引物設(shè)計(jì)原則

1、引物設(shè)計(jì)、軟件使用：推薦軟件：PrimerPremier5.0優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、顯示各種參數(shù)改變和可能的二聚體、異二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等缺點(diǎn)：沒有明顯缺點(diǎn)本地同類軟件：DNAClub;Oligo6.22;VectorNTISuit;Dnasis;Omiga;Dnastar;DNAMAN(LynnonBiosoft,Quebec,Canada).網(wǎng)上同類軟件：Primer3(WhiteheadInstitute開發(fā))；JaMBW(EuropeanMolecularBiologyLaboratoryofHeidelberg開發(fā))。0網(wǎng)站已引進(jìn)并調(diào)試好這兩種軟件。獨(dú)特之處

2、在于：對(duì)全基因組PCR的引物設(shè)計(jì)，可以將設(shè)計(jì)好的引物對(duì)后臺(tái)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)并排除引發(fā)錯(cuò)配的引物。因此建議經(jīng)常做全基因組PCR的用戶試用。、推薦操作：弓I物搜索：PrimerPremier5.0引物評(píng)價(jià)：Oligo6.22三、引物設(shè)計(jì)的原則：首先引物要跟模板緊密結(jié)合，其次引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在，再次引物不能在別的非目的位點(diǎn)引起DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。圍繞這幾條基本原則，設(shè)計(jì)引物需要考慮諸多因素，如引物長(zhǎng)度(primerlength)、產(chǎn)物長(zhǎng)度(productlength)、序歹UTm值(meltingtemperature)>AG值(internalsta

3、bility)、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(duplexformationandhairpin)、錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)(falseprimingsite)、引物及產(chǎn)物GC含量(composition),有時(shí)還要對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制酶切點(diǎn)，引進(jìn)突變等。以使用Oligo軟件分析設(shè)計(jì)引物為例，筆者總結(jié)出以下的要點(diǎn)：1. 引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74C,即Taq酶的最適溫度。2. 引物3'端的序列要比5'端重要。引物3'端的堿基一般不用A（3'端堿基序列最好是G、C、CG、GC）,因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的

4、引發(fā)效率相對(duì)比較高。另外引物間3'端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5'端序列對(duì)PCR影響不大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。3. 引物的GC含量一般為40-60%,以45-55%為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5'端增加As或Ts；而如果A-T比例過高，則同樣在5'端增加G威Cso但也有認(rèn)為：原來(lái)普遍認(rèn)為PCR引物應(yīng)當(dāng)有50%的

5、GC/AT比率的觀點(diǎn)其實(shí)是不對(duì)的，以人基因組DNA為模板，用81%AT的引物可以產(chǎn)生單一的、專一的、長(zhǎng)250bp,含有70%AT的產(chǎn)物。完全沒有必要復(fù)雜地去計(jì)算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。4. 引物所對(duì)應(yīng)模板序列的Tm值最女?在72c左右。（Tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到3'的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)），至少要在5580C之間5. AG值（自由能）反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的AG值最好呈正弦曲線形狀，即5'端和中間AG值較高，而3'端AG值相對(duì)較低，且不要超過9

6、（AG值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。3末端雙鏈的AG是02kcal/mol時(shí)，PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，隨著其絕對(duì)值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在6時(shí)只有40%、到8時(shí)少于20%、而10時(shí)接近于0。6. 可能的錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯(cuò)誤引發(fā)率高，錯(cuò)誤引發(fā)的引發(fā)率一般不要高過100,如此可保證不出非目的產(chǎn)物的假帶。但對(duì)于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為450以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為130,并且不好找其他更合適的引物，那么這對(duì)引物也是可以接受的。7. Fr

7、q曲線為Oligo6新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片斷存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用Frq值相對(duì)較低的片斷。8. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5,否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR正常反應(yīng)不能進(jìn)行，與二聚體相關(guān)的一個(gè)參數(shù)是堿基的分布，3'端的連續(xù)GGG或CCC會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定,越不符合要求。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其AG為一3kcal/mol的自身互補(bǔ)引物也可以得到不錯(cuò)的結(jié)果，但是如果它的3'末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時(shí)就很麻煩，即會(huì)引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。

8、當(dāng)然，如果發(fā)夾環(huán)在5'末端對(duì)反應(yīng)就沒有多大的影響了。9. 以公式（4XG/C+2XA/T-5）計(jì)算Tm值，即退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應(yīng)的退火溫度。4-6C的差別似乎對(duì)PCR產(chǎn)量影響不大。最好，保證每個(gè)引物的Tm值相匹配，且在70-75C范圍內(nèi)10. 要知道，更重要的因素是模板與穩(wěn)定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因?yàn)镈NA的解鏈溫度也取決于它的長(zhǎng)度，所以有的研究者喜歡設(shè)計(jì)很長(zhǎng)，而不求它很穩(wěn)定的引物?？墒牵锾L(zhǎng)就難以避免形成二聚體和自身互補(bǔ)，因此，一般還是不用為好。如果期待的產(chǎn)物長(zhǎng)度等于或小于500bp,選用短的（1618mer）的引物

9、：若產(chǎn)物長(zhǎng)5kb,則用24mer的引物。有人用2023mer引物得至|J40kb的產(chǎn)物。11. 在DNA測(cè)序和PCR中最好用5末端用I定（如GC含量較多），而3末端不太穩(wěn)定（如AT含量較多）的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng)。這就是基于引物內(nèi)部穩(wěn)定性的經(jīng)驗(yàn)之談。其3'末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應(yīng)中能起好作用的原因在于，接近或在3'末端上的堿基與非靶位點(diǎn)堿基所形成的配對(duì)的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會(huì)產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應(yīng)，引物的5末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3'末端的寡核甘酸不需要其所有的核

10、甘酸序列都與靶序列配對(duì)，只憑借其3'末端與靶序列任何位點(diǎn)的牢固配合就可以引發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。無(wú)論如何，寡核甘酸3末端最后5個(gè)核甘酸的穩(wěn)定性小于9kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核甘酸3'末端越不穩(wěn)定，假引發(fā)的可能性越低。12. 如果用3末端低穩(wěn)定性的引物，反應(yīng)的最適退火溫度范圍會(huì)不尋常的寬。這就可以不經(jīng)過事先的最佳化實(shí)驗(yàn)就能在最佳條件下進(jìn)行反應(yīng)。13. 引物的唯一性：為了放大單個(gè)的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應(yīng)當(dāng)是唯一的，即在模板中沒有重復(fù)序列。如果用哺乳動(dòng)物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復(fù)元件來(lái)核對(duì)想用的引物的互補(bǔ)性。由此也可知

11、，應(yīng)當(dāng)避免使用同寡聚物（如一AAAAAA）和二核甘酸重復(fù)（如一ATATAT）。14. 引物和產(chǎn)物的Tm值不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。定下引物的Tm值范圍之后即可定下引物的長(zhǎng)度范圍。15. 對(duì)引物的修飾一般是增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)參考載體的限制酶識(shí)別序列確定，常常對(duì)上下游引物修飾的序列選用不同限制酶的識(shí)別序列，以有利于以后的工作。16. 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件較差，比如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；有時(shí)PCR產(chǎn)物要作為克隆對(duì)象插入到載體中表達(dá)，因此PCR引物設(shè)計(jì)的可選擇度很低。遇到這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件，這時(shí)，使用自

12、動(dòng)搜索引物及正確地評(píng)價(jià)引物可使研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)心中有數(shù)。17. 在設(shè)計(jì)克隆PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低，這種PCR需要靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。18. 如擴(kuò)增出多條帶（引發(fā)錯(cuò)配所致），不出目的帶或出目的帶很弱（引物引發(fā)效率低下）四、Oligo6.22使用技巧1. Oligo的主要功能集中在Analyze菜單里，只要把它弄懂了，其他的就很簡(jiǎn)單了2. Frq為6.22的新功能，為鄰近67個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性3. 因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的c

13、ascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tili方式4. 當(dāng)結(jié)束檢測(cè)，按Alt+P鍵就出來(lái)PCR窗口，其中總結(jié)性地給出該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm值等參數(shù)，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)。五、AG概念：用于估測(cè)可能形成DNA或RNA雙鏈的穩(wěn)定性：在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的。在熱動(dòng)力學(xué)中，這樣的性質(zhì)以雙鏈形成時(shí)的自由能（AG來(lái)表示?，F(xiàn)在大多采用Breslauer等人提出的以最接近的相鄰核甘酸的動(dòng)力學(xué)數(shù)值（自由能）來(lái)預(yù)測(cè)雙鏈穩(wěn)定性的方法。為簡(jiǎn)化起見，所有的計(jì)算都在25c條件下進(jìn)行。此時(shí)，最接近的相鄰核甘酸的自由能是:A個(gè)(5'

14、核甘酸第二個(gè)核甘酸dAdCdGdTdA1.9-1.3-1.6-1.5dC1.9-3.1-3.6-1.6dG-1.6-3.1-3.1-1.3dT-1.0-1.6-1.9-1.9AG(kcal/mol)如：雙鏈d(ACGG/CCGT)的AG是：AG(ACGG)=AG(AC)+AG(CG升AG(GG)=(1.3+3.6+3.1)=8.0kcal/mol此計(jì)算方法特別適用于測(cè)定其3'末端會(huì)形成雙鏈的引物的相容性。也可以用來(lái)計(jì)算發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的AGo不過，這時(shí)需要根據(jù)環(huán)區(qū)內(nèi)核甘酸的數(shù)量添加一定的數(shù)值。如3個(gè)核甘酸時(shí)為5.2kcal/mol;4個(gè)時(shí)為4.5;5個(gè)為4.4;6個(gè)是4.3;7和8個(gè)為4.1

15、kcal/mo1。六、按照氨基酸序列設(shè)計(jì)寡核甘酸：按照多肽的氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)PCR引物或雜交探針是最常用的實(shí)驗(yàn)手段，尤其是在試圖釣取”一個(gè)蛋白質(zhì)的基因時(shí)。此時(shí)要注意的問題有：(1)寧可用簡(jiǎn)并引物，也不用猜測(cè)的引物。氨基酸密碼子的簡(jiǎn)并性給予引物設(shè)計(jì)以可塑性，這比用猜測(cè)的密碼子要好得多。有人用1024個(gè)簡(jiǎn)并引物得到很好的結(jié)果。但是，應(yīng)當(dāng)避免在一個(gè)區(qū)域內(nèi)有很高的簡(jiǎn)并性。但也有簡(jiǎn)并性低使引物不工作的報(bào)道。(2)引物與模板的錯(cuò)配。一般認(rèn)為，所用引物與模板有15%20%的錯(cuò)配，PCR的效果還能接受。但是，引物3末端的錯(cuò)配比同樣錯(cuò)配率的5'末端錯(cuò)配會(huì)引起更嚴(yán)重的問題。在最后4個(gè)堿基中有2個(gè)錯(cuò)配的引物

16、，其PCR產(chǎn)量急劇下降。但是，當(dāng)核甘酸濃度高時(shí)，3沫端有錯(cuò)配的引物還能被Tag聚合酶很好地利用。在0.8mmol/L時(shí)，大多數(shù)3'末端錯(cuò)配引物可以接受，雖然非專一產(chǎn)物比較多，DNA合成的忠實(shí)性也下降。即使在低核甘濃度下，還會(huì)有少量從錯(cuò)配堿基出發(fā)的合成，因此，在開始的PCR循環(huán)中把退火時(shí)間增加到35分鐘，比之于用標(biāo)準(zhǔn)退火時(shí)間和高濃度核甘酸能夠產(chǎn)生質(zhì)量更好的所求產(chǎn)物。(3)在用唯一性引物時(shí)，建議用0.2mmol/L或更低的總核甘酸濃度，因?yàn)楦邼舛葧?huì)增加錯(cuò)誤參入的比率。(4)簡(jiǎn)并寡核甘酸時(shí)，PCR應(yīng)當(dāng)在比較高的引物濃度下進(jìn)行，即13mol/L而不是0.2科mol/L,因?yàn)樵诜磻?yīng)混合物中的大多

17、數(shù)寡聚物并不是被用來(lái)引發(fā)專一的反應(yīng)，而只是產(chǎn)生高的背景而已。七、復(fù)雜模板的擴(kuò)增體系：所謂復(fù)雜模板，是指體系中的DNA種類和數(shù)量較多，不能以此引物對(duì)所有的模板一一比較來(lái)計(jì)算其異位引發(fā)的可能性的情形。此情形下與簡(jiǎn)單模板擴(kuò)增相比較，還需要遵循下面一些原則以盡可能的避免異位擴(kuò)增。1 .引物3'末端的穩(wěn)定性。引物3'末端的穩(wěn)定性由引物3'末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個(gè)堿基的AGo此值的大小對(duì)擴(kuò)增有較大的影響，負(fù)值大，則3'末端穩(wěn)定性高，擴(kuò)增效率更高，同時(shí)也更易于異位引發(fā)。因此在復(fù)雜模板的擴(kuò)增體系中，3'末端5聚體的AG應(yīng)大于-9.0kcal/mol。2 .堿

18、基組成應(yīng)盡量隨機(jī)分布，避免單一堿基的聚集。這樣可避免引物在模板的單一堿基富集區(qū)引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)。3 .引物3'末端應(yīng)盡量避免T,相較而言，3'末端的T對(duì)于此處的錯(cuò)配更為寬容。八、測(cè)序引物設(shè)計(jì)時(shí)的注意點(diǎn)：1 .對(duì)特異性的標(biāo)準(zhǔn)掌握更嚴(yán)格一些，也比普通PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)更優(yōu)先考慮特異性。因?yàn)槿绻跍y(cè)序反應(yīng)中，如果引物與模板在非預(yù)期位置退火并引發(fā)鏈延伸，會(huì)對(duì)結(jié)果對(duì)來(lái)很大的干擾甚至造成結(jié)果無(wú)法識(shí)讀。2 .Tm值適當(dāng)高一些?，F(xiàn)在大部分測(cè)序反應(yīng)均選用耐熱的測(cè)序級(jí)DNA聚合酶來(lái)催化，并采用PCR的熱循環(huán)程序。選用Tm值稍高一些，甚至退火溫度接近酶的最佳延伸溫度的引物，有助于使反應(yīng)順利跨過待測(cè)模板的二

19、級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，也有助于降低非特異反應(yīng)。九、關(guān)于引物5'端引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn):自從發(fā)現(xiàn)Taq酶具有非模板依賴的在新生成DNA鏈的3'末端加上一個(gè)A的特性以來(lái)，在引物5'端引入酶切位點(diǎn)從而方便后續(xù)克隆步驟的方法的應(yīng)用大大減少，取而代之的是利用帶T載體的粘端連接來(lái)包裝PCR產(chǎn)物。若實(shí)驗(yàn)需要在引物5'端引入相關(guān)酶切位點(diǎn)時(shí)，除了需要清楚所選用的酶的識(shí)別序列之外，還需要了解此酶是否有位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)效應(yīng)，即酶的活性是否因?yàn)樽R(shí)別位點(diǎn)在序列的不同位置而不同，并根據(jù)此點(diǎn)來(lái)選擇5'末端的保護(hù)堿基。此外保護(hù)堿基的另外一個(gè)作用就是保護(hù)酶切位點(diǎn)不被Taq酶具有的微弱的5'一沙卜切酶

20、活性破壞。十、簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)：概念：簡(jiǎn)并引物的出現(xiàn)是出于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性。有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸的保守序列反推到DNA水平設(shè)計(jì)引物。眾所周知，大多數(shù)氨基酸(二十種常見結(jié)構(gòu)氨基酸中的十八種)的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA序列時(shí)，就遇到部分堿基的不確定性。這種不確定性因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異，比如在線粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣的，甚至植物線粒體與無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體以及無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體的遺傳密碼都不盡相同。Premier可以針對(duì)各種不同的遺傳密碼規(guī)律設(shè)定不同的DNA和氨基酸的相互轉(zhuǎn)換，這取決于被分析序列的出處。這樣設(shè)計(jì)出來(lái)的引物實(shí)際上是多種序列的混和物，在某些位點(diǎn)有所變化，

21、但大部分還是相同的，稱之為簡(jiǎn)并引物。Primier軟件給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲大核(CiliateMacronuclear),無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體(InvertebrateMitochondrion),支原體(Mycoplasma),植物線粒體(PlantMitochondrion),原生動(dòng)物線粒體(ProtozoanMitochondrion),一般標(biāo)準(zhǔn)(Standard),脊椎動(dòng)物線粒體(VertebrateMitochondrion),和酵母線粒體(YeastMitochondrion)。概念：簡(jiǎn)并引物是根據(jù)某些特定的目的而選用的一組混合物，指在寡核甘酸的某一

22、位置(一個(gè)簡(jiǎn)并位)上有多個(gè)堿基存在于不同的寡核甘酸分子中，如一組簡(jiǎn)并引物中有N1,N2,N3三個(gè)簡(jiǎn)并位，在N1上有三個(gè)堿基簡(jiǎn)并，N2二個(gè)，N3四個(gè)，則此簡(jiǎn)并引物中共有3*2*4=24種寡核甘酸分子。簡(jiǎn)并引物常用的幾個(gè)方面：(1)從已知蛋白到相關(guān)核酸分子的研究；(2)用一組引物擴(kuò)增一類分子。在上述兩個(gè)主要應(yīng)用中，需要注意的幾個(gè)主要問題：從蛋白到核酸，應(yīng)注意:1)盡量選擇簡(jiǎn)并度低的氨基酸區(qū)域?yàn)橐镌O(shè)計(jì)區(qū)。如蛋氨酸和色氨酸均只有一個(gè)密碼子。2)充分注意物種對(duì)于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡(jiǎn)并性。3)引物不要終止于簡(jiǎn)并堿基，對(duì)于大多數(shù)氨基酸殘基來(lái)說，意味著引物3'

23、末端不要位于密碼子的第三位。4)在簡(jiǎn)并度高的位置，可用次黃喋吟(dl)代替簡(jiǎn)并堿基。5)以上幾點(diǎn)，遵循的總的原則為：盡量降低引物的簡(jiǎn)并度，尤其在3'末端或近3'末端。用一對(duì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增一類DNA分子時(shí)，同樣遵循上述總的原則，即盡量降低引物的簡(jiǎn)并度，尤其在3'末端或近3'末端。在此種應(yīng)用中，應(yīng)先利用工具軟件(多序列對(duì)準(zhǔn)比較軟件)或其它工具找到這些分子的保守區(qū)，然后根據(jù)共有序列，應(yīng)用上面所述的一些原則來(lái)設(shè)計(jì)所需要的引物。DegeneratePrimersForamplificationofcognatesequencesfromdifferentorganisms,

24、orfor"evolutionaryPCR",onemayincreasethechancesofgettingproductbydesigning"degenerate"primers:thesewouldinfactbeasetofprimerswhichhaveanumberofoptionsatseveralpositionsinthesequencesoastoallowannealingtoandamplificationofavarietyofrelatedsequencesForexample,Compton(1990)describes

25、using14-merprimersetswith4and5degeneraciesasforwardandreverseprimers,respectively,fortheamplificationofglycoproteinB(gB)fromrelatedherpesviruses.Thereverseprimersequencewasasfollows:TCGAATTCNCCYAAYTGNCCNTwhereY=T+C,andN=A+G+C+T,andthe8-base5'-terminalextensioncomprisesaEcoRIsite(underlined)andfl

26、ankingspacertoensuretherestrictionenzymecancuttheproduct(theNewEnglandBiolabscataloguegivesagoodlistofwhichenzymesrequirehowlongaflankingsequenceinordertocutstubends).Degeneraciesobviouslyreducethespecificityoftheprimer(s),meaningmismatchopportunitiesaregreater,andbackgroundnoiseincreases;also,incre

27、aseddegeneracymeansconcentrationoftheindividualprimersdecreases;thus,greaterthan512-folddegeneracyshouldbeavoided.However,Ihaveusedprimerswithashighas256-and1024-folddegeneracyforthesuccessfulamplificationandsubsequentdirectsequencingofawiderangeofMastrevirusesagainstabackgroundofmaizegenomicDNA(Ryb

28、ickiandHughes,1990).MMestrevirusGenomeStructureMSVWDVDSVttcatccaatcttcatc2207TGAGCCAATCTTCGTC.4.211TGCAGCCAGTCTTCATC220TTCATCCAATCTTCATC220to.*.GCCCAAGTAGATTTTCCb.GCC6GGAAGTCTTTCCb.GCCCAAGAAGTCTTTC匚b.GCCCAAGTAGACTTTCCifrw*Pr】mersequu口匕七eF:5r-T*A*CCA"CTTOTC-3'Rh51-GGAAA*CT*C*TGGGC-3Primerseq

29、uenceswerederivedfrommultiplesequencealignments;themismatchpositionswereusedas4-basedegeneraciesfortheprimers(shownasstars;5inFand4inR),asshownabove.Despitetheirdegeneracy,theprimerscouldbeusedtoamplifya250bpsequencefromvirusesdifferinginsequencebyasmuchas50%overthetargetsequence,and60%overall.Theyc

30、ouldalsobeusedtoverysensitivelydetectthepresenceofMaizestreakvirusDNAagainstabackgroundofmaizegenomicDNA,atdilutionsaslowas1/109infectedsap/healthysap(seebelow).10ethidiumbromidestaining10fgtemplatew-9dilution(plasmid)ofmaizeDNASomegroupsusedeoxyinosine(di)atdegeneratepositionsratherthanusemixedolig

31、oShisbase-pairswithanyotherbase,effectivelygivingafour-folddegeneracyatanypostionintheoligowhereitispresent.Thislessensproblemstodowithdepletionofspecificsingleoligosinahighlydegeneratemixture,butmayresultintoohighadegeneracywherethereare4ormoredIsinanoligo.1一、克隆PCR弓|物的設(shè)計(jì)Generalguidelinesontheprimer

32、designforPCRcloning1. Complementarysequenceof18-20basesissufficientinmostcasesifyoudon'tbothertocalculateTm(seelinksbelowifyouwanttocalculateTm).2. Ifyourproteinisnotfusedtoanything,youshouldaddastartcodon(ATG)immediatelyinfrontofyourgeneintheforwardprimer,andthecomplementofastopcodon(TAA/TGA/TA

33、G-TAAispreferred)immediatelyafterinyourreverseprimer.3. Introduceoneormorerestrictionsitesdependingonhowyouwishtoligatethegeneintotheexpressionvector-e.g.ifyouusepET21b,useNdel(convenientlycontainingthestartcodon)fortheforwardprimer,andXholforthereverseprimerifyouwishtofusetheproteintoaC-terminalHis

34、-tag.Makesurethattherestrictionsiteschosenareabsentinthegene.4. Putinextrabasesatthe5'endtoallowforefficientdigestbyrestrictionenzymes-consultNEBcatalog.8-10aremorethansufficientinmostifnotallcases(it'sactuallyabitofoverkillas3-4aresuitableformost).TheseextrabasesareunnecessaryifyouaredoingT

35、Acloning.5. TwoormoreoftheseextrabasescanformaGCclampatthe5'end.6. AvoidtoomanyGorCatthe3'end.7. Avoidlongrunsofsinglenucleotide.8. Makesuretheforwardandreverseprimerdon'tformprimerdimer(esp.nocomplementarysequencesatthe3'end)orformsignificantsecondarystructure.SeeAlkamiBiosystemPrim

36、erDesignonlineforprimerdesignsites.9. Itmaybeuseful(thoughnormallyunnecessary)tochecksequencesofgeneorvectorforhomologyof70%ormorewiththeprimertoavoidmultiplePCRproducts.Theaboveguidelinesshouldbesufficientinmostcases,butifyou'dlikemoredetails,seetipsonprimerdesign,notesonprimerdesign,Tavi's

37、PCRguide,andPrimerdesignworkshop.Therearealsoanumberofweb-sitesforprimerdesignatAlkamiBiosystemsandatBioGuide.ForwardOligoGeneSequenceExampleAGAGACACTGGGACCGTCTG3"NNNNNNNNNAGAGACAGTGGGACCGTCTGGGGTGCCCTBeginningofgenesequenceEndofgeneReverseOligoaCTGCACnGAGGATTCTAGAGNNNNNNNNNN3ACCTGAACTCCTAAGATC

38、TCNcanbeanyofthe4nucleotides,thereforeForwardoligo5'GGCGCAATACATATGAGAGACAGTGGGACCGTCTG3'Reverseoligo5'GGCCGAACTCGAGTTACTCTAGAATCCTCAAGTCCA3'(sequencecomplementtothesensestrand)Note:1) IftheN-terminusofyourproteinisnotfusedtoanyfusionpartnerorpeptide,itisoftenusefultochangewhereverpo

39、ssibleGorCtoAorTforthefirstfewcodon.Thiswillhelpreducesecondarystructureonthetranslationinitiationsiteandthereforeimproveexpression.2) Althoughweneednotconsiderdesigningdegenerateprimer,butshouldtheneedarise,seedegeneratePCRforguidance.十二、巢式PCR引物NESTEDPRIMERPCR：1F,template2product1product22RPCR121(f

40、1(?1010-芒r1d-gEKfltflO10i£nestedprimerPCR1一ThisgelphotoshowstheeffectofnestedPCRamplificationonthedetectabilityofChickenanaemiavirus(CAV)DNAinadilutionseries:thePCR1justdetects1000templatemolecules;PCR2amplifies1templatemolecule(Soin?C,WatsonSK,RybickiEP,LucioB,NordgrenRM,ParrishCR,SchatKA(1993

41、)AvianDis37:467-476).十三、cDNAPCRAveryusefulprimerforcDNAsynthesisandcDNAPCRcomesfromasequencingstrategydescribedbyThweattetal.(1990):thisutilisedamixtureofthree21-merprimersconsistingof20Tresidueswith3'-terminalA,GorC,respectively;tosequenceinsidethepoly(A)regionofcDNAclonesofmRNAfromeukaryoticor

42、igin.Ihaveusedittoamplifydiscretebandsfromavarietyofpoly(A)+virusRNAs；withonlyasinglespecificdegenerateprimerupstream:theT-primermayannealanywhereinthepoly(A)region；butonlymoleculeswhichannealatthebeginningofthepoly(A)tail,andwhose3'-mostbaseiscomplementarytothebasenexttothebeginningofthetailwillbeextended.eg：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(A；G；C)-3'worksforamplificationofPotyvirusRNA；andeukaryoticmRNA十四、PCR部分注意事項(xiàng)AmorerigoroustreatmentofTaisgivenbyRychliketal.(1990):theymaintainth