蛋白標(biāo)記技術(shù)詳解

1、. .蛋白標(biāo)記技術(shù)詳解蛋白質(zhì)標(biāo)記的主要目的是監(jiān)測(cè)生物過(guò)程、輔助檢測(cè)例如化合物的可靠定量、蛋白質(zhì)修飾的特異性檢測(cè)或者純化蛋白及其結(jié)合對(duì)象。蛋白質(zhì)的標(biāo)記能夠提高檢測(cè)靈敏度以及簡(jiǎn)化檢測(cè)工作流程。目前有多種蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)來(lái)幫助我們研究感興趣的蛋白質(zhì)的豐度、位置、相互作用、翻譯后修飾、功能，乃至監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)葐?wèn)題。目前有多種類(lèi)型的標(biāo)記物和標(biāo)記方式可供選擇，但是針對(duì)特定的應(yīng)用應(yīng)中選擇適合的標(biāo)記策略。1. 代謝標(biāo)記策略代謝標(biāo)記策略是一種體內(nèi)標(biāo)記方法，在這種方法中，細(xì)胞被“喂養(yǎng)了化學(xué)標(biāo)記的營(yíng)養(yǎng)物，然后這些標(biāo)記物被摻入新合成的蛋白質(zhì)、核酸或代謝物中。然后，我們可以收集細(xì)胞并別離這些分子以獲得細(xì)胞生物

2、過(guò)程的全局視圖。Ø 蛋白同位素標(biāo)記原理蛋白同位素標(biāo)記是一種經(jīng)典的蛋白示蹤和蛋白組學(xué)定量技術(shù)，用天然同位素輕型或穩(wěn)定同位素重型標(biāo)記的必需氨基酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)氨基酸，這樣細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞生長(zhǎng)期間通過(guò)摻入含有不同同位素的氨基酸進(jìn)展標(biāo)記。應(yīng)用舉例蛋白質(zhì)組學(xué)研究方向流行的代謝標(biāo)記方法是SILACStable Isotope Labeling with Amino acids inCell culture，即細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記。結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，SILAC通過(guò)使用重型氨基酸例如，15N-或13C-賴(lài)氨酸標(biāo)記其中一組培養(yǎng)物或細(xì)胞系，而向另一組添加正常的輕型氨基酸，從而量

3、化兩種培養(yǎng)物或細(xì)胞系之間蛋白質(zhì)豐度的差異。然后將在這兩種條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞的裂解蛋白按細(xì)胞數(shù)或蛋白量等比例混合，經(jīng)別離、純化后進(jìn)展質(zhì)譜鑒定，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜圖中兩個(gè)同位素型肽段的面積比較進(jìn)展相對(duì)定量，得到兩種條件下蛋白質(zhì)豐度差異的相對(duì)評(píng)估。圖1 SILAC的工作流程Ø 其他蛋白質(zhì)代謝標(biāo)記物原理如果不具備質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件，那么可以使用基于生物正交反響的代謝標(biāo)記方法。在生物正交系統(tǒng)中，細(xì)胞被“喂食標(biāo)記有一些對(duì)天然生物反響基團(tuán)無(wú)反響的化學(xué)基團(tuán)的分子構(gòu)造單元。添加含有該基團(tuán)的反響配偶體的外源性化合物引發(fā)化學(xué)反響，將標(biāo)記的生物分子偶聯(lián)至所需的官能團(tuán)。應(yīng)用舉例用含有疊氮基團(tuán)的構(gòu)造單元“喂養(yǎng)細(xì)胞，然后在實(shí)驗(yàn)

4、后用含有磷化氫基團(tuán)的試劑進(jìn)展處理，疊氮化物和磷化氫基團(tuán)通過(guò)Staudinger連接反響偶聯(lián)，疊氮化物和膦基團(tuán)通常不存在于生物系統(tǒng)中，因此這些分子是惰性的。圖2 Staudinger連接反響2. 熒光標(biāo)記策略自發(fā)熒光蛋白、小分子熒光標(biāo)志物染料、納米晶體材料即量子點(diǎn)材料、小分子蛋白質(zhì)標(biāo)簽等等這些材料都可以作為熒光標(biāo)志物，結(jié)合熒光成像檢測(cè)儀器可以對(duì)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況、細(xì)胞中的定位情況、相互作用、活性狀態(tài)等指標(biāo)進(jìn)展研究。Ø 熒光蛋白標(biāo)簽假設(shè)將目的蛋白與熒光蛋白融合，那么能夠?qū)崿F(xiàn)目的蛋白的細(xì)胞內(nèi)觀察，可用于多色標(biāo)記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET應(yīng)用，用于可視化蛋白質(zhì)與其他亞細(xì)胞構(gòu)造的易位，研究蛋白

5、質(zhì)-蛋白質(zhì)共定位，檢測(cè)來(lái)自不同啟動(dòng)子的基因表達(dá)的開(kāi)場(chǎng)，以及混合細(xì)胞群的別離。從早期的綠色熒光蛋白GFP開(kāi)展到現(xiàn)在，我們已經(jīng)擁有了覆蓋多種光譜區(qū)域的熒光蛋白，包括綠色熒光蛋白、藍(lán)色和藍(lán)綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、橙色熒光蛋白、紅色熒光蛋白，不同光譜型的熒光蛋白在亮度、光穩(wěn)定性、分子大小上有所不同。圖3熒光蛋白標(biāo)簽Ø 熒光染料蛋白體外標(biāo)記熒光染料標(biāo)記蛋白或多肽技術(shù)是常見(jiàn)的蛋白體外標(biāo)記技術(shù)，除了GFP等融合表達(dá)熒光蛋白之外，目標(biāo)蛋白經(jīng)過(guò)熒光染料標(biāo)記可以直接進(jìn)展活體示蹤、細(xì)胞分選等下游實(shí)驗(yàn)操作。原理熒光標(biāo)記所依賴(lài)的化合物稱(chēng)為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學(xué)構(gòu)造的化合物，受到紫外光或

6、藍(lán)紫光照射時(shí)，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時(shí)，發(fā)出熒光。蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)利用熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合在目標(biāo)分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來(lái)提供被研究對(duì)象的信息。應(yīng)用和特點(diǎn)活化的熒光染料，例如異硫氰酸熒光素FITC、7-氨基-4-甲基香豆素AMC、羅丹明BRhodamine B或Alexa Fluor染料等，可用于標(biāo)記抗體或蛋白功能基團(tuán)，生成分子探針并通過(guò)熒光成像進(jìn)展檢測(cè)。當(dāng)用熒光染料化學(xué)標(biāo)記特異性抗體或其他純化的生物分子時(shí)，它們成為用于檢測(cè)靶抗原或相互作用配偶體的熒光探針，應(yīng)用于細(xì)胞成像、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA。因?yàn)闊晒鈽?biāo)記物具有無(wú)放射物污染、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，使

7、其在蛋白功能研究、藥物篩選等許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。圖4四種常見(jiàn)的熒光染料Ø 蛋白量子點(diǎn)標(biāo)記原理量子點(diǎn)Quantum Dots是一種無(wú)機(jī)納米結(jié)晶體，它可以根據(jù)其大小發(fā)出特定波長(zhǎng)的熒光，它具有非常高的消光系數(shù)，其消光系數(shù)要比小分子熒光基團(tuán)和熒光蛋白高出10100倍，同時(shí)量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率也很好。典型的量子點(diǎn)都含有一個(gè)硒化鎘CdSe或碲化鎘CdTe核心，外面包裹一硫化鋅ZnS外殼。量子點(diǎn)的吸收波長(zhǎng)范圍覆蓋從非常短的波長(zhǎng)至略低于其發(fā)射波長(zhǎng)的廣闊范圍，因此一束單波長(zhǎng)激發(fā)光就可以讓量子點(diǎn)到達(dá)多重發(fā)射。應(yīng)用和特點(diǎn)目前研究出的水溶性量子點(diǎn)和油溶性量子點(diǎn)可以與抗體、鏈霉親和素等分子進(jìn)展偶聯(lián)，應(yīng)用于

8、生物標(biāo)記檢測(cè)、高通量編碼、活體成像及動(dòng)態(tài)示蹤等領(lǐng)域。不過(guò)結(jié)合了生物大分子的水溶性量子點(diǎn)體積較大直徑約10 nm30nm，從而阻礙了它通過(guò)細(xì)胞膜構(gòu)造，因此只能用于經(jīng)過(guò)透化處理的細(xì)胞，或者只能對(duì)胞外蛋白或可以被細(xì)胞內(nèi)吞的蛋白進(jìn)展研究。圖5量子點(diǎn)與麥芽糖結(jié)合蛋白MBP大小比較。每個(gè)直徑為6 nm的量子點(diǎn)可附著約1520個(gè)MBP分子。3. 其他標(biāo)記策略Ø 生物素標(biāo)記原理生物素Biotin是蛋白質(zhì)檢測(cè)、純化和固定的有用標(biāo)簽，因?yàn)樗梢愿哂H和力地與鏈霉親和素Avidin和鏈霉親和素Streptavidin，SA結(jié)合。生物素-親和素的親和力至少比抗原-抗體結(jié)合力高百萬(wàn)倍，這種相互作用是蛋白質(zhì)和配體

9、之間最強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一。另外，生物素MW = 244.3Da比酶標(biāo)記物小得多，因此不太影響蛋白質(zhì)本身的天然功能?？傊@些特征使得生物素-親和素策略成為許多檢測(cè)和固定應(yīng)用的理想選擇。生物素化蛋白質(zhì)是生物素與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的產(chǎn)物，因?yàn)樯锼鼗鞍踪|(zhì)同時(shí)具備了高親和力、高特異性和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，所以它提高了基于免疫方法的檢測(cè)、純化蛋白質(zhì)技術(shù)的效率。應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)、熒光成像、蛋白質(zhì)印跡和ELISA檢測(cè)，以增加信號(hào)輸出和更高的靈敏度。親和素或鏈霉親和素的熒光綴合物用于檢測(cè)生物素化的生物分子。親和素或鏈霉親和素的酶綴合物，通常用于蛋白質(zhì)印跡，ELISA和原位雜交成像應(yīng)用。

10、親和素或鏈霉親和素綴合的磁珠和樹(shù)脂可用于別離蛋白質(zhì)、細(xì)胞和DNA，也可用于免疫分析或生物篩檢。圖6蛋白質(zhì)生物素化Ø 酶蛋白偶聯(lián)物以辣根過(guò)氧化物酶HRP和堿性磷脂酶AP為代表的酶標(biāo)記物適用于與蛋白偶聯(lián)并為免疫檢測(cè)制備抗體偶聯(lián)物。這兩種標(biāo)記物常被用于標(biāo)記抗體后用作ELISA檢測(cè)。HRP適用于快速顯色反響，ELISA檢測(cè)中參加底物后在510min內(nèi)即可到達(dá)OD450值1.82.5左右，而AP適用于慢速顯色反響，其顯色時(shí)間約48h，催化形成的黃色化合物比較穩(wěn)定，比較適合酶促動(dòng)力學(xué)的定量檢測(cè)。圖7HRP/抗體綴合參考文獻(xiàn)1. Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular and Cellular Proteomics. 2002, 1(5): 376-386.2. Ben N. G.; et al. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location