹膜內(nèi)施用顯著降低糖尿病大鼠中的血糖（圖7A）o包封的胰島素的效果類似于游離胰島素，并且發(fā)生在相同的時(shí)問(wèn)范圍內(nèi)，在輸注后30分鐘檢測(cè)到血糖降低。（圖7B）使用曲線下面積（AUC）證實(shí)了這些結(jié)果，揭示了腹膜內(nèi)施用后，游離胰島素和包封的胰島素具有相同的效果。Time（hours）圖7.腹膜內(nèi)施用負(fù)載胰島素的殼聚糖顆粒。給予單劑量的2UI游離胰島素或顆粒，并在定義的點(diǎn)測(cè)量大鼠血糖。（A）是血糖進(jìn)展的表示，（B）是曲線下面積的表示。模式（*;LI）代表鹽水溶液給藥（n）代表冷凍干燥標(biāo)準(zhǔn)顆粒=5）

31、,（*;.）代表游離胰島素給藥（n=5）,（*;(n=7),（舊；口）代表冷凍干燥交聯(lián)的顆粒（n=7）,（;）代表有D-甘露醇的冷凍干燥標(biāo)準(zhǔn)顆粒（n=8）和（。；口）代表有D-甘露醇冷凍干燥交聯(lián)的顆粒（n=7）。結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤方差分析（單因素）（重復(fù)測(cè)量（A）表示。應(yīng)用Tukey比較所有組，與陰性對(duì)照p0.001。3.7. 納米顆粒的十二指腸內(nèi)給藥顆粒的十二指腸內(nèi)給藥誘導(dǎo)血糖顯著降低，而鹽溶液和游離胰島素沒(méi)有作用（圖8A）o曲線下面積的分析顯示，與游離胰島素相比，僅冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒通過(guò)十二指腸內(nèi)給藥具有降血糖作用（圖8B）oB工圖8.胰島素負(fù)載的殼聚糖顆粒的十二指腸內(nèi)給藥施用單劑量

32、的10UI游離胰島素或顆粒，并在定義的點(diǎn)測(cè)量大鼠血糖。（A）是血糖進(jìn)展的表示，（B）是曲線下面積的表示。模式（*；LI）代表鹽水溶液給藥）代表冷凍干燥標(biāo)準(zhǔn)顆(n=4),(*;.)代表游離胰島素給藥(n=3),(粒（n=6）,（D;口）代表冷凍干燥交聯(lián)的顆粒（表有D-甘露醇的冷凍干燥標(biāo)準(zhǔn)顆粒（n=5）和（Q;目n=6),(;）代）代表有D-甘露醇的冷凍干燥交聯(lián)顆粒（n=6）。結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤方差分析表示（重復(fù)測(cè)量（A）應(yīng)用Tukey法以比較所有組，與游離胰島素和標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒相比，ap0.01,bp0.01,與陰性對(duì)照相比，cp0.05。4 .討論自組裝的納米顆粒是有效的藥物載體，但不能用于口

33、服胰島素遞送。在本研究中，制備穩(wěn)定的自組裝的裝載胰島素的殼聚糖納米顆粒，通過(guò)交聯(lián)和冷凍干燥穩(wěn)定，并表征。我們進(jìn)一步證明了穩(wěn)定的納米顆粒在體外和體內(nèi)的生物效應(yīng)。冷凍干燥可以穩(wěn)定固有的不穩(wěn)定的膠體，但是誘導(dǎo)納米顆粒聚集，因此增加納米顆粒尺寸，添加表面活性分子以減少表面能和效價(jià)仍然受歡迎。蔗糖已被用于在冷凍干燥期間抑制甲氧基聚（環(huán)氧乙烷）-聚（乳酸）納米顆粒的聚集（Zambauxetal.,1999）。在這項(xiàng)研究中，甘露醇被用作冷凍保護(hù)劑。甘露醇在納米顆粒周圍形成包膜，由此保持形態(tài)并在冷凍干燥過(guò)程中抑制聚集。鑒于甘露醇在負(fù)荷方面是中性的，具存在不改變納米顆粒的全局負(fù)荷，其保持高度陽(yáng)性。甘露醇在冷凍干燥過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生電荷，從而避免納米顆粒聚集。甘露醇是水溶性的，并且可以在分散過(guò)程中溶解以顯示納米顆粒表面負(fù)荷。軟化冷凍干燥過(guò)程的存在避免了顆粒不穩(wěn)定并且減少了爆裂釋放現(xiàn)象。三聚磷酸鈉溶液用于通過(guò)增加靜電相互作用質(zhì)量來(lái)提高納米顆粒穩(wěn)定性。選擇三聚磷酸鈉溶液作為聚陰離子交聯(lián)劑，因?yàn)樗菬o(wú)毒的并且在與殼聚糖接觸時(shí)立即凝膠(DeMouraetal.,2009)。在足夠的濃度下，在凝聚過(guò)程中交聯(lián)劑提高了發(fā)生的靜