目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

1、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)1. 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)(1) 從平板或甘油保存菌中接一環(huán)重組工程菌和pET-22b(+)空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，加入3mlAmp(100ug/ml)+LB的培養(yǎng)液中，37°C，250rmp搖床培養(yǎng)過夜。(2) 將過夜培養(yǎng)的重組工程菌和pET-22b(+)空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞分別按1%的比例轉(zhuǎn)種于30mlAmp(100ug/ml)+LB的培養(yǎng)液中。(3) 37°C搖床培養(yǎng)至OD600到0.4-1。(4) 從重組工程菌和pET-22b(+)空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞中各取10ml培養(yǎng)物作為未誘導(dǎo)對照；在剩下的樣品中加入1MIPTG儲液至終濃度1mM,繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。(5)將搖瓶置于

2、冰上5分鐘,5000g4°C離心15分鐘收集菌體，菌體保存于-20°C冰箱或SDS-PAGE分析等。2. 表達(dá)條件的優(yōu)化：1) IPTG的誘導(dǎo)濃度的確定：(1) 重組工程菌的誘導(dǎo)：從平板或甘油保存菌中接一環(huán)重組工程菌和pET-22b(+)空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，加入3mlAmp(100ug/ml)+LB的培養(yǎng)液中，37°C,250rmp搖床培養(yǎng)過夜。(2) 將過夜培養(yǎng)的重組工程菌按1%的比例轉(zhuǎn)種于30mlAmp(100ug/ml)+LB的培養(yǎng)液中。(3) 在37°C,250rmp搖床培養(yǎng)至0D600約為0.8。(4) 按6ml/份上述培養(yǎng)物分裝，分別加入IPTG

3、至終濃度0,0.5,1,1.5,2.0mM。(5) 37°C，250rmp搖床培養(yǎng)8h，在無菌條件下取樣并測定OD600值。(6) 所取樣品1ml/份分裝，5000g4°C離心15分鐘收集菌體。(7) 菌體保存于-20C冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量測定。2) IPTG誘導(dǎo)溫度條件的優(yōu)化：(1) 重組工程菌的誘導(dǎo)：從平板或甘油保存菌中接一環(huán)重組工程菌和pET-22b(+)空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，加入3mlAmp(100ug/ml)+LB的培養(yǎng)液中，37°C,250rmp搖床培養(yǎng)過夜。(2) 將過夜培養(yǎng)的重組工程菌按1%的比例轉(zhuǎn)種于30mlAmp(100ug/ml)+

4、LB的培養(yǎng)液中。(3) 在37°C,250rmp搖床培養(yǎng)至0D600約為0.8。(4) 在誘導(dǎo)之前，將30ml培養(yǎng)液分為5份，每份各6ml,其中4份加入IPTG,另1份不加IPTG作為不誘導(dǎo)對照。加入IPTG至終濃度為1.0mM,選取幾個適當(dāng)溫度點(可從15-37°C之間選擇)250rmp搖床培養(yǎng)。(5) 培養(yǎng)8h后，在無菌條件下取出樣品6ml，并測定OD600值。(6) 所取樣品1ml/份分裝，5000g4°C離心15分鐘收集菌體。(7) 菌體保存于-20°C冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量測定。3) 誘導(dǎo)時間優(yōu)化(1)重組工程菌的誘導(dǎo)：從平板或甘

5、油保存菌中接一環(huán)重組工程菌和pET-22b(+)空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，加入3mlAmp(100ug/ml)+LB的培養(yǎng)液中，37°C,250rmp搖床培養(yǎng)過夜。(2)將過夜培養(yǎng)的重組工程菌按1%的比例轉(zhuǎn)種于80mlAmp(100ug/ml)+LB培養(yǎng)液中。(3) 在37°C,250rmp搖床培養(yǎng)至OD600約為0.8。(4) 在誘導(dǎo)之前，取出6ml不加IPTG作為不誘導(dǎo)對照。剩余加入IPTG至終濃度為1.0mM,在37°C250rmp搖床培養(yǎng)。(5) 每1小時在無菌條件下取樣6ml并測定OD600值，取樣后剩余培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)。(6) 所取樣品1ml/份分裝，5000g4

6、°C離心15分鐘收集菌體。(7) 菌體保存于-20°C冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量測定。4) 誘導(dǎo)培養(yǎng)物的光密度優(yōu)化：(1) 重組工程菌的誘導(dǎo)：從平板或甘油保存菌中接一環(huán)重組工程菌和pET-22b(+)空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，加入3mlAmp(100ug/ml)+LB的培養(yǎng)液中，37°C,250rmp搖床培養(yǎng)過夜。(2) 將過夜培養(yǎng)的重組工程菌按1%的比例轉(zhuǎn)種于70mlAmp(100ug/ml)+LB培養(yǎng)液中。(3) 在37°C，250rmp搖床培養(yǎng)至0D600為0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0時分別取樣10ml/份。(4) 各自加

7、入IPTG至終濃度1.0mM.(5) 37°C，250rmp搖床培養(yǎng)8h，在無菌條件下取樣并測定OD600值。(6) 所取樣品1ml/份分裝，5000g4°C離心15分鐘收集菌體。(7) 菌體保存于-20°C冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量測定。5) SDS-PAGE加樣量的確定：在誘導(dǎo)后收集細(xì)胞前，充分搖蕩使上清液均勻，在誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)液中各取出0.5-1.0ml。盡量準(zhǔn)確的確定0D600值。可以通過用相同的培養(yǎng)基進行稀釋(通常為1:5到1:10稀釋)使OD600讀數(shù)在0.1-0.8之間。在工作表中記錄稀釋倍數(shù)和OD600讀數(shù)，以便計算SDS-PAGE的

8、上樣量。測定OD600時樣品帶稀釋倍數(shù)稀釋樣品的OD600值富集OD600值樣品濃縮系數(shù)(培養(yǎng)液體積/加上樣緩沖液后稀釋體積)Z(富集OD600*濃度系數(shù))加樣量15孔小膠180ul/Z10孔小膠270ul/Z未誘導(dǎo)培養(yǎng)液(0mmol/l)誘導(dǎo)培養(yǎng)液(0mmol/l)3.大量表達(dá)：(1) 重組工程菌的誘導(dǎo)：從平板或甘油保存菌中接一環(huán)重組工程菌和pET-22b(+)空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，加入3mlAmp(100ug/ml)+LB的培養(yǎng)液中，37°C,250rmp搖床培養(yǎng)過夜。(2) 取過夜培養(yǎng)物，按照1%接種至200ml培養(yǎng)基中，在1L培養(yǎng)瓶中，在優(yōu)化溫度下，250rmp搖床培養(yǎng)至0D600

9、約為0.5-1.0。建議0D600為0.6，約2-3小時)。(3) 以預(yù)實驗確定的優(yōu)化條件誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。(4) 5000g4°C離心15分鐘收集菌體。如果需要，收集上清液進行進一步分析。(5) 菌體保存于-20°C冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量測定。4. 表達(dá)形式的鑒定：(1) 將凍存的菌體沉淀用1xPBS(pH7.8)洗滌2-3次，除凈培養(yǎng)基。(2) 每100ml培養(yǎng)物的沉淀重懸與4ml的lxBindingBuffer(pH7.9)中。(3) 加入溶菌酶使終濃度為lmg/ml,冰上放置30min。(替代方法：用超聲波裂解誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，功率300W超聲30s，

10、間歇30s,工作30次，注意冰上操作。)(4) 混合物于4°C搖床上孵育10min。加入Triton-100，DNase和RNase，至終濃度為1%，5ug/ml和5ug/ml。再于4°C搖床上孵育10min。(5) 4°C,3000g離心30min，去除不溶性細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)入新管備用。(6) 取50ul上述上清50hl2xSDS上樣緩沖液，沉淀加入100ul1xSDS上樣緩沖液，煮沸15min變性，0°C儲存?zhèn)溆?，用于SDS-PAGE分析。5. SDS-PAGE分析(1) 制備10%分離膠7.5ml，5%的濃縮膠3ml,封板，灌膠。(2) 樣品加入適

11、量的1xSDS上樣緩沖液，混勻，煮沸，0°C儲存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)菌液0D600值確定電泳上樣量(一般應(yīng)20ul)(3) 電泳：采用8V/CM的電壓跑濃縮膠，采用15V/CM的電壓跑分離膠，至考馬斯亮藍(lán)到達(dá)凝膠底部時停止電泳。(4) 染色及脫色：凝膠置于至少5倍凝膠體積的考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫于搖床上染色，再置于脫色液中，平緩搖動脫色4-8h,期間更換脫色液3-4次。UVP掃描分析電泳結(jié)果，計算目的蛋白條帶的相對含量。拍照，凝膠可保存于20%甘油的水中。6. 菌液總蛋白含量的測定：Lowry法測定重組蛋白的濃度：1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，取6支干凈的試管，按下表編號并加入試劑，試劑(ml)管號123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白液00.20.40.60.81.0雙蒸水1.00.80.60.40.20試劑甲5.05.05.05.05.05.0混勻，室溫放置20min試劑乙0.50.50.50.50.50.5立即混合均勻(這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱)，放置30min后,以1號管為空白，在650nm波長比色，測定各管吸光度，以蛋白含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2)樣品的測定取待測樣品溶液1ml，操作及所加試劑與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作條件相同(最好與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作同時進行），測定待測樣品溶液吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得的蛋白質(zhì)含量，再乘以稀釋