分子生物學(xué)論文

1、摘要： 分子生物技術(shù)近幾年來得到了飛速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物的研究，本文詳細(xì)介紹了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，描述了 PCR引物是什么以及PCR引物的設(shè)計(jì)原則，并且從硝化細(xì)菌方面，詳細(xì)描述了PCR技術(shù)在污水處理方面的應(yīng)用。關(guān)鍵字：PCR引物，設(shè)計(jì)原則，硝化細(xì)菌，污水處理Abstract:Molecular biological technology has been rapid developed in recent years, widely used inthestudy of environmental microbiology,This paper described polymerase

2、 chain reaction (PCR)t echnique in detail, and describe the principles ofdesign PCR primers .Described The application of PCR technology in wastewater treatment .Keywords:PCR primer, design principle, Nitrification bacteria, wastewater treatment聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reacLion,PCR是 ) 20 世紀(jì)后期發(fā)展起來的一種

3、體外擴(kuò)增特異DNA 片斷的技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)便及高度敏感等優(yōu)點(diǎn)，能極大地縮短目的基因擴(kuò)增時(shí)間。因此，其一直是生物學(xué)者們致力于構(gòu)建cDNA文庫、基因克隆以及表達(dá)調(diào)控研究的必要前提和基礎(chǔ)f21 。近年來，該技術(shù)在相關(guān)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，并大大推進(jìn)了分子生物學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的研究和發(fā)展。眾所周知，引物設(shè)計(jì)是影響PC R試驗(yàn)的重要參數(shù)之一。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，污水生物處理系統(tǒng)也隨這發(fā)生了改進(jìn)。污水生物脫氮是污水處理中最重要的環(huán)節(jié)，共包括兩個(gè)階段:硝化和反硝化。硝化階段主要利用硝化菌進(jìn)行處理，如氨氧化菌(AOB)、亞硝酸鹽氧化菌（NOB）等。保證硝化細(xì)菌的存活和穩(wěn)定繁殖是污水生物脫氮的關(guān)鍵所在。所以，利

4、用分子生物技術(shù)對(duì)硝化細(xì)菌的活性、分布等進(jìn)行研究，可有效促進(jìn)污水脫氮系統(tǒng)的穩(wěn)定與發(fā)展。目前，應(yīng)用最多的分子生物技術(shù)是FISH技術(shù)（熒光標(biāo)記的原位雜交）與 PCR技術(shù) （聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）。1.1 設(shè)計(jì)原則1.1.1 引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)。引物設(shè)計(jì)中，特別需要判斷引物互補(bǔ)配對(duì)情況是否影響模板與引物的結(jié)合，這需要估計(jì)模板與引物結(jié)合及引物配對(duì)結(jié)合的自由能。A,T由2個(gè)氫鍵連接，G,C由 3 個(gè)氫鍵連接。一般來說，出現(xiàn)3個(gè)堿基的序列互補(bǔ)便有些危險(xiǎn)，尤其在引物3 末端。 若 3 末端出現(xiàn) 3 個(gè)堿基的序列互補(bǔ)或堿基為GC的 2 個(gè)堿基的序列互補(bǔ)，只好將這個(gè)

5、引物放棄，重新設(shè)計(jì)fl1.1.2 在選擇用來擴(kuò)增不同物種DNA的引物時(shí)，應(yīng)避開mRNA的 5和3末端非翻譯區(qū)序列。不同物種mRNA的 5和 3 末端非翻譯區(qū)序列可能沒有任何的同源性fl ，如果選擇的不同物種DNA序列同源性非常低，那么就無法保證獲得一段或幾段高度保守的序列，將會(huì)為引物設(shè)計(jì)帶來很大得一段或幾段高度保守的序列，將會(huì)為引物設(shè)計(jì)帶來很大的困擾， 特別是在BLAST比對(duì)和Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)分析時(shí)，各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)將會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到要求，無法充分保證引物設(shè)計(jì)的高度敏感性和特異性，更會(huì)為后期的RT-PCR試驗(yàn)帶來諸多麻煩。1.1.3 不同類型引物設(shè)計(jì)的特別原則。特異性引

6、物的錯(cuò)配率很低， 甚至為零，其中，RT-PC R引物最好跨過1 個(gè)以上的內(nèi)含子序列;非特異性引物的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)要在合適范圍內(nèi);簡(jiǎn)并性引物的簡(jiǎn)并性要合適等。2.PCR技術(shù)的應(yīng)用2 基于PCR技術(shù)的分析方法在以往的檢測(cè)方法中，人們通常是從污水中提取硝化菌， 但這種硝化菌的DNA含量很低，為檢測(cè)工作帶來了很大麻煩。而 PCR技術(shù)能夠大量擴(kuò)增DNA片段，從而解決了上述問題。2.1 amoA基因與 16SrRNA基因如果想要實(shí)現(xiàn)硝化菌DNA序列的擴(kuò)增，首先應(yīng)提取一段硝化菌帶有進(jìn)化標(biāo)記的DNA序列，找出該序列的保守區(qū)，制作出與之匹配的探針。氨氧化菌的帶有進(jìn)化標(biāo)記的基因一般是amoA基因與16SrRNA基因。

7、2.1.1 amoA 基因amoA基因是編碼氨單加氧酶的一種基因，編碼氨單加氧酶是氨氧化菌獨(dú)有的胞內(nèi)酶，共有三個(gè)基因，分別是 amoA , amoB , amoC，而amoA中含有編碼氨單加氧酶的活性位點(diǎn)能夠?qū)q催化成輕胺，為氨氧化菌的成長(zhǎng)供應(yīng)能量。 一個(gè)氨氧化菌中含有23 個(gè) amoA， 不同的 amoA功能也不一樣。2.1.2 16SrRNA基因研究人員對(duì)16SrRNA基因的研究具有劃時(shí)代的意義，增加了人們對(duì)微生物生長(zhǎng)的認(rèn)識(shí)。16SrRNA基因有很強(qiáng)的保守性，根據(jù)微生物中16SrRNA基因的不同可以將微生物分為兩類，古細(xì)菌和細(xì)菌。許多書籍中對(duì)微生物的命名都是根據(jù)不同的16SrRNA基因分析

8、的。一個(gè)氨氧化菌中只有一條16SrRNA基因，而不同的氨氧化菌的16SrRNA基因也不完全相同，從這些差異中可以看出不同氨氧化菌的關(guān)聯(lián)與進(jìn)化差異。有關(guān)專家對(duì)不同氨氧化菌中的 amoA基因和16SrRNA基因的排列順序進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，大部分氨氧化菌的amoA基因或16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹都比較相似，正是由于這一相似性，導(dǎo)致用16SrRNA基因制作的探針檢測(cè)的精確度受到影響。而amoA由于只在氨氧化菌中存在，盡管它對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹影響不大，但由于它的差異性使得利用amoA基因制作的探針精確性與特異性比16SrRNA基因要強(qiáng)，能準(zhǔn)確地辨別氨氧化菌的種屬。目前，這兩種探針都只能在自養(yǎng)型氨氧化菌中使用

9、，而無法對(duì)實(shí)際污水中種群的多樣性進(jìn)行分析。2.2 PCR一變性梯度凝膠電泳克隆測(cè)序技術(shù)PCR一變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE技術(shù)是將利用 ）PCR技術(shù)擴(kuò)增的DNA片段植人到凝膠中進(jìn)行電泳的一種技術(shù)。凝膠一般是聚丙烯酞胺凝膠，且加人了梯度變性劑，一般是尿素和甲酞胺。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度是可控的，可以保證長(zhǎng)度的一致性，但是DNA內(nèi)部的堿基排列卻有所不同。在進(jìn)行電泳時(shí)，不同對(duì)其進(jìn)行染色，凝膠上就會(huì)出現(xiàn)若干條DNA譜帶， 一條譜帶就是一個(gè)DNA片段。而這種方法經(jīng)常會(huì)受到單鏈DNA、探針特異性等的影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。為 避免這一影響因素，研究專家經(jīng)常會(huì)在測(cè)驗(yàn)后再進(jìn)行Cloning

10、（克?。┖?Sequencing（測(cè)序），以對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，即所謂的PCR-DGGE-cloning-sequencing（PCR一變性梯度凝膠電泳克隆測(cè)序技術(shù)）。 研究人員利用此技術(shù)對(duì)污水處理系統(tǒng)內(nèi)硝化菌群進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在污水處理過程中，氨氧化菌的數(shù)量是會(huì)改變的。但是若受到外界因素（如溫度、水質(zhì) ）的影響， 氨氧化菌的種群結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生較大的改變。研究人員在研 究曝氣對(duì)污水中硝化細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與脫氮效率造成的影會(huì)產(chǎn)生一定的影響。經(jīng)過研究，脫氮效率與氨氧化菌的含量以及種群多樣性并無關(guān)系。利用PCR一變性梯度凝膠電泳克隆測(cè)序技術(shù)能夠清晰的展示污水處理中硝化菌的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化。然而，凝膠

11、中DNA片段的堿基對(duì)一般不超過500，這一片段的序列又要與檢測(cè)序列的重合度大于85%，否則就不能對(duì)硝化菌進(jìn)行準(zhǔn)確的分類，無法收集有關(guān)硝化菌的數(shù)據(jù)。另外，此技術(shù)的靈敏度不高，凝膠配置濃度不容易掌握，導(dǎo)致此技術(shù)對(duì)微生物含量少的種群沒有理想的檢測(cè)能力。結(jié)論：1.1 分子生物技術(shù)從細(xì)微層面研究了影響污水處理系統(tǒng)中硝化菌生長(zhǎng)的條件。1.2 在未來的發(fā)展中，應(yīng)完善分子生物技術(shù)研究時(shí)的具體操作流程，積極引進(jìn)新技術(shù)、新方法，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性以及特異性，PCR技術(shù)的操作流程應(yīng)進(jìn)一步完善，使其能更精確地反映出微生物種群活性與外界環(huán)境的關(guān)系。相信在未來的污水處理中，分子生物技術(shù)會(huì)隨著科技的進(jìn)步，研究方法更方便快捷，在對(duì)污水處理系統(tǒng)的檢測(cè)中更為穩(wěn)定、精確。參考文獻(xiàn)：C1李磊，曾薇，張悅，楊瑩瑩.分子生物技術(shù)在污水處理系統(tǒng)內(nèi)稍化菌群研究中的應(yīng)用J.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2010(1):135一 142.2朱文優(yōu)，張忠剛.分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用