消毒劑消毒效力及有效期驗(yàn)證方案

1、消毒劑滅菌效果驗(yàn)證編號(hào)：PY-ZR-YZ-004-00起草：審核：批準(zhǔn)：類別：技木標(biāo)準(zhǔn)日期：日期：日期：頒發(fā)部門：QA生效日期：年月日分發(fā)部門：驗(yàn)證委員會(huì)、質(zhì)量管理部、生產(chǎn)管理部消毒劑的選用原則：目的：確認(rèn)各潔凈級(jí)別的操作間及設(shè)備外表面按照規(guī)定的消毒程序消毒能夠達(dá)到消毒、防止污染的目的，并在消毒劑有效期內(nèi)能確保其消毒效力能符合要求。范圍：本驗(yàn)證方案適用于本公司潔凈區(qū)的墻面、天花板、門窗、機(jī)器設(shè)備、儀器、操作臺(tái)、地漏、推車、桌椅等表面以及操作人員雙手（手套）的消毒等。1. 參考文件1.1. 醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范1.2. 中國藥典2015版第4部微生物限度檢查法2. 概述2.1. 本公司的潔凈

2、區(qū)為D級(jí)，擬定用于潔凈區(qū)表面消毒的有五種消毒劑：75%乙醇、0.1%新潔爾滅溶液、0.2%新潔爾滅溶液、0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液。本次驗(yàn)證方案將選用以上5種消毒劑分別進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。作用對(duì)象一樣的消毒劑每月輪換使用，避免表面微生物產(chǎn)生耐藥菌株。在利用消毒劑進(jìn)行表面擦拭消毒過程中消毒劑的作用時(shí)間應(yīng)不少于10分鐘，利用消毒劑進(jìn)行浸泡消毒的不少于5分鐘。消毒劑的種類、消毒對(duì)象、消毒方法和有效期序號(hào)名稱消毒對(duì)象消毒方法功效期175%乙醇府十設(shè)備表面、器具和手消毒。米用擦拭或噴密閉保存D級(jí)：30天20.1%新潔爾火溶液用于地面、墻面、器具、工作服、清潔布、拖布和潔凈鞋的消毒米用擦拭或

3、浸泡方式密閉保存D級(jí)：30天30.2%的新潔爾滅溶液用于水池和地漏的消毒用于液封密閉保存D級(jí)：30天40.5%醋酸氯己定溶液用于水池和地漏的消毒用于液封密閉保存D級(jí)：30天50.1%醋酸氯己定溶液用于工作服、清潔布、拖布和潔凈鞋的消毒采用浸泡方式密閉保存D級(jí)：30天2.2.為了確認(rèn)消毒劑的消毒效力，通過實(shí)驗(yàn)室考察部分和現(xiàn)場(chǎng)考察部分分別進(jìn)行驗(yàn)證其中,消毒劑滅菌效果驗(yàn)證用定量懸浮試驗(yàn)法和表面實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室考察試驗(yàn)部分。潔凈區(qū)設(shè)施表面材質(zhì)基本都是不銹鋼和玻璃兩種，故表面試驗(yàn)法選用不銹鋼載片和玻璃裁片模擬潔凈區(qū)設(shè)施表面進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。兩種試驗(yàn)方法作用的消毒劑見表。廳P試驗(yàn)方法消母劑1表面實(shí)驗(yàn)法75%乙

4、醇20.1%新潔爾火溶液3定量懸浮試驗(yàn)法0.3%的新潔爾火溶液40.1%新潔爾火溶液50.5%醋酸氯己定溶液60.1%醋酸氯己定溶液現(xiàn)場(chǎng)考察試驗(yàn)部分選擇車間（D級(jí)）的配液間、灌裝間設(shè)備表面消毒前和消毒后分別進(jìn)行取樣，測(cè)定其微生物數(shù)量。3. 確認(rèn)前準(zhǔn)備3.1. 驗(yàn)證用試劑與材料3.1.1. 菌種序號(hào)名稱序列號(hào)1金黃色葡萄球菌CMCC(B)260032大腸埃布國CMCC(B)441023枯草桿菌芽胞CMCC(B)63501白色念珠菌CMCC(F)980013.1.2. 培養(yǎng)基序號(hào)名稱備注1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基經(jīng)121C,20min滅菌備用2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基4胰酪大豆月東培養(yǎng)圣

5、5大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（編號(hào)：BZW12085）規(guī)格：55mm,取樣面積為25m2消毒劑滅菌效果驗(yàn)證6玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)接觸碟（編號(hào)：BZW15129）3.1.3. 消毒液擬定選用的中和劑序號(hào)消毒劑名稱中和劑備注175%乙醇1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑經(jīng)121C,20min火菌備用。20.1%新潔爾火溶液30.2%的新潔爾火溶液3.1.4. 稀釋液0.9%無菌氯化鈉溶液（NS）3.1.5. 器具及設(shè)備序號(hào)名稱1尢菌移液官2錐形瓶3尢菌試管4恒溫水浴鍋5恒溫恒濕培養(yǎng)箱6恒溫恒濕培養(yǎng)箱3.2. 驗(yàn)證用試劑與材料記錄見附錄1。4. 消毒劑消毒效力試驗(yàn)4.1. 中和劑鑒定試驗(yàn)4.1.1.

6、 試驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^該試驗(yàn)，確認(rèn)所用的中和劑對(duì)對(duì)應(yīng)的消毒劑有良好的中和作用，對(duì)試驗(yàn)用菌劑及其恢復(fù)期培養(yǎng)示范有害或不良影響。4.1.2. 菌液的制備及計(jì)數(shù)4.1.2.1 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌工作菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3035c培養(yǎng)1824小時(shí)。取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成1X1085X108CFU/ml的工作菌液（如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為1X1085X108CFU/ml,可不再用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋）。消毒劑滅菌效果驗(yàn)證計(jì)數(shù)時(shí)，將lXl085Xl08CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋

7、成含50100CFU/ml菌液,并同時(shí)采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3035c培養(yǎng)2大計(jì)數(shù)。計(jì)算該稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)，將計(jì)數(shù)結(jié)果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)。4.1.2.2 白色念珠菌工作菌液的制備接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，2328c培養(yǎng)2448小時(shí)。取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成1X1085X108CFU/ml的工作菌液（如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為1X1085X108CFU/ml,可不再用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋）。計(jì)數(shù)時(shí)，將1X1085X108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含50100CFU/ml菌液，并同時(shí)采用改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基2328C培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)。

8、計(jì)算該稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)，將計(jì)數(shù)結(jié)果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)。4.1.3. 鑒定試驗(yàn)操作4.1.3.1 配制75%乙醇、0.1%新潔爾滅溶液、0.2%新潔爾滅溶液、40mg/L的二氧化氯、60mg/L的二氧化氯，具體操作執(zhí)行清潔劑和消毒劑管理。將配置好的消毒劑置20C蟲C恒溫水浴鍋中備用。4.1.3.2 分組操作試驗(yàn)分組及稀釋操作方法簡(jiǎn)表組號(hào)混合液A混勻作用10min混合液B混勻作用10min取混合液B或混合液B的稀釋級(jí)溶液0.5ml平板計(jì)數(shù)（2皿/組）取0.5ml工作菌液加入卜列溶液中取混合液A0.5ml加入卜列溶液1消場(chǎng)劑4.5ml稀釋液4.5ml混合液B、10-12消場(chǎng)劑4.5ml中和

9、劑4.5ml混合液B、10-13中和劑4.5ml稀釋液4.5ml10-2、10-34中和產(chǎn)物4.5ml（消毒液與中和劑比例為1:1）稀釋液4.5ml10-2、0-35稀釋液4.5ml稀釋液4.5ml10-2、10-36稀釋液和中和劑各1.0ml注入尢菌平皿中，各制備2皿。具體操作第1組目的：觀察消毒液對(duì)試驗(yàn)菌有無殺滅或抑制能力。操作：取消毒劑4.5ml+工作菌液0.5ml,混勻作用10min后，取混合液0.5ml+稀釋液4.5ml,消毒劑滅菌效果驗(yàn)證混勻作用10min,取0.5ml注皿，平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035c培養(yǎng)3大計(jì)數(shù)；白色念

10、珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置2328c培養(yǎng)5大計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)。第2組目的：觀察殘留消毒劑被中和后受到消毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否恢復(fù)生長(zhǎng)。操作：取消毒劑4.5ml+工作菌液0.5ml,混勻作用10min后，取混合液0.5ml+中和齊1J4.5ml,混勻作用10min,用稀釋液稀釋成10-1。分別取未稀釋溶液（混合液0.5mll+中和齊1J4.5ml的混合液）及10-10.5ml注皿，各平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于3035c培養(yǎng)3大計(jì)數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于2328c培養(yǎng)5大計(jì)數(shù)。第3組目的：觀察中和劑是否有抑菌性操作：取中和劑4.5

11、ml+工作菌液0.5ml,混勻作用10min,取混合液0.5mll+稀釋液4.5ml,混勻作用10min后，用稀釋液進(jìn)行10倍系列稀釋成10-2、10-30取相應(yīng)稀釋級(jí)0.5ml注皿，各稀釋級(jí)平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035c培養(yǎng)3大計(jì)數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035c培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)。第4組目的：觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和殘留消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)繁殖是否有影響。操作：取消毒劑和中和劑1:1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml,混勻作用10min,取混合液0.5mll+稀釋液4.5ml,混勻作用10min后，用稀釋液進(jìn)行

12、10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應(yīng)稀釋級(jí)0.5ml注皿，各稀釋級(jí)平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035c培養(yǎng)3大計(jì)數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035c培養(yǎng)3天計(jì)。第5組目的：作菌落數(shù)對(duì)照用操作：消毒劑滅菌效果驗(yàn)證取稀釋液4.5ml+工作菌液0.5ml,混勻作用10min,取混合液0.5mll+稀釋液4.5ml,混勻作用10min后，用稀釋液進(jìn)行10倍系列稀釋成10-2、10-30取相應(yīng)稀釋級(jí)0.5ml注皿，各稀釋級(jí)平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035c培養(yǎng)3大計(jì)數(shù)；白色念珠菌

13、用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035c培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)。第6組目的：作為陰性對(duì)照用操作：分別取稀釋液和中和劑各1.0ml注入無菌平皿中，各制備2皿。4.1.3.3 結(jié)果判斷試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合下列全部條件，判斷所選中和劑合格。第1組無菌生長(zhǎng)，或僅有少數(shù)試驗(yàn)菌菌落生長(zhǎng)。第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少，且符合下表要求第1組平板平均菌落數(shù)第2組平板平均菌落數(shù)05x(x+5)y(y+0.5y)第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長(zhǎng)，其每組間菌落數(shù)誤差率不超過15%o計(jì)算公式如下：（3組間菌落平均數(shù)-各組菌落平均數(shù)）的絕對(duì)值之和誤差率=M00%3M組間菌落平均數(shù)第6組無菌生長(zhǎng)。否則，說明試劑有污染

14、，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。4.1.4. 中和劑鑒定試驗(yàn)記錄見附錄2。4.2. 定量懸浮試驗(yàn)4.2.1. 試驗(yàn)?zāi)康挠捎?.2%的新潔爾滅溶液、0.1%新潔爾滅溶液、60mg/L二氧化氯溶液、0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液是通過浸泡或液封消毒，通過定量懸浮試驗(yàn)，確定其消毒效力是否符合要求。4.2.2. 試驗(yàn)操作消毒劑滅菌效果驗(yàn)證4.2.2.1 配制0.2%的新潔爾滅溶液、0.1%新潔爾滅溶液、60mg/L二氧化氯溶液、0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液，操作執(zhí)行清潔劑和消毒劑管理。將配置好的消毒劑置20c土C恒溫水浴鍋中備用。4.2.2.2 由于0.2%的新潔爾滅溶液、0.1%

15、新潔爾滅溶液中低效消毒劑，且不能殺滅芽抱，故定量懸浮試驗(yàn)用菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌。0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液為高效消毒劑，能殺滅芽抱，故定量懸浮試驗(yàn)用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽抱桿菌。4.2.2.3 將菌液制備成1X1085X108CFU/ml的工作菌液，菌液的制備及計(jì)數(shù)同8.1.2。4.2.2.4 將試管按需要分組排列在試管架上，試驗(yàn)組分3組（4min、5min、6min各一組），并由左向右逐管標(biāo)明消毒劑、中和劑、10-1、10-2。對(duì)照組分1組，并由左向右逐管標(biāo)明稀釋液、中和劑、10-1、10210-3、104。4.2.2.5

16、 向個(gè)試管加入4.5ml相應(yīng)的試劑，標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4°加入4.5ml的稀釋液。4.2.2.6 吸取工作菌液0.5ml加入標(biāo)明消毒劑的試管中，對(duì)照組加入標(biāo)明稀釋液的試管中，迅速混勻，并開始計(jì)時(shí)。4.2.2.7 待菌液與消毒劑相互作用至8min、10min、12min,吸取菌液和消毒劑混合液0.5ml,加入標(biāo)明中和劑的試管中，迅速混勻。4.2.2.8 中和作用10min后，吸取0.5ml加入標(biāo)明10-1的試管中，混勻后吸取0.5ml加入標(biāo)明10-2試管中（對(duì)照組以此類推，對(duì)照組直至10-4）。4.2.2.9 試驗(yàn)組分別取中和劑管、10-1、10-2管溶液1ml按

17、平皿法測(cè)定存活菌數(shù)；對(duì)照組取10一3、10-41ml按平皿法測(cè)定存活菌數(shù)。每管平行制備2皿。4.2.2.10 黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于3035c培養(yǎng)3大計(jì)數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于2328c培養(yǎng)5天計(jì)數(shù)。4.2.3. 結(jié)果計(jì)算計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組的活菌濃度（CFU/ml）,并換算為對(duì)數(shù)值（N）,并按下式計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值:殺滅對(duì)數(shù)值（KL）=對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值（NO）-試驗(yàn)組活菌濃度對(duì)數(shù)值（NX）4.2.4. 可接受標(biāo)準(zhǔn)殺滅對(duì)數(shù)值（KL）應(yīng)不低于35個(gè)對(duì)數(shù)單位。4.2.5. 定量懸浮試驗(yàn)記錄見附錄34.3. 表面試驗(yàn)法消毒劑滅菌效果驗(yàn)證

18、4.3.1. 試驗(yàn)?zāi)康挠捎?5%乙醇、40mg/L二氧化氯溶液、0.1%新潔爾滅溶液是通過擦拭消毒，故選用不銹鋼載片和玻璃裁片進(jìn)行表面試驗(yàn)法，確定其消毒效力是否符合要求。4.3.2. 菌種選擇由于75%乙醇、0.1%新潔爾滅溶液中低效消毒劑，且不能殺滅芽抱，故定量懸浮試驗(yàn)用菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌。0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液為高效消毒劑，能殺滅芽抱，故定量懸浮試驗(yàn)用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽抱桿菌。4.3.3. 工作菌液制備工作菌液的制備方法、濃度及驗(yàn)證同步計(jì)數(shù)操作同8.1.2。4.3.4. 試驗(yàn)操作4.3.4.1 .(1)染菌不銹

19、鋼載片制備將經(jīng)滅菌的載片平鋪于無菌平皿內(nèi)，滴加金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌含菌量為1X1085X108CFU的菌液0.1ml,并均勻涂布于整個(gè)載體表面。滴染菌液后，載片置超凈工作臺(tái)晾干后備用。每種菌平行制備兩個(gè)染菌不銹鋼載片。(2)染菌玻璃載片制備因培養(yǎng)皿的材質(zhì)為玻璃，故用培養(yǎng)皿代替玻璃載片進(jìn)行染菌試驗(yàn)。進(jìn)行菌液滴染前，用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿菌液滴染面的背面畫出染菌面積(50mA50mm),標(biāo)注清晰。菌液滴染操作同染菌不銹鋼載片制備。4.3.4.2 .試驗(yàn)組：將消毒劑擦拭在制備好的染菌載片上，消毒劑作用時(shí)間分別為8min、10min、12min,不銹鋼載片和玻璃載片每個(gè)作用時(shí)間分別制備2

20、個(gè)。作用結(jié)束后，用接觸碟取樣(接觸碟規(guī)格：55mm,取樣面積為25m2)。取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟(編號(hào):BZW12085);取樣白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基接觸碟(編號(hào)：BZW15129)。接觸碟取樣方法：打開接觸碟蓋，使無菌培養(yǎng)基表面與取樣面直接接觸，均勻按壓接觸碟底板，確保全部瓊脂表面與取樣面表面均勻接觸10秒左右，在蓋上跌蓋。對(duì)照組對(duì)照組的活菌濃度計(jì)數(shù)見8.3.3消毒劑滅菌效果驗(yàn)證陰性對(duì)照：用接觸碟在已滅菌的載片上（未染菌片的載）按壓取樣，操作同上。每種載片及每種接觸碟平行制備兩份。4.3.4.3 培養(yǎng)將取樣金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、

21、枯草桿菌芽抱菌的接觸碟倒置于3035C培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)；取樣白色念珠菌的接觸碟倒置于2328c培養(yǎng)5大計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)。4.3.4.4 結(jié)果計(jì)算計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組的活菌濃度（CFU/ml）,并換算為對(duì)數(shù)值（N）,并按下式計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值:殺滅對(duì)數(shù)值（KL）=對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值（NO）-試驗(yàn)組活菌濃度對(duì)數(shù)值（NX）4.3.4.5 可接受標(biāo)準(zhǔn)殺滅對(duì)數(shù)值（KL）應(yīng)不低于35個(gè)對(duì)數(shù)單位。4.3.5. 表面試驗(yàn)法記錄見附錄54.4. 現(xiàn)場(chǎng)考察試驗(yàn)4.4.1. 消毒前對(duì)潔凈區(qū)進(jìn)行表面微生物取樣。取樣地點(diǎn)：D級(jí)車間的配料間墻壁和設(shè)備表面、灌裝間墻壁和設(shè)備表面、中間站墻壁表面。取樣操作及檢驗(yàn)執(zhí)行表面微生物檢驗(yàn)。4.4.2. 生產(chǎn)操作結(jié)束后操作人員按照生產(chǎn)區(qū)清潔對(duì)潔凈區(qū)進(jìn)行清潔消毒。4.4.3. 清潔消毒完畢15分鐘后，現(xiàn)場(chǎng)QA