基因工程的基本操作程序教學(xué)學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)1基因工程基因工程(jyn gngchng)的基本操作的基本操作程序教學(xué)程序教學(xué)第一頁，共50頁。抗蟲棉的培育(piy)的過程：第1頁/共49頁第二頁，共50頁?；?jyn)表達(dá)載體的構(gòu)建第2頁/共49頁第三頁，共50頁。第3頁/共49頁第四頁，共50頁。補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因(jyn)結(jié)構(gòu)編碼(bin m)區(qū)下游 非編碼(bin m)區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 啟動子終止子補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)內(nèi)含子 外顯子 編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 RNA聚合酶的始結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶的末結(jié)合位點(diǎn)第4頁/共49頁第五頁，共50頁。結(jié)構(gòu)(jigu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加

2、工(ji gng)修飾mRNA能夠編碼蛋白質(zhì)的序列(xli)叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子內(nèi)含子： 外顯子： 第5頁/共49頁第六頁，共50頁。基因文庫 基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）u基因文庫中不是直接保管相應(yīng)(xingyng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。將含有某種生物(shngw)不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物(shngw)的不同基因，稱為基因文庫。第6頁/共49頁第七頁，共50頁?；蚪M文庫(wnk)的構(gòu)建模式圖第7頁/共49頁第八頁，共50頁。部分(b fen)基因文庫的構(gòu)建模式圖第8頁/共49頁第九頁，共50

3、頁。小大無有無有某種生物(shngw)的部分基因某種生物(shngw)的全部基因可以部分基因可以第9頁/共49頁第十頁，共50頁。解旋酶催化(cu hu)1)解旋模板(mbn)2)合成(hchng)互補(bǔ)子鏈 以母鏈為模板進(jìn)行堿基配對(在DNA聚合酶的催化下,利用游離的脫氧核苷酸進(jìn)行)母鏈（舊鏈）子鏈（新鏈）子代DNA:同時進(jìn)行(邊解旋邊復(fù)制)組成3)形成新的DNA分子作用：把單個脫氧核苷酸連接成鏈(形成磷酸二酯鍵)第10頁/共49頁第十一頁，共50頁。2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的(md)基因1概念：PCR全稱為_，是一項(xiàng) 在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù)。 2原理：DNA復(fù)制原料：模板DNA；DNA

4、引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lin sh fn yng)體外特定(tdng)DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列第11頁/共49頁第十二頁，共50頁。PCR技術(shù)(jsh)的操作過程a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂(dun li)，形成_b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度(wnd)降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加_倍一第12頁/共49頁第十三頁，共50頁。PCR技術(shù)(jsh)的操作過程第1

5、3頁/共49頁第十四頁，共50頁。PCR技術(shù)(jsh)的操作過程第14頁/共49頁第十五頁，共50頁。PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制(fzh)的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理?xiàng)l件解旋方式酶特點(diǎn)結(jié)果堿基互補(bǔ)(h b)配對原則堿基互補(bǔ)(h b)配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等第15頁/共49頁第十六頁，共50頁。n 過程(guchng)：變性、退火(tu hu)、延伸三步曲

6、變性：9095 退火(tu hu)：5560 延伸：7075第16頁/共49頁第十七頁，共50頁。3. 人工合成(rn n h chn)法利用(lyng)DNA合成儀人工合成的前提：基因較小，核苷酸序列已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列(xli)mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測推測思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動子和終止子嗎？第17頁/共49頁第十八頁，共50頁。課堂(ktng)小結(jié)1、從基因文庫中獲取(huq)2、利用(lyng)PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫歸納：獲取目的基因的

7、方法第18頁/共49頁第十九頁，共50頁。思考：為什么要構(gòu)建基因表達(dá)載體？（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳(ychun)給下一代；（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。二、構(gòu)建表達(dá)(biod)載體第19頁/共49頁第二十頁，共50頁。 不可以。 因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要(xyo)有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。 第20頁/共49頁第二十一頁，共50頁。2.基因表達(dá)載體(zit)的組成：它們有什么(shn me)作用？a、目的(md)基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因第21頁/共49頁第二十二頁，共50頁。啟動子：終止子：標(biāo)記(bioj)基因

8、：位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合(jih)的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。位于基因尾端的一段特殊的DNA片段，能終止(zhngzh)mRNA的轉(zhuǎn)錄。鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來。第22頁/共49頁第二十三頁，共50頁。相同點(diǎn)：不同點(diǎn)：思考：載體與表達(dá)(biod)載體的異同都有標(biāo)記基因(jyn)和復(fù)制原點(diǎn)。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分(b fen)結(jié)構(gòu)。第23頁/共49頁第二十四頁，共50頁?；虮磉_(dá)(biod)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子(fnz)限制(xinzh)酶切割兩個切口獲得目的基因

9、DNA連接酶連接重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端用同一種限制酶分別切割目的基因個質(zhì)粒，使之露出相同的粘性末端，并用DNA連接酶使之連接 第24頁/共49頁第二十五頁，共50頁。三、將目的(md)基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化(zhunhu)： 目的基因(jyn)進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞第25頁/共49頁第二十六頁，共50頁。第26頁/共49頁第二十七頁，共50頁。（1）農(nóng)桿菌(gnjn)轉(zhuǎn)化法特點(diǎn)(tdin)： T

10、i質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移(zhuny)到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。第27頁/共49頁第二十八頁，共50頁。轉(zhuǎn)化(zhunhu)過程:Ti質(zhì)粒目的(md)基因構(gòu)建(u jin)表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第28頁/共49頁第二十九頁，共50頁。 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合(zhn h)并表達(dá)的方法。（2）基因(jyn)槍法第29頁/共49頁第三十頁，共50頁。（3）花粉(hufn)通道法

11、植物(zhw)花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物(zhw)受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。第30頁/共49頁第三十一頁，共50頁。第31頁/共49頁第三十二頁，共50頁。（2）操作程序:提純含目的基因(jyn)表達(dá)載體取受精卵顯微(xin wi)注射移植(yzh)到輸卵管或子宮受精卵發(fā)育新性狀動物第32頁/共49頁第三十三頁，共50頁。常用(chn yn)法：常用(chn yn)菌：微生物作受體細(xì)胞原因(yunyn)：過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合

12、感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少第33頁/共49頁第三十四頁，共50頁。受體生物 植物 動物 微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞(xbo)/個體農(nóng)桿菌(gnjn)轉(zhuǎn)化法基因(jyn)槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第34頁/共49頁第三十五頁，共50頁。 四、目的基因(jyn)的檢測與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝 入重組(zhn z)DNA分子嗎？12目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？ 第35頁/共49頁第三十六頁，共50頁。第36頁/共49

13、頁第三十七頁，共50頁。轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針(tn zhn)15151414方法DNA分子雜交技術(shù)（DNA與DNA）1、檢測分子水平的檢測第37頁/共49頁第三十八頁，共50頁。方法(fngf)DNA與mRNA雜交(zjio)技術(shù)探針1515轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14141、檢測分子水平的檢測第38頁/共49頁第三十九頁，共50頁。1、檢測分子(fnz)水平的檢測提取(tq)蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì) 出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)第39頁/共49頁第四十頁，共50頁。（二）鑒定（個體(gt)生物學(xué)水平）抗蟲鑒定(jindng)、

14、抗病鑒定(jindng)、活性鑒定(jindng)等第40頁/共49頁第四十一頁，共50頁。類型步驟檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測第一步目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個體水平鑒定 包括抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性以及抗性的程度； 基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。第41頁/共49頁第四十二頁，共50頁。第42頁/共49頁第四十三頁，共50頁。課堂練習(xí)1、有關(guān)基因工程的

15、敘述中，錯誤的是( ) A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得(hud) C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A第43頁/共49頁第四十四頁，共50頁。課堂練習(xí)2、下列屬于獲取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取 從受體細(xì)胞中提取 利用PCR技術(shù)(jsh) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成 A. B. C. D.D第44頁/共49頁第四十五頁，共50頁。課堂練習(xí)第45頁/共49頁第四十六頁，共50頁。課堂練習(xí)【拓展深化】只有第三步將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞不需堿基互補(bǔ)(h b)配對，其余三個步驟都涉及堿基互補(bǔ)(h b)配對第46頁/共49頁第四十七頁，共50頁。課堂練習(xí)即時應(yīng)用(隨學(xué)隨練，輕松奪冠)5(2009年高考浙江卷)下列關(guān)于基因工程的敘述，錯誤的是()A目的基因和受體細(xì)胞均可來自動(zdng)、植物或微生物B限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C人胰島素原基因在大腸桿菌中表達(dá)的胰島素原無生物活性D載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá)D第47頁/共49頁第四十