酶法分析(生科院2015)

1、4.反應(yīng)產(chǎn)物抑制反應(yīng)產(chǎn)物抑制SPS P 酶 尿 酸 的 定 量尿 酸H2OO2尿 酸 酶尿 囊 酶 C O2H2O22293nmor297n m有 特 征 吸 收通 過(guò) 測(cè)A 293orA 297定 量A = A 1A 2-A 3+方 法 ： 取 試 管 3支酶 對(duì) 照底 物 對(duì) 照反 應(yīng)尿 酸 酶 溶 液硼 酸 B uff尿 酸 酶 溶 液硼 酸 B uff待 測(cè) 樣 品 液 待 測(cè) 樣 品 液123室 溫 放 15m inA 1A 2A 3羥基丙酮酸定量可用兩種酶：甘油酸脫氫酶（專(zhuān)一性強(qiáng)）乳酸脫氫酶（丙酮酸干擾）羥基丙酮酸甘油酸脫氫酶NADH+H+NAD+D-甘油酸羥基丙酮酸乳酸脫氫酶NA

2、DH+H+NAD+L-甘油酸方法：羥基丙酮酸NADH+H+A1加入酶充分反應(yīng)后A2比色皿中反應(yīng)測(cè)定AA1A2A340加酶A時(shí)間（分）羥基丙酮酸定量羥基丙酮酸定量可用兩種酶：可用兩種酶：甘油酸脫氫酶甘油酸脫氫酶（專(zhuān)一性強(qiáng)）（專(zhuān)一性強(qiáng)） 乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶（丙酮酸干擾）（丙酮酸干擾）例 2L-谷 氨 酸+H2O谷氨酸脫氫酶NAD+NADH-酮 戊 二 酸+NH4+此 反 應(yīng) 平 衡 偏 向 左 方 .測(cè) 定 時(shí) 需 設(shè) 法 使 反 應(yīng) 平 衡 向 右 進(jìn) 行克 服 的 辦 法 :的 定 量 測(cè) 定 (NADH生 成 量 的 測(cè) 定 )用 谷 氨 酸 脫 氫 酶L-谷 氨 酸+加 肼 ,反 應(yīng) 生

3、 成-酮 戊 二 酸 可 以 和 肼 反 應(yīng)生 成 腙 ,將 生 成 物 -酮 戊 二 酸除 去 .提 高 NAD+的 濃 度可 偶 聯(lián) 心 肌 黃 酶方 法 :123空 白 管+NAD(過(guò) 量 )谷 氨 酸酶肼+NAD(過(guò) 量 )谷 氨 酸肼加 NAD后 準(zhǔn) 確 60分 鐘測(cè) 340nm吸 附 值加 NAD后 準(zhǔn) 確 60分 鐘測(cè) 340nm吸 附 值A(chǔ)1A2A=A2-A1根 據(jù) NADH的 吸 附 系 數(shù) 求 得 其 量 ,即 可 求 得 L-谷 氨 酸 的 量( 二 ） 和 指 示 酶 反 應(yīng) 偶 聯(lián) 的 定 量 法常 用 在 下 面 兩 種 情 況（ 1 ）SE測(cè)指E PBP 1P 2

4、（ 2 ） 所 用 酶 的 專(zhuān) 一 性 不 高SASBSCE測(cè)指E S 與 P 無(wú) 法 區(qū) 分PAPBPC常用在下面兩種情況常用在下面兩種情況指 示 酶 反 應(yīng)1 .以 脫 氫 酶 為 指 示 劑測(cè) 定 酶 反 應(yīng) ： SEP 1測(cè) 定 酶 反 應(yīng) 的 產(chǎn) 物 P 1 作 為 以 N A D 或 N A D P 為輔 酶 的 某 一 脫 氫 酶 的 底 物 ， 將 兩 個(gè) 酶 促 反 應(yīng)相 偶 聯(lián) 。指 示 酶 反 應(yīng) ：P 1P 2N A DN A D PN A D HN A D P H指示酶反應(yīng)指示酶反應(yīng)1.以脫氫酶為指示劑以脫氫酶為指示劑葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）定量G-1-PG-6

5、-P變位酶脫氫酶NADP+NADPH+H+G-6-P6GA測(cè)定酶反應(yīng)：指示酶反應(yīng)：P方法：BuffNADP樣品（G-1-P）脫氫酶放5分鐘340nm測(cè)A1（清除試劑及樣品中混入的G-6-P）向混合液中加變位酶放4分鐘340nm測(cè)A2A2A1 代表了G G-1-P例1的量A2-A1代表了代表了G-1-P的量的量例 2樣 品 中 同 時(shí) 含 有 G 和 果 糖 ,利 用 酶 法 分 析 測(cè) 定 G 的 量(利 用 己 糖 激 酶 )己 糖 激 酶GA T PG -6-P果 糖 -6-P果 糖己 糖 激 酶葡 萄 糖 異 構(gòu) 酶指 示 反 應(yīng) :脫 氫 酶6G AN A D P+N A D P HA

6、 T PPG -6-P()G -6-PG -6-PP例2 樣品中同時(shí)含有樣品中同時(shí)含有G和果糖，利用酶法分析和果糖，利用酶法分析 測(cè)定測(cè)定G的量（利用己糖激酶的量（利用己糖激酶）方 法 : B uff+N A D P +樣 品 (G ,果 糖 )+G -6-P 脫 氫 酶放 置 一 定 時(shí) 間測(cè) 定 A 1向 混 合 液 中 加 入 己 糖 激 酶測(cè) 定 A 2通 過(guò) A 2-A 1可 計(jì) 算 出 G 的 量(若 需 測(cè) 定 果 糖 的 量 可 繼 續(xù) 向 下 )向 混 合 液 中 加 入 葡 萄 糖 異 構(gòu) 酶測(cè) 定 A 3通 過(guò) A 3-A 2可 計(jì) 算 出 果 糖 的 量P放 置 一 定

7、 時(shí) 間放 置 一 定 時(shí) 間例例3在一個(gè)比色杯中同時(shí)定量丙酮酸，磷酸在一個(gè)比色杯中同時(shí)定量丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸和烯醇式丙酮酸和D-2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸例 3在 一 個(gè) 比 色 杯 中 同 時(shí) 定 量 丙 酮 酸 ,磷 酸 烯 醇 式 丙 酮酸 和 D -2-磷 酸 甘 油 酸測(cè) 定 :偶 聯(lián) :指 示 :D -2-磷 酸 甘 油 酸(D -2P G A )烯 醇 化 酶磷 酸 烯 醇 或 丙 酮 酸 (P E P )磷 酸 烯 醇 或 丙 酮 酸 + A D P丙 酮 酸 激 酶丙 酮 酸 + A D P丙 酮 酸乳 酸 脫 氫 酶N A D H + H+N A D+乳 酸2.以 脫

8、 氫 酶 以 外 的 酶 作 為 指 示 劑過(guò) 氧 化 物 酶 作 為 指 示 劑H2O2 4-氨 基 安 替 比 林 酚過(guò) 氧 化 物 酶有 色 化 合 物（ 醌 亞 膠 色 素 ）270 420nm測(cè) 定 G的 量測(cè) 定 酶 反 應(yīng) G H2O O2G氧 化 酶GAH2O2（ 葡 萄 糖 醛 酸 ）指 示 酶 反 應(yīng)有 色 物通 過(guò) 測(cè) 定 270 420nm 任 一 處 的 A的 變 化 可 定 出 G的 量+H2O2 4-氨 基 安 替 比 林 酚過(guò) 氧 化 物 酶2.以脫氫酶以外的酶作為指示劑以脫氫酶以外的酶作為指示劑過(guò)氧化物酶作為指示劑過(guò)氧化物酶作為指示劑492nm有強(qiáng)吸收有強(qiáng)吸收

9、例：例：L-谷氨酸的定量測(cè)定谷氨酸的定量測(cè)定測(cè)定反應(yīng)：測(cè)定反應(yīng)：L-Glu + NAD + H2O 谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶+-酮戊二酸酮戊二酸+ NADH + H+指示反應(yīng)：指示反應(yīng)：NADH + INT + H心肌黃酶心肌黃酶NAD + 甲臜甲臜 +NAD + 甲臜甲臜 心肌黃酶心肌黃酶+酶循環(huán)放大法的原理、步驟（超微量前列腺素的定量為例）（三步）第一步：轉(zhuǎn)換反應(yīng)：PGNAD+PG脫氫酶1、5- 脫羧- PGNADHH+NADH轉(zhuǎn)NADH轉(zhuǎn)PG可作循環(huán)底物第二步：循環(huán)反應(yīng)- 酮戊二酸Gl u脫氫酶Gl uNADH+H+NAD+3-甘油酸甘油醛脫氫酶甘油醛NADH轉(zhuǎn)Gl u( 或3-甘油酸）

10、n次循環(huán)nP3-P3-PP正比酶循環(huán)放大法的原理、步驟酶循環(huán)放大法的原理、步驟（超微量前列腺素的定量為例）（超微量前列腺素的定量為例）（三步）第一步：轉(zhuǎn)換反應(yīng)（三步）第一步：轉(zhuǎn)換反應(yīng)酶循環(huán)放大法的原理、步驟（超微量前列腺素的定量為例）（三步）第一步：轉(zhuǎn)換反應(yīng)：P G N A D+P G 脫氫酶1 、5 - 脫羧 - P G N A D H H+N A D H轉(zhuǎn)N A D H轉(zhuǎn)P G可作循環(huán)底物第二步：循環(huán)反應(yīng) - 酮戊二酸G l u 脫氫酶G l uN A D H + H +N A D +3 -甘油酸甘油醛脫氫酶甘油醛N A D H 轉(zhuǎn)G l u ( 或3 -甘油酸）n 次循環(huán)nP3 -P3

11、-PP正比第二步：循環(huán)反應(yīng)第二步：循環(huán)反應(yīng)第三步：指示反應(yīng)：利用終點(diǎn)法測(cè)第三步：指示反應(yīng)：利用終點(diǎn)法測(cè)Glu（或（或3磷酸甘油酸）的量磷酸甘油酸）的量如何測(cè)得循環(huán)數(shù)如何測(cè)得循環(huán)數(shù)n？ 用已知量的用已知量的NADH已知已知作為作為NADH轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)在相同條在相同條件下進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)和指示反應(yīng)件下進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)和指示反應(yīng)NADH已知已知=NADH指示指示/n n=NADH指示指示/NADH已知已知（即用已知量的（即用已知量的NADH已知已知平行做循環(huán)反應(yīng)，指平行做循環(huán)反應(yīng)，指示反應(yīng)）示反應(yīng)）在這種方法中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題：在這種方法中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題：1.在進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)之前，必須在進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)之前，必須設(shè)法除

12、去轉(zhuǎn)換反應(yīng)中剩余的輔酶設(shè)法除去轉(zhuǎn)換反應(yīng)中剩余的輔酶，在上例，在上例中就是設(shè)法除去中就是設(shè)法除去NAD+除去的方式：除去的方式：NAD和和NADP的氧化型和還原型在不同的的氧化型和還原型在不同的pH值下其穩(wěn)定值下其穩(wěn)定性不同，可通過(guò)調(diào)節(jié)性不同，可通過(guò)調(diào)節(jié)pH來(lái)達(dá)到目的來(lái)達(dá)到目的 NAD+ NADP+ (氧化型氧化型) NADH NADPH(還原型還原型)pH2 （25） 1h穩(wěn)定穩(wěn)定 5min99.9%被破壞被破壞pH13（60 ） 10min99.9%被破壞被破壞 1001h 仍穩(wěn)定仍穩(wěn)定 在這種方法中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題：1 、在進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)之前，必須設(shè)法除去轉(zhuǎn)換反應(yīng)中剩余的輔酶，在上面的例子中

13、就是設(shè)法除去N A D+除去的方式：N A D 和N A D P 的氧化型和還原型在不同的P H 值下其穩(wěn)定性不同，可通過(guò)調(diào)節(jié)P H 來(lái)達(dá)到目的N A D+ N A D P+（氧化型）N A D H N A D P H （還原型）P H 2 （2 5 攝氏度）P H 1 3 （6 0 攝氏度）1 小時(shí)穩(wěn)定5 m i n 9 9 . 9 %被破壞1 0 分鐘9 9 . 9 %被破壞1 0 0 1 小時(shí)仍穩(wěn)定2 、在循環(huán)反應(yīng)中，底物（不是輔酶）需夠量循環(huán)反應(yīng)：P bS bABS aP a S a K S b Km E am E b3 、要用已知量的循環(huán)底物（上例中N A D H ）平行做循環(huán)反應(yīng)和

14、指示反應(yīng)以求得循環(huán)數(shù)n2.在循環(huán)反應(yīng)在循環(huán)反應(yīng)中中，底物（不是輔酶）需夠量底物（不是輔酶）需夠量3.要用要用已知量的循環(huán)底物已知量的循環(huán)底物（上例中（上例中NADH）平行做循環(huán)反）平行做循環(huán)反應(yīng)和指示反應(yīng)以求得循環(huán)數(shù)應(yīng)和指示反應(yīng)以求得循環(huán)數(shù)n循環(huán)反應(yīng)SaPaEaEbABPbSbABEaEbSaSbPaPbNAD+醇脫氫酶（ADH）蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）乙醇草酰乙酸乙醛蘋(píng)果酸NADH6G脫氫酶（G6PDH）谷氨酸脫氫酶（GDH）6G谷氨酸NADP+NADPHPP-酮戊二酸6GPACoASHCH3COCoA轉(zhuǎn)乙?；福≒TA）檸檬酸合成酶（CS）乙酰磷酸草酰乙酸磷酸檸檬酸P單酶循環(huán)1、CoA循環(huán)：

15、丙二酸丙二酸脫羧酶（MD）乙酰CoA丙二酰CoA乙酸CO2MD+2、NAD循環(huán)：脫氫表雄酮3，17B羥-固醇脫氫酶雄烯-3-17-二酮NADHNAD3，17B羥-固醇脫氫酶睪酮5-+單酶循環(huán)單酶循環(huán)（ 二 ） 應(yīng) 用 范 圍1 、 有 循 環(huán) 底 物 參 加 的 酶 反 應(yīng) 的 底 物 或 酶 可 測(cè) 定N A D 、 N A D P 、 C o A 等2 、 能 與 以 上 反 應(yīng) 偶 聯(lián) 的 酶 反 應(yīng) 的 底 物 或 酶 可 測(cè) 定如 ：G + A T PG - 6 - P + A D PG - 6 - PG 6 P D HN A D P+N A D P HG 醛 酸 - 6 - P己 糖 激 酶 （ H K ）+ H+可 測(cè) G 、 可 測(cè) A T P 、 也 可 測(cè) H K（二）應(yīng)用范圍（二）應(yīng)用范圍1.有循環(huán)底物參加的酶反應(yīng)的底物或酶可有循環(huán)底物參加的酶反應(yīng)的底物或酶可測(cè)定測(cè)定NAD、NADP、CoA等等2. 能與以上反應(yīng)偶聯(lián)的酶反應(yīng)的底物或酶能與以上反應(yīng)偶聯(lián)的酶反應(yīng)的底物或酶 可測(cè)定可測(cè)定輔酶的測(cè)定 （2、3-DPG）定量3-P甘油酸P P P P P甘油酸變位酶2、3-二 P 甘油酸2- P 甘油酸FMN（黃素嘌呤單核苷酸）FAD（黃素嘌呤二核苷酸）TPP（焦磷酸硫胺）乳酸氧化酶氨基酸氧化酶丙酮酸脫羥酶P P