細(xì)胞毒性試驗(yàn)方案

1、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案1.胰酶雙抗(青霉素/高DMEM(糖)鏈霉素)DAPI準(zhǔn)備材料：MTT(5mg/mL)DMSOPBS4%指甲油6孔培養(yǎng)板多聚甲醛培養(yǎng)瓶(25mL)96孔培養(yǎng)板超薄載玻片一包0.45濾膜m以滅菌：50mL,10mL,5mL離心管兩種槍頭2.實(shí)驗(yàn)方案材料本實(shí)驗(yàn)所用的為載藥的通過(guò)二硫鍵橋連透明質(zhì)酸的夾心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX),在高谷胱甘肽條件下，二硫鍵斷裂，透明質(zhì)酸脫離，同時(shí)SiO2-本實(shí)驗(yàn)的夾心二氧化硅中藥物得以釋放。目的為測(cè)定透明質(zhì)酸修飾的夾心二氧化硅(，SiO2-SS-HASiO2-SS-HA/DOXSS-HA/DOX)的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)組為、DOX成纖維細(xì)

2、胞為正常人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型和分別采用，HepG2L929空白對(duì)照組為純細(xì)胞細(xì)胞模型。SiO2-SS-HA/DOX、HepG2人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)組為采用1%（w/v）DOXSiO2-SS-HA、，空白對(duì)照組為純細(xì)胞。10%（v/v）培養(yǎng)基中含有FBS和、。配制不同濃度的鏈霉素青霉素雙抗（/）SiO2-SS-HA/DOXSiO2HA藥物載、DOX體培養(yǎng)基溶液。HepG2以人肝癌細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型（1）.12%DMEM87%1%血清培養(yǎng)基的配置：雙抗具體操作步驟：細(xì)胞的復(fù)活：C溫水中，使細(xì)胞快速溶解。將懸浮的細(xì)將凍存于液氮中的細(xì)胞取由，迅速放入37無(wú)血清培養(yǎng)基，5mL胞移至離心管中

3、，力口1000rmp,5min離心（每次轉(zhuǎn)移時(shí)，將之前的離心管洗滌，5mL去上清，再加有血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。并用移液槍來(lái)回吸，使液體混合均勻。）將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞的傳代：C,每次使用一管，避的胰酶分裝至小離心管中，0.25%將，凍存于2mL每個(gè)管中-20免反復(fù)凍融。的酒精放入超凈臺(tái)。將培養(yǎng)液倒入廢液75%將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取由，蓋子旋緊，噴缸，操作完成后，殘留培養(yǎng)基用吸管吸干凈，培養(yǎng)瓶口-用火燒。加入2mL胰酶將瓶底鋪滿，消化2-3min,于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，呈2mL12%DMEM終止消化，用槍吹打，使細(xì)胞懸浮。圓形，即消化完畢，加入離心。迅速倒掉上清，加入10mL離心

4、管中，1000rmp,5min,將細(xì)胞懸浮液移入6mLDMEM培養(yǎng)基,分裝至兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，再各加入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。，于37C,5%的CO22mLDMEM至5mL-。下一次傳代步驟同:細(xì)胞存活率測(cè)定方法(布板，加樣)。同傳代步驟-并用移液槍來(lái)回吸，使液體混合均勻，將所有含給每個(gè)離心管中加入定量的培養(yǎng)基，有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個(gè)50mL離心管中，最終使液體體積為30mL。個(gè)復(fù)孔，每塊板設(shè)一組空白調(diào)零孔，內(nèi)加培養(yǎng)液，不含96孔板中每個(gè)濃度設(shè)計(jì)5細(xì)胞與藥物，一組空白對(duì)照組，只加培養(yǎng)基和細(xì)胞，不加藥物。除過(guò)空白調(diào)零孔，每孔加入，5%(v/v)CO2L含細(xì)胞的培養(yǎng)基。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定

5、的濕度，100222小時(shí)。溫度保持在37C,培養(yǎng)微升的0.03g將谷胱甘肽加入到10mL培養(yǎng)基，充分溶解，濃度為0.003g/mL,取20.003g/mL谷胱甘肽溶液加入到10mL的培養(yǎng)基中，將這兩個(gè)濃度含谷胱甘肽的培養(yǎng)基替換部分原來(lái)的培養(yǎng)基，作為對(duì)照，不需要加谷胱甘肽的孔換上5%(v/v)CO2,溫新鮮培養(yǎng)基，將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，小時(shí)，具體的加樣孔見(jiàn)圖一。2度保持在37C,培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，分成兩份，其中3mL樣品溶到SiO2-SS-HA/DOX1.2mg將的的培養(yǎng)基，再將稀釋后的含液樣的培養(yǎng)基分成兩份，1.5mL一份里加入其中一份SiO2-SS-HA/DOX樣新鮮培養(yǎng)基

6、，依此類推，便得到一個(gè)濃度梯度的加入1.5mL品。SiO2-SS-HA樣品的濃度配制方法同上。的0.918mg將SiO2-SS-HA/DOX的培養(yǎng)基中，剩下3mL。所示。將孔板放入培養(yǎng)箱孔板中的培養(yǎng)基，如圖961將配制好的載體溶液替換原來(lái)37,溫度保持在C,培養(yǎng)5%(v/v)CO2中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，24小時(shí)。5mg/mL配制的溶液，將孔板中的培養(yǎng)更換成MTTMTT溶液，將孔板放-入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37C。培養(yǎng)4小時(shí)后，mmus:.和*工»|kFLp-iF.)1AJK將孔板中的培養(yǎng)基取由，用PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100

7、以L的DMSO,溶解孔中的甲瓚，采用酶標(biāo)儀測(cè)定，波長(zhǎng)設(shè)定為490nm圖1藥物載體布板示意圖.以L929成纖維細(xì)胞為正常細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)組為SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX,空白對(duì)照組為純細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇y(cè)定藥物載體溶液對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。培養(yǎng)基的配置：雙抗1%血清12%DMEM87%具體操作步驟：細(xì)胞的復(fù)活：C溫水中，使細(xì)胞快速溶解。將懸浮的細(xì)37將凍存于液氮中的細(xì)胞取由，迅速放入離心胞移至離心管中，加5mL無(wú)血清培養(yǎng)基，1000rmp,5min（每次轉(zhuǎn)移時(shí)，將之前的離心管洗滌，去上清，再加5mL有血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。并用移液槍來(lái)回吸，使液體混合均勻。）將培養(yǎng)瓶

8、放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞的傳代：C,每次使用一管，避2mL,凍存于-20將0.25%的胰酶分裝至小離心管中，每個(gè)管中免反復(fù)凍融。的酒精放入超凈臺(tái)。將培養(yǎng)液倒入廢液將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取由，蓋子旋緊，噴75%培養(yǎng)瓶口缸，殘留培養(yǎng)基用吸管吸干凈，操作完成后，用火燒。,于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，呈圓形，即2-3min2mL加入胰酶將瓶底鋪滿，消化終止消化，用槍吹打，使細(xì)胞懸浮。消化完畢，加入2mL12%DMEM離心。迅速倒掉上清，加入將細(xì)胞懸浮液移入10mL離心管中，1000rmp,5min,培養(yǎng)基，分裝至兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，再各加入6mLDMEM。48hCO25%375mL2mLDMEM,至，于C,的培養(yǎng)箱中

9、培養(yǎng)下一次傳代步驟同-。細(xì)胞存活率測(cè)定方法（布板，加樣）：同傳代步驟-。并用移液槍來(lái)回吸，使液體混合均勻，將所有含給每個(gè)離心管中加入定量的培養(yǎng)基，離心管中，最終使液體體積為50mL12mL。有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個(gè)個(gè)復(fù)孔，每塊板設(shè)一組空白調(diào)零孔，內(nèi)加培養(yǎng)液，不含孔板中每個(gè)濃度設(shè)計(jì)596細(xì)胞與藥物，一組空白對(duì)照組，只加培養(yǎng)基和細(xì)胞，不加藥物。除過(guò)空白調(diào)零孔，每孔加入，以1005%(v/v)CO2L含細(xì)胞的培養(yǎng)基。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，溫度保持在3722C,培養(yǎng)小時(shí)。-將所有加樣的孔換成新鮮培養(yǎng)基，作為與癌細(xì)胞的對(duì)照。將孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO

10、2,溫度保持在37C,培養(yǎng)2小時(shí)。將0.4mg的SiO2-SS-HA/DOX樣品溶到1mL的培養(yǎng)基中，分成兩份，其中一份里加入0.5mL的培養(yǎng)基，再將稀釋后的含液樣的培養(yǎng)基分成兩份，其中一份加入0.5mL新鮮培養(yǎng)基，依此類推，便得到一個(gè)濃度梯度的SiO2-SS-HA/DOX樣品。SiO2-SS-HA樣品的濃度配制方法同上。1mL的培養(yǎng)基中，剩下的步驟同0.306mg的SiO2-SS-HA/DOX樣品溶到將。o,所示。將孔板放入培養(yǎng)箱將配制好的載體溶液替換原來(lái)96孔板中的培養(yǎng)基，如圖2,溫度保持在37C,培養(yǎng)中，培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2小時(shí)。24溶液，將孔板放入培養(yǎng)箱中，MTT配制5mg/mL的溶液，將孔板中的培養(yǎng)更換成MTT小時(shí)后，將孔板中的培培養(yǎng)箱保持一定的濕度，5%(v/v)CO2，溫度保持在37Co培養(yǎng)4,溶解孔中的甲瓚，采DMSO以L的3養(yǎng)基取由，用PBS溶液清洗次，然后向每孔加入100490nm用酶標(biāo)儀測(cè)定，波長(zhǎng)設(shè)定為二(ODtreated-ODblank/ODcontrol-:細(xì)胞存活率細(xì)胞存活