蛋白標記技術(shù)詳解

1、. .蛋白標記技術(shù)詳解蛋白質(zhì)標記的主要目的是監(jiān)測生物過程、輔助檢測例如化合物的可靠定量、蛋白質(zhì)修飾的特異性檢測或者純化蛋白及其結(jié)合對象。蛋白質(zhì)的標記能夠提高檢測靈敏度以及簡化檢測工作流程。目前有多種蛋白質(zhì)標記技術(shù)來幫助我們研究感興趣的蛋白質(zhì)的豐度、位置、相互作用、翻譯后修飾、功能，乃至監(jiān)測活細胞中的蛋白質(zhì)運輸?shù)葐栴}。目前有多種類型的標記物和標記方式可供選擇，但是針對特定的應(yīng)用應(yīng)中選擇適合的標記策略。1. 代謝標記策略代謝標記策略是一種體內(nèi)標記方法，在這種方法中，細胞被“喂養(yǎng)了化學標記的營養(yǎng)物，然后這些標記物被摻入新合成的蛋白質(zhì)、核酸或代謝物中。然后，我們可以收集細胞并別離這些分子以獲得細胞生物

2、過程的全局視圖。Ø 蛋白同位素標記原理蛋白同位素標記是一種經(jīng)典的蛋白示蹤和蛋白組學定量技術(shù)，用天然同位素輕型或穩(wěn)定同位素重型標記的必需氨基酸取代細胞培養(yǎng)基中相應(yīng)氨基酸，這樣細胞新合成的蛋白質(zhì)可以在細胞生長期間通過摻入含有不同同位素的氨基酸進展標記。應(yīng)用舉例蛋白質(zhì)組學研究方向流行的代謝標記方法是SILACStable Isotope Labeling with Amino acids inCell culture，即細胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標記。結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，SILAC通過使用重型氨基酸例如，15N-或13C-賴氨酸標記其中一組培養(yǎng)物或細胞系，而向另一組添加正常的輕型氨基酸，從而量

3、化兩種培養(yǎng)物或細胞系之間蛋白質(zhì)豐度的差異。然后將在這兩種條件下生長的細胞的裂解蛋白按細胞數(shù)或蛋白量等比例混合，經(jīng)別離、純化后進展質(zhì)譜鑒定，根據(jù)一級質(zhì)譜圖中兩個同位素型肽段的面積比較進展相對定量，得到兩種條件下蛋白質(zhì)豐度差異的相對評估。圖1 SILAC的工作流程Ø 其他蛋白質(zhì)代謝標記物原理如果不具備質(zhì)譜實驗條件，那么可以使用基于生物正交反響的代謝標記方法。在生物正交系統(tǒng)中，細胞被“喂食標記有一些對天然生物反響基團無反響的化學基團的分子構(gòu)造單元。添加含有該基團的反響配偶體的外源性化合物引發(fā)化學反響，將標記的生物分子偶聯(lián)至所需的官能團。應(yīng)用舉例用含有疊氮基團的構(gòu)造單元“喂養(yǎng)細胞，然后在實驗

4、后用含有磷化氫基團的試劑進展處理，疊氮化物和磷化氫基團通過Staudinger連接反響偶聯(lián)，疊氮化物和膦基團通常不存在于生物系統(tǒng)中，因此這些分子是惰性的。圖2 Staudinger連接反響2. 熒光標記策略自發(fā)熒光蛋白、小分子熒光標志物染料、納米晶體材料即量子點材料、小分子蛋白質(zhì)標簽等等這些材料都可以作為熒光標志物，結(jié)合熒光成像檢測儀器可以對目標蛋白的表達情況、細胞中的定位情況、相互作用、活性狀態(tài)等指標進展研究。Ø 熒光蛋白標簽假設(shè)將目的蛋白與熒光蛋白融合，那么能夠?qū)崿F(xiàn)目的蛋白的細胞內(nèi)觀察，可用于多色標記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET應(yīng)用，用于可視化蛋白質(zhì)與其他亞細胞構(gòu)造的易位，研究蛋白

5、質(zhì)-蛋白質(zhì)共定位，檢測來自不同啟動子的基因表達的開場，以及混合細胞群的別離。從早期的綠色熒光蛋白GFP開展到現(xiàn)在，我們已經(jīng)擁有了覆蓋多種光譜區(qū)域的熒光蛋白，包括綠色熒光蛋白、藍色和藍綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、橙色熒光蛋白、紅色熒光蛋白，不同光譜型的熒光蛋白在亮度、光穩(wěn)定性、分子大小上有所不同。圖3熒光蛋白標簽Ø 熒光染料蛋白體外標記熒光染料標記蛋白或多肽技術(shù)是常見的蛋白體外標記技術(shù)，除了GFP等融合表達熒光蛋白之外，目標蛋白經(jīng)過熒光染料標記可以直接進展活體示蹤、細胞分選等下游實驗操作。原理熒光標記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學構(gòu)造的化合物，受到紫外光或

6、藍紫光照射時，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當從激發(fā)態(tài)恢復基態(tài)時，發(fā)出熒光。蛋白熒光標記技術(shù)利用熒光物質(zhì)共價結(jié)合在目標分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。應(yīng)用和特點活化的熒光染料，例如異硫氰酸熒光素FITC、7-氨基-4-甲基香豆素AMC、羅丹明BRhodamine B或Alexa Fluor染料等，可用于標記抗體或蛋白功能基團，生成分子探針并通過熒光成像進展檢測。當用熒光染料化學標記特異性抗體或其他純化的生物分子時，它們成為用于檢測靶抗原或相互作用配偶體的熒光探針，應(yīng)用于細胞成像、流式細胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA。因為熒光標記物具有無放射物污染、操作簡便等優(yōu)點，使

7、其在蛋白功能研究、藥物篩選等許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。圖4四種常見的熒光染料Ø 蛋白量子點標記原理量子點Quantum Dots是一種無機納米結(jié)晶體，它可以根據(jù)其大小發(fā)出特定波長的熒光，它具有非常高的消光系數(shù)，其消光系數(shù)要比小分子熒光基團和熒光蛋白高出10100倍，同時量子點的量子產(chǎn)率也很好。典型的量子點都含有一個硒化鎘CdSe或碲化鎘CdTe核心，外面包裹一硫化鋅ZnS外殼。量子點的吸收波長范圍覆蓋從非常短的波長至略低于其發(fā)射波長的廣闊范圍，因此一束單波長激發(fā)光就可以讓量子點到達多重發(fā)射。應(yīng)用和特點目前研究出的水溶性量子點和油溶性量子點可以與抗體、鏈霉親和素等分子進展偶聯(lián)，應(yīng)用于

8、生物標記檢測、高通量編碼、活體成像及動態(tài)示蹤等領(lǐng)域。不過結(jié)合了生物大分子的水溶性量子點體積較大直徑約10 nm30nm，從而阻礙了它通過細胞膜構(gòu)造，因此只能用于經(jīng)過透化處理的細胞，或者只能對胞外蛋白或可以被細胞內(nèi)吞的蛋白進展研究。圖5量子點與麥芽糖結(jié)合蛋白MBP大小比較。每個直徑為6 nm的量子點可附著約1520個MBP分子。3. 其他標記策略Ø 生物素標記原理生物素Biotin是蛋白質(zhì)檢測、純化和固定的有用標簽，因為它可以高親和力地與鏈霉親和素Avidin和鏈霉親和素Streptavidin，SA結(jié)合。生物素-親和素的親和力至少比抗原-抗體結(jié)合力高百萬倍，這種相互作用是蛋白質(zhì)和配體

9、之間最強的非共價相互作用之一。另外，生物素MW = 244.3Da比酶標記物小得多，因此不太影響蛋白質(zhì)本身的天然功能?？傊?，這些特征使得生物素-親和素策略成為許多檢測和固定應(yīng)用的理想選擇。生物素化蛋白質(zhì)是生物素與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的產(chǎn)物，因為生物素化蛋白質(zhì)同時具備了高親和力、高特異性和高靈敏度的優(yōu)點，所以它提高了基于免疫方法的檢測、純化蛋白質(zhì)技術(shù)的效率。應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)廣泛用于流式細胞術(shù)、熒光成像、蛋白質(zhì)印跡和ELISA檢測，以增加信號輸出和更高的靈敏度。親和素或鏈霉親和素的熒光綴合物用于檢測生物素化的生物分子。親和素或鏈霉親和素的酶綴合物，通常用于蛋白質(zhì)印跡，ELISA和原位雜交成像應(yīng)用。

10、親和素或鏈霉親和素綴合的磁珠和樹脂可用于別離蛋白質(zhì)、細胞和DNA，也可用于免疫分析或生物篩檢。圖6蛋白質(zhì)生物素化Ø 酶蛋白偶聯(lián)物以辣根過氧化物酶HRP和堿性磷脂酶AP為代表的酶標記物適用于與蛋白偶聯(lián)并為免疫檢測制備抗體偶聯(lián)物。這兩種標記物常被用于標記抗體后用作ELISA檢測。HRP適用于快速顯色反響，ELISA檢測中參加底物后在510min內(nèi)即可到達OD450值1.82.5左右，而AP適用于慢速顯色反響，其顯色時間約48h，催化形成的黃色化合物比較穩(wěn)定，比較適合酶促動力學的定量檢測。圖7HRP/抗體綴合參考文獻1. Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular and Cellular Proteomics. 2002, 1(5): 376-386.2. Ben N. G.; et al. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location