微生物學實驗指導(10.10)

1、12實驗一顯微鏡的使用及細菌的革蘭氏染色一、實驗目的和內容一實驗目的1. 復習顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油鏡的使用方法。2. 初步掌握細菌涂片方法及革蘭氏染色的步驟二實驗內容1. 學習油浸系物鏡的使用方法。2制作細菌染色裝片。3. 進行革蘭氏染色法操作。4. 用油鏡觀察大腸桿菌和蘇云金桿菌染色裝片。二、實驗原理一油鏡的基本原理普通光學顯微鏡包括低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3種物鏡。油鏡是一種高倍放大的物鏡，一般都刻有放大倍數(shù)，如95x、100x等。油鏡頭上?？逃蠴IOil,Immersion或HIHomogeneousimmersion字樣，有的還刻有一圈紅線或

2、黑線標記，而且油鏡的鏡身較高倍鏡和低倍鏡為長。在低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑numberalaperture最大，而工作距離最短圖3-1。IH/Cl171-0.1"圖1-1顯微鏡物鏡參數(shù)圖顯微鏡的分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點間最小距離Q的能力。D值愈小說明分辨率愈高。D值與光線的波長入成正比，與物鏡的數(shù)值孔徑NA成反比.從上式可看出，縮短光波長和增大數(shù)值孔徑都可提高分辨率。數(shù)值孔徑指光線投射到物鏡上的最大角度稱鏡口角，a的一半正弦與介質折射率n的乘積。影響數(shù)值孔徑大小的因數(shù)，一是鏡口角，二是介質的折射率。當鏡與裝片之間的介質為空氣時，由于空氣n=1

3、.0與玻璃n=的折射率不同，光線會發(fā)生折射，不僅使進入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會減少鏡口角。當以香柏油n=為介質時，由于它的折射率與玻璃相近，光線經(jīng)過載玻片后可直接通過香柏油進入物鏡而不發(fā)生折射，不僅增加了視野的照明廢，更重要的是通過增加數(shù)值孔徑提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。二革蘭氏染色革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家ChristainGram創(chuàng)立的，是細菌學中最重要的鑒別染色法，其原理是利用細菌的細胞壁組成成分和結構的不同。革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結構組成、壁厚、類脂質含量低，用乙醇或丙酮脫色時細胞

4、壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結構孔徑縮小，透性降低，從而使結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，經(jīng)脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質被乙醇或丙酮溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。三、實驗材料和用具1. 菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)、蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)o2. 試劑革蘭氏染色液結晶紫染液、盧戈氏碘液、95乙醇、石炭酸復紅液等、香柏油、二甲苯。3.儀器及用具顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙

5、、試管、小滴管、酒精燈。四、操作步驟(一) 細菌的革蘭氏染色1. 制片1涂菌用無菌操作方法從平板中沾取菌苔一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而勻、直徑約1cm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。2干燥于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥溫度不宜過高。3固定將細菌涂片向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。目的是殺死細菌并使細菌粘附在玻片上，便于染料著色。2. 染色1初染于制片上滴加結晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。2媒染滴加盧戈氏碘液，1min后水洗。3脫色滴加95乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止（根據(jù)涂片之厚薄需時30s至1min），立

6、即水洗。4復染滴加石炭酸復紅液復染1min,水洗。5鏡檢用濾紙吸干，油鏡鏡檢。二鏡檢1.觀察前的準備1將顯微鏡置于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約為4cm。坐正。2調節(jié)光源：將低倍物鏡轉到工作位置，把光圈完全打開，聚光器升至與載物臺相距約1mm左右。觀察染色裝片時，光線宜強；觀察未染色裝片時，光線不宜太強。2. 低倍鏡觀察染色裝片首先上升鏡筒，將細菌染色裝片置于載物臺上，用標本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，物鏡降至裝片cm處，適當縮小光圈，然后兩眼從目鏡觀察，轉動粗調節(jié)器使物鏡逐漸上升或使鏡臺下降至發(fā)現(xiàn)物像時，改用細調節(jié)器調節(jié)到物像清楚為止。移動裝片，把合適的觀察部分移至視野中心。3.

7、高倍鏡觀察眼睛離開目鏡從側面觀察，旋轉轉換器，將高倍鏡轉至正下方，注意防止鏡頭與玻片相撞。再用目鏡觀察，仔細調節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細調節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部分移至視野中心，繪圖。不要移動裝片位置，準備用油鏡觀察。4. 油鏡觀察1提起鏡筒約2cm，將油鏡轉至正下方。在玻片標本的鏡檢部位鏡頭的正下方滴一滴香柏油。2從側面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。3將光線調亮，左眼從目鏡觀察，用粗調節(jié)器將鏡筒徐徐上升（切忌反方向旋轉），直至視野中有物像出現(xiàn)時，再用細調節(jié)器校正焦距。如因鏡頭下降未到

8、位或鏡頭上升太快未找到物像必須再從側面觀察，將油鏡降下，重復操作直至物像看清為止。仔細觀察并繪圖。4再次觀察，提起鏡筒，換上另一塊細菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察。繪圖。重復觀察時可比第一次少加香柏油。5. 鏡撿完畢后的工作1移開物鏡鏡頭。2取出裝片。3清潔油鏡油鏡使用完畢后，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯，擦掉殘留的香柏油，最后再用干凈的擦鏡紙擦干殘留的二甲苯。4擦凈顯微鏡，將各部分復原；將接物鏡呈“八“字形降下，不可使其正對聚光器，同時降下聚光器，轉動反光鏡使其鏡面垂直于鏡座。最后套上鏡罩，對號放入鏡箱中，陰涼干燥處存放。（三）結果革蘭氏陽性菌染成藍紫色,

9、革蘭氏陰性菌染成淡紅色。五、注意事項1細菌涂片務求均勻切忌過厚。2在染色過程中，不可使染液干涸。3脫色時間十分重要，過長，則脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會使陰性菌被染成陽性菌。4老齡菌因體內核酸減少，會使陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。5使用油鏡必須先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察的程序操作；6下降鏡頭時，一定要從側面注視，切忌用眼睛對著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯誤操作以免壓碎玻片而損壞鏡頭。7使用二甲苯擦鏡頭時，二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。8注意保持顯微鏡的潔凈，對金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。六、實驗報告

10、1. 分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。2. 記錄革蘭氏染色法步驟，并進行結果分析。七、問題和思考1涂片后為什么要進行固定，固定時應注意什么?2. 用油鏡便于觀察細菌的依據(jù)是什么?3使用油鏡應特別注意哪些間題？4當物鏡從低倍鏡轉到高倍鏡和油鏡時，對照明度有何要求?實驗二放線菌、酵母菌和霉菌的形態(tài)觀察一、實驗目的和內容一實驗目的1.識別放線菌的營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的形態(tài)，學習放線菌的觀察方法。2.了解酵母菌形態(tài)結構。3. 了解霉菌形態(tài)，掌握微生物載玻片濕室培養(yǎng)方法。二實驗內容1.用插片法和水封片法觀察放線菌的形態(tài)特征。2.觀察

11、酵母菌的個體形態(tài)和假菌絲。3. 曲霉、青霉、根霉形態(tài)觀察。二、實驗原理放線菌是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的革蘭氏陽性細菌，常見放線菌大多能形成菌絲體。緊貼培養(yǎng)基外表或深入培養(yǎng)基內生長的叫基內菌絲簡稱“基絲”)，基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲簡稱“氣絲”)，并進一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子。有的放線菌只產(chǎn)生基絲而無氣絲。在顯微鏡下直接觀察時，氣絲處在上層、基絲在下層，氣絲色暗，基絲較透明。孢子絲依種類的不同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。在油鏡下觀察，放線菌的孢子有球形、橢圓、桿狀或柱狀。能否產(chǎn)生菌絲體及由菌絲體分化產(chǎn)生的各種形態(tài)特征是放線菌分類鑒定的重要依據(jù)。通過設計各種培養(yǎng)和

12、觀察方法如插片法、搭片法、玻璃紙法、印片法等，可保持放線菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)特征，便于觀察上述3種菌絲和孢子。酵母菌是不運動的單細胞真核微生物，通常比常見細胞大幾倍甚至十幾倍。大多數(shù)酵母菌以出芽方式進行無性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，復原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的復原能力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的復原型。因此，具有復原能力的酵母細胞是無色的，而死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞則呈藍色或淡藍色。霉菌可產(chǎn)生分枝的菌絲體，分基內菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生

13、繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多，可用低倍顯微鏡觀察。霉菌菌絲較粗大，細胞易收縮變形，而且孢子很容易飛散，所以制標本時常用乳酸石炭酸棉藍染色液。霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)，常用載玻片觀察；此外，為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃紙透析培養(yǎng)法進行觀察。三、實驗材料和用具1. 菌株細黃鏈霉菌Streptomycesmicuoflavus又稱5406，棘抱小單抱菌Micromonusporaechinospora，釀酒酵母Saccharomycescerevisiae),熱帶假絲酵母C

14、andidatropicalis，產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum、黑曲霉Aspergillusniger、黑根霉Rhizopusnigricans。2. 試劑%美藍染色液、石炭酸復紅染色液、美藍染色液以pH6.0的mol/L磷酸緩沖液配制、碘液、的中性紅染色液、5%孔雀綠，0.5%沙黃液、95%乙醇、乳酸苯酚固定液、棉藍染色液、20%甘油。3. 儀器及用具蓋玻片、載玻片、鑷子、接種環(huán)、顯微鏡、涂布器、玻璃紙、打孔器。透明膠帶、剪刀、圓形濾紙片、細口滴管、鑷子。四、操作步驟()放線菌的形態(tài)觀察1. 觀察自然生長狀態(tài)的放線菌用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的5406菌培養(yǎng)皿中的一張

15、蓋玻片，將其反面附著的菌絲體擦凈，然后將長有菌的一面向上放在潔凈的載玻片上，分別用低倍鏡、高倍鏡觀察找出3類菌絲及其分生抱子。注意放線菌的基內菌絲、氣生菌絲的粗細和色澤差異。2. 水封片觀察取一滴美藍染色液置于載玻片中央，將用搭片法培養(yǎng)棘抱小單抱菌培養(yǎng)皿中的蓋玻片取出，并將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀察其分生抱子及基內菌絲。(二) 酵母菌的形態(tài)觀察1. 酵母菌的活體染色觀察及死亡率的測定以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。(2) 取美藍染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻3min,加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母的個體形態(tài)

16、，區(qū)分其母細胞與芽體，區(qū)分死細胞(藍色)與活細胞(不著色)。(3) 在一個視野里計數(shù)死細胞和活細胞，共計數(shù)5-6個視野。死亡率x100%酵母菌死亡率一般用百分數(shù)來表示，以下式來計算：2. 酵母菌液泡系的活體觀察于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5min,加蓋玻片在顯微鏡下觀察。細胞無色，液泡呈紅色。3. 酵母的假菌絲的觀察取一無菌載玻片浸于溶化的PDA培養(yǎng)基中，取出放在濕室培養(yǎng)的支架上，待培養(yǎng)基凝固后，進行酵母菌劃線接種，然后將無菌蓋玻片蓋在接菌線上（圖4-1）,28°C培養(yǎng)2-3d后，取出載玻片，擦去載玻片下面的培養(yǎng)基，在顯微鏡下直接觀察?？梢姷?/p>

17、芽殖酵母形成的藕節(jié)狀假菌絲，裂殖酵母則形圖2-1酵母菌假菌絲的培養(yǎng)圖2-2酵母菌的假菌絲形態(tài)A.藕節(jié)狀假菌絲B.竹節(jié)狀假菌絲（三）霉菌觀察1. 霉菌的形態(tài)觀察采用濕室培養(yǎng)法培養(yǎng)霉菌。可從培養(yǎng)16-20h開始，連續(xù)觀察，了解抱子的萌發(fā)、菌絲體的生長分化和子實體的形成過程。將濕室內的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛雷、根霉等霉菌的形態(tài)，重點觀察菌絲是否有分隔，曲霉和青霉的分生抱子形成特點，曲霉的足細胞，根霉和毛霉的抱子囊和抱囊抱子。繪圖。2. 粘片觀察取一滴棉藍染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。3. 假根觀察將培養(yǎng)

18、根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內的載玻片標本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根上分化出的抱子囊梗、抱子囊、抱囊抱子以及兩個假根間的匍匐菌絲，觀察時注意調節(jié)焦距以看清各種構造。五、注意事項1放線菌的生長速度較慢，培養(yǎng)期較長，在培養(yǎng)操作中特別注意無菌操作，嚴防雜菌污染。2. 通過微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細胞。六、實驗報告1. 繪制自然生長狀態(tài)下放線菌的形態(tài)。2. 繪制酵母菌細胞。3. 繪制根霉、青霉、曲霉形態(tài)圖，標示各部分名稱。七、問題和思考1. 用插片法和搭片法如何制備放線菌標本，其主要優(yōu)點是什么?可否用此法觀察其他微生物?為什么?2. 酵

19、母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區(qū)別？3什么叫載玻片濕室培養(yǎng)？它適用于觀察怎樣的微小物，有何優(yōu)點？附錄：()插片法和搭片法培養(yǎng)放線菌1插片法(圖2-3A)(1) 制平板、接種用冷卻至約50°C的高氏1號瓊脂培養(yǎng)基倒平板每皿約20mL?？捎脙煞N方法接菌：先接種后插片：冷凝后用接種環(huán)挑取少量斜面上的5406菌抱子，用平板培養(yǎng)基的一半面積作來回劃線接種接種量可適當擴大。先插片后接種：用平板培養(yǎng)基的另一半面積進行。(2) 插片及培養(yǎng)用無菌鑷子取無菌蓋玻片，在已經(jīng)接種平板以45C角斜插入培養(yǎng)基內，插入深度約占蓋玻片1/2的長度(圖4-3A)。同時，在另一半未經(jīng)接種的部位以同樣方式插

20、入數(shù)塊蓋玻片，然后接種少量5406菌抱子至蓋玻片一側的基部，但僅接種于其中央位置約占蓋玻片寬度的一半左右，以免菌絲蔓延至蓋玻片的另一側，將插片平板倒置于28C，培養(yǎng)3-7d。A0圖2-3放線菌的插片和搭片示意圖A插片法B搭片法2.搭片法(圖2-3B)（1）開槽及接種用無菌打孔器在凝固后的平板培養(yǎng)基上打洞數(shù)個，并將棘抱小單抱菌抱子劃線接種至洞內邊緣。（2）搭片及培養(yǎng)在接種后的洞面上放一無菌蓋玻片，平板倒置于28°C，培養(yǎng)3-7do（二）霉菌的培養(yǎng)1霉菌的載片濕室培養(yǎng)1準備濕室在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一U形載玻片擱架，在擱架上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎.經(jīng)1

21、21C濕熱滅菌30min,置60C烘箱中烘干，備用。2取菌接種用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌抱子至濕室內的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的抱子兩處。接種時只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可（務必記住接種的位置）。3加培養(yǎng)基用無菌細口滴管吸取少量融化約60C的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處.培養(yǎng)基液應滴得圓而薄，其直徑約為cm（滴加量一般以1/2小滴為宜）。4加蓋玻片在培養(yǎng)基未徹底凝固之前，用無菌鑷子將皿內蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當接近，但不能壓扁.否則不透氣。5倒保濕劑每皿倒入約3mL20%的無菌甘油，使皿內的濾紙完全潤滑，以保持皿內濕度。皿蓋上注明

22、菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置28C恒溫培養(yǎng)3-5do2.黑根霉假根的培養(yǎng)（圖2-4將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50C倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的1/2，冷凝后，用接種環(huán)沾取根霉抱子，在平板外表劃線接種，然后將平皿倒置，在皿蓋內放一無菌載玻片，于28C培養(yǎng)2-3d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結構。/一卜_L'-i-«-*F|圖2-4根霉假根的培養(yǎng)實驗三培養(yǎng)基的配制、消毒和滅菌一、實驗目的和內容一實驗目的1. 明確配制培養(yǎng)基的原理，了解消毒和滅菌的原理。2. 學習和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步

23、驟。3. 掌握各種滅菌方法的操作步驟。二實驗內容1.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA的配制。2高壓蒸汽滅菌法、干熱滅菌法、過濾除菌法。二、實驗原理培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖和代謝的營養(yǎng)基質。培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因子及水分等。培養(yǎng)基還應具有適宜的pH、一定的緩沖能力、一定的氧化復原電位及合適的滲透壓。在液體培養(yǎng)基中加入0.5-1%的瓊脂配制為半固體培養(yǎng)基，加入1-2%的瓊脂配制為固體培養(yǎng)基。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的多糖，是應用最廣的凝固劑。瓊脂在96-100°C融化，46C以下凝固。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后使用。培養(yǎng)基或其他

24、液體的滅菌一般是用高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌。其原理是在密閉的高壓滅菌鍋中，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽，增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點提高，得到高于100C的溫度，導致菌體蛋白質凝固變性到達完全滅菌的目的。培養(yǎng)用的玻璃器皿通常采用干熱滅菌法。干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而到達滅菌的目的。細胞內的蛋白質凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高160170C，時間要長12h，但干熱滅菌溫度不能超過180C，否則，包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起

25、燃燒。過濾除菌是通過機械作用濾去液體或氣體中的細菌、真菌孢子等的方法，適用于酶液、抗生素等不耐熱溶液的滅菌。三、實驗材料和用具1. 試劑牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO7H2O、1%鏈霉素溶液。2. 儀器及用具試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、稱量紙、試管架、棉花、牛皮紙、記號筆、皮筋、紗布、手提式高壓蒸汽滅菌鍋、電熱烘箱、過濾除菌器、培養(yǎng)皿塑料管帶刻度。四、操作步驟一玻璃器皿的洗滌和包裝1玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培

26、養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2滅菌前玻璃器皿和塑料管的包裝培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內，加蓋滅菌。塑料管將蓋子擰松后，用報紙包好。包裝后的培養(yǎng)皿和塑料管須經(jīng)滅菌之后才能使用。（二）培養(yǎng)基的配制1.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基。其配方如下:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g,瓊脂13g,水1000mL,pH-。1稱量按實際用量計算后,按配方稱取

27、各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或外表皿中稱量,用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量,隨后放入熱水中,牛肉膏便與稱量紙別離,立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮,故稱量時要迅速。2加熱溶解在燒杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉網(wǎng)上,小火加熱,并用玻棒攪拌,待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。假設配制固體培養(yǎng)基,則將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中,再加熱融化,此過程中需不斷攪拌,以防瓊脂糊底或溢出,最后補足所失的水分。調pH檢測培養(yǎng)基的pH，假設pH偏酸，可滴加1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至到達所需pH范圍。假設偏堿，則用1mol/LHC1進行調節(jié)。pH的

28、調節(jié)通常放在加瓊脂之前。應注意pH值不要調過頭，以免回調而影響培養(yǎng)基內各離子的濃度.液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結果的觀察。供一般使用的培養(yǎng)基.此步可省略。5分裝披實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內。分裝時可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5,滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內以不超過其容積內一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/4為宜.滅菌后垂直待凝。6加棉塞試管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脫脂棉）制作的棉塞，棉塞制作方法則圖1-1。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到

29、防止雜菌侵入和有利透氣的作用。要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的透氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料蓋代替棉塞。圖1-1試管棉基的制作A制作.過程；B制件田超包扎加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。假設培養(yǎng)基分裝于試管中，則應先把試管扎成捆后，再于棉塞外包一層牛皮紙。然后用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8滅菌將上述培養(yǎng)基于121.0°C濕熱滅菌20min。如因特殊情況沒能及時滅菌，則應放人冰箱內暫時保存。9擺斜面滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調整斜度，使斜面長

30、度不超過試管總長的一半。10無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入37°C溫箱中培養(yǎng)24-48h,無菌生長時可以使用，或放置在冰箱或清潔的櫥內，備用。2高氏1號培養(yǎng)基高氏1號培養(yǎng)基是用于別離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaClg，K2HPO43H2Og，MgSO47H2Og，F(xiàn)eSO47H2O1g,瓊脂13g,蒸餾水1000mL,-。1稱量和溶解經(jīng)計算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調成糊狀，再加至少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。對微量成分FeSO47H2O可先配成高濃度的

31、貯備液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO47H2O，配成濃度為0.01g/mL的貯備液，再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。待所有藥品完全溶解后補充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2pH調節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。3. 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA的配制PDA是用于別離真菌的常用培養(yǎng)基。去皮馬鈴薯200g；葡萄糖20g；瓊脂13g；自來水1000mL。1培養(yǎng)基配制將馬鈴薯洗凈去皮，稱取200g，切成小塊，放入鍋中加水1000mL,煮沸半小時。用雙層潔凈紗布過濾去渣，在濾液中加葡萄糖或蔗糖2

32、0g,加水補足1000mL。這樣配成的培養(yǎng)液一般呈酸性，用于培養(yǎng)真菌時，不必矯正它的酸度。然后加入瓊脂13g,加熱使瓊脂完全融化，同時補足應有的水量。趁熱分裝在試管或三角瓶中，加棉花塞后滅菌。2鏈霉素的加入鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時，將培養(yǎng)基融化后待溫度降全45C左右時才能加入?？上葘㈡溍顾嘏涑?%的溶液（配好的鏈霉素溶液保存于-20C）,在1000mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素mL,使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30昭。三滅菌1.高壓蒸汽滅菌法15高壓蒸汽滅菌法適用于培養(yǎng)基、無菌水、工作服等物品的滅菌。1加水將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，以水面與三角架相平為宜2裝料將裝料桶放回鍋內，裝

33、入待滅菌的物品。裝有培養(yǎng)基的容器放置時要防止液體溢出，瓶塞不要緊貼桶壁，以免冷凝水沾濕棉塞。3加蓋將蓋上與排氣孔相連接的排氣軟管插人內層滅菌桶的排氣槽內，擺正鍋蓋，對齊螺口，然后以同時旋緊相對的兩個螺栓的方式擰緊所有螺栓，并打開排氣閥。4排氣用電爐或煤氣加熱待水煮沸后，水蒸汽和空氣一起從排氣孔排出.一般排出的氣流很強并有噓聲時，說明鍋內空氣已排凈（沸后約5min）。5升壓當鍋內空氣排凈時，即可關閉排氣閥，壓力開始上升。6保壓當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，計時并維持壓力至所需時間。本實驗用121°C,20min滅菌。7降壓到達所需滅菌時間后，關閉熱源，讓壓力自然下降到零后，打開排

34、氣閥，放凈余下的蒸汽后，再打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內剩水。8無菌檢查將已滅菌培養(yǎng)基于37C培養(yǎng)24h,無雜菌生長，即可待用。2.干熱滅菌法干熱滅菌法適用于玻璃器皿，如試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、移液管等的滅菌。1裝入待滅菌物品預先將各種器皿用紙包好或裝入金屬制的培養(yǎng)皿筒、移液管筒內，然后放入電熱烘箱中。2升溫關好電烘箱門，打開電源開關，旋功恒溫調節(jié)器至所需溫度刻度（本實驗所需為160），此時烘箱紅燈亮，說明烘箱已開始加熱，當溫度上升至所設定溫度后，則烘箱綠燈亮，表示巳停止加溫。當溫度升到所需溫度后，維持此溫度1.5h。4降溫切斷電源，自然降溫。5取出滅菌物品待電烘箱內溫度降到70°C

35、以下后，才能打開箱門，取出滅菌物品。3. 過濾除菌法有些物質，如抗生素、血清、維生素等易受熱分解，因而要采用過濾除菌法。1過濾器的種類濾膜過濾器：由醋酸纖維素、硝酸纖維素等制成，有孔徑大小不同的多種規(guī)格（如Am、0.22Am、Am、0.45Am等），過濾細菌常用0.45Am孔徑。其優(yōu)點是吸附性小，即溶液中的物質損耗少，濾速快,每張濾膜只使用1次，不用清洗。蔡氏過濾器：是一種金屬制成的過濾漏斗，其過濾部分是一種用石棉纖維和其他填充物壓制成的片狀結構。溶液中的細菌通過石棉纖維的吸附和過濾而被去除，但對溶液中其他物質的吸附性也大。每張纖維板只能使用1次。玻璃濾器：是一種由玻璃制成的過濾漏斗，其過濾部

36、分是由細玻璃粉燒結成的板狀構造。玻璃濾器規(guī)格很多，5號孔徑2-5Am和6號孔徑小于2Am適用于過濾細菌。其優(yōu)點是吸附量少，但每次使用后要洗凈再用。清洗方法是：用水充分沖洗，然后浸于含1%KNO3的濃硫酸中24h,再用蒸餾水抽洗數(shù)次。在抽洗液中加入數(shù)滴BaCl2扎，至不出現(xiàn)BaSO4沉淀時，即表示巳洗凈。2過濾裝置圖2-2針頭式過濾器按圖2-1進行安裝，為阻止空氣中細菌進入濾瓶而在接管處塞入棉花、外用紙包好進行121C濕熱滅菌20min。為加快過濾速度，一般用負壓抽氣過濾.即在自來水龍頭上裝一抽氣裝置，利用自來水流造成負壓。假設接真空泵進行抽濾則速度更快。微量溶液過濾時，可用圖2-2的針頭式過濾

37、器。五、注意事項1. 稱藥品用的牛角匙不要混用；稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋：調pH時要小心操作，防止回調。2. 不同培養(yǎng)基各有配制特點，要注意具體操作。3. 分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基在管瓶上，以免污染過的棉塞再引起試劑污染。4. 使用滅菌鍋應嚴格按照操作程序進行，防止發(fā)生事故；滅菌時，操作者切勿擅自離開，待壓力下降到零后，才可打開鍋蓋。5干熱滅菌時電烘箱中物品不要擺得太擁擠，以免阻礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與電烘箱內壁的鐵板接觸以防包裝紙烤焦起火。6過濾除菌時應注意檢查過濾裝置各連接處是否漏氣，以防污染。六、實驗報告1. 記錄本實驗配制培養(yǎng)基的名稱、配方，并簡述其配制過程，指明要點。

38、2.記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件（溫度、壓力）。七、問題和思考1配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟?在操作過程中應注意些什么問題?為什么?2培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?假設不能及時滅菌應如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進行無菌檢查。3比較各種滅菌方法的原理及適用范圍。4高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅茵后不能驟然快速降落，并要在放凈鍋內蒸汽才能打開鍋蓋?實驗四土壤微生物的稀釋別離、純化及無菌操作技術一、實驗目的和內容一實驗目的1. 學習從土壤中別離微生物的方法。2.掌握常用的別離純化微生物的操作技術。二實驗內容1用稀釋法別離細菌、放線菌和霉菌。2用平板劃線法別離微生物。3斜

39、面接種及穿刺接種。二、實驗原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程成為微生物的別離與純化。常用的別離純化方法有：單細胞挑取法、平板劃線法和稀釋倒平板法。本實驗利用稀釋倒平板法從土壤中別離細菌、放線菌和霉菌?；驹頌椋簩⒑懈鞣N微生物的土壤懸液進行稀釋后涂布接種到各種選擇培養(yǎng)基平板上，在不同條件下培養(yǎng)，從而使各類微生物在各自的培養(yǎng)基上形成單菌落。單菌落是由一個細胞繁殖而成的集合體，即是一個純培養(yǎng)。三、實驗材料和用具1. 菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和普通變形菌(Protuesvulgaris)斜面菌種。2. 培養(yǎng)基巳滅菌的牛肉膏、高氏1號、

40、PDA固體培養(yǎng)基各1瓶。3. 試劑及儀器無菌水(帶玻璃珠)、滅過菌的塑料管及槍頭、80%乳酸、10%酚液、95%乙醇。無菌培養(yǎng)皿、土壤樣品、天平、稱量紙、藥勺、試管架、涂布器。四、操作步驟一土壤稀釋別離細菌、放線菌和霉菌1. 取土壤取表層以下5-10cm處的土樣放入滅菌的袋中備用，或放在4°C冰箱中暫存。2. 無菌操作制備土壤稀釋液1制備土壤懸液：稱土樣1g,迅速倒入帶玻璃珠的無菌水瓶中(玻璃珠用量以充滿瓶底為最好),振蕩5-10min使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。嵌次各眠SaL郵芒試管均詁4“5就無曲水號蚌曹培捽基潁tU號擠養(yǎng)華牛戲新隠莽無圖4-1稀釋法別離土壤微生物操

41、作過程(2)稀釋：用無菌移液管吸10-2的土壤懸液mL.放入mL無菌水中即為10-3稀釋液，如此重復，可依次制成10-3-10-8的稀釋液（圖2-1）。注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換用1支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于一次，以減少稀釋中的誤差。3.涂布法測定菌落數(shù)的方法1倒平板按無菌操作要求，在火焰旁操作（圖2-2），取融化并冷卻至不燙手的固體培養(yǎng)基（約50°C）,倒入無菌培養(yǎng)皿中，倒量以鋪滿皿底為限，平放桌上待其充分凝固，備用。24圖4-3平板涂布菌圖4-2倒平板的方法2接種量和培養(yǎng)基細菌：取10-6、10-7兩管稀釋液各1

42、mL,分別接入相應標號的平皿中，每個稀釋度接入兩個牛肉膏瓊脂平板中，涂布均勻。放線菌：取10-4、10-5兩管稀釋液，在每管中加入10%酚液5-6滴，搖勻，靜置片刻，然后分別從兩管中吸出0.2mL加入相應高氏1號培養(yǎng)基平皿中，涂布均勻。霉菌：取10-2、10-3兩管稀釋液各0.2mL,分別接入相應的PDA培養(yǎng)基中每100mL加入滅菌的乳酸1mL，涂布均勻。3培養(yǎng)將接種好的細菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于8-30C恒溫培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)1-2d放線菌培養(yǎng)5-7d,霉菌培養(yǎng)3-5d可用于觀察菌落，用于進一步別離純化或直接轉接斜面。（二）平板劃線別離微生物1.劃線別離使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待別離的斜面菌種中沾取少量菌樣在相應培養(yǎng)基平板中劃線別離，劃線的方法多樣，目的是獲得單個菌落，主要方法參見下列圖。S3-3爭犧聖鮭肓戀示韋屋剤霾小蔥嫌作：H.用轉聯(lián)班中，巨崔無劃退:.匚阻甘較黴肝譽悴卜趕餌耳敕，誦倉劃撫心：妄蜓書種環(huán)，煤送耳劃干-反.3培養(yǎng)方法同“土壤稀釋別離”。三斜面接種和穿刺接種1. 斜面接種(1) 取新鮮固體斜面培養(yǎng)基.分別做好標記(寫上菌名、接種日期、接種人等)，然后用無菌操作方法，把待接菌種接入以上新鮮培養(yǎng)基斜