質(zhì)粒種類(lèi)與應(yīng)用

1、克隆載體polylinker載體的功能及特征載體的功能及特征載體的功能載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體的功能及特征載體的功能及特征載體應(yīng)具備的條件載體應(yīng)具備的條件具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 具有合適的篩選標(biāo)記具有合適的篩選標(biāo)記 具有較具有較高的外源高的外源DNA的載裝能力的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) 具有與

2、特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn) 質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類(lèi)核酸分子被穩(wěn)定遺傳的一類(lèi)核酸分子質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的型的絕大多數(shù)的天然絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即即cccDNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分子量范圍：的分子量范圍：1 - 300 kb質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)

3、粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃楦鶕?jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類(lèi)型：兩大復(fù)制類(lèi)型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 1 - 3 拷貝拷貝 stringent plasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒 10 - 60 拷貝拷貝 stringent plasmid質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：質(zhì)粒的自

4、主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制拷貝數(shù)的控制機(jī)制 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合oriE.coli ColE1 plasmid復(fù)制方向復(fù)制方向rop（+）RopRNA IIRNA I3553質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制拷貝數(shù)的控制機(jī)制 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)

5、制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱(chēng)為一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱(chēng)為質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成粒組成不相容性群不相容性群質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性：質(zhì)粒的不相

6、容性：分子機(jī)制分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)

7、勢(shì)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢?lèi)：革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢?lèi)：接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等質(zhì)粒等如如Col、R的其它成員的其它成員非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)

8、生的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由 bom 和和mob 基因決定基因決定20060421質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征攜帶特殊的遺傳標(biāo)記攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成物質(zhì)合成 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)@些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有

9、重要意義重組分子的篩選具有重要意義質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：建的：pSC101 8.8 kb 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 TcrColE1 6.

10、5 kb 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Apr質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的分類(lèi)質(zhì)粒的分類(lèi)人工人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類(lèi)：構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類(lèi)： 高拷貝高拷貝質(zhì)粒質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)拷貝數(shù)1000-3000 擴(kuò)增基因擴(kuò)增基因低拷貝低拷貝質(zhì)粒質(zhì)粒 來(lái)自來(lái)自pSC101 拷貝數(shù)小于拷貝數(shù)小于10 表達(dá)某些毒性基因表達(dá)某些毒性基因溫敏溫敏質(zhì)粒質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)

11、、整合等不同性質(zhì)測(cè)序測(cè)序質(zhì)粒質(zhì)粒 含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合整合質(zhì)粒質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn) 便于外源基因的整合便于外源基因的整合穿梭穿梭質(zhì)粒質(zhì)粒 裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆便于基因克隆表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針探針質(zhì)粒質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因裝有報(bào)告基因 便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制松弛型復(fù)制 pBR32

12、24363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可擴(kuò)增氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)拷貝數(shù) 50 - 100 / cell用于基因克隆用于基因克隆 pBR322AmpTet重組 DNAAmprTcs提 取DNA 電泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs轉(zhuǎn) 化 無(wú) 菌落陽(yáng) 性菌 落篩 選重 組 子2)DNA重組無(wú) DNA插入有 DNA插入外 源DNA1)限制 酶 切EcoSacKpnSmaBamXbaSalP

13、stSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19： 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和測(cè)序用于基因克隆和測(cè)序 裝有多克隆位點(diǎn)（裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記正選擇顏色標(biāo)記 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCT

14、GCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII質(zhì)粒質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理的顯色原理pUC18/19PlaclacZMCSb b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a a-肽段肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚基吲哚基-b b-D-半乳糖苷半乳糖苷X-gal重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子

15、裝有多克隆位點(diǎn)（裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記正選擇顏色標(biāo)記 lacZ用于外源基因的高效表達(dá)用于外源基因的高效表達(dá) 注意：注意：T7和和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的編碼的RNA聚合聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等等 AmN2HlacZEcoRIHindIIIOriOri復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)LacZAPRpUC19質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化的分離純化實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室一般使用下列

16、三種方法制備質(zhì)粒一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA： 氯化銫密度梯度離心法氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法堿溶法 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡(jiǎn)便純度底、快速、操作簡(jiǎn)便沸水浴法沸水浴法 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間氯化銫法和堿溶法之間質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化的分離純化氯化銫密度梯度離心法：氯化銫密度梯度離心法： 用含有用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加加CsCl和和溴乙錠溴乙錠超速離心過(guò)夜超速離

17、心過(guò)夜在紫外燈下吸取在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化的分離純化堿溶法：堿溶法： 用含有用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加加NaOH和和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物 加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體色體DNA及大部分蛋白質(zhì)及大部分蛋白質(zhì) 離心取上清液，用苯酚離心取上清液，用苯酚- -氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇

18、沉淀水相質(zhì)粒乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無(wú)用無(wú)DNase的的RNase去除殘余的去除殘余的RNA cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化的分離純化沸水浴法：沸水浴法： 用含有用含有EDTA和和Triton X-100的緩沖液懸浮菌體的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 沸水浴沸水浴40秒鐘秒鐘離心，用無(wú)菌牙簽挑去沉淀物離心，用無(wú)菌牙簽挑去沉淀物 乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類(lèi)非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染噬菌體或病毒是一類(lèi)非細(xì)胞微生物，能高效率高特異

19、性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開(kāi)發(fā)成為基因工能被開(kāi)發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋撼痰挠杏幂d體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬

20、菌體噬菌體DNAl l 噬菌體的生物學(xué)特性：噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)生物結(jié)構(gòu)l l 噬菌體是噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體大腸桿菌的溫和型噬菌體l l 噬菌體噬菌體由外殼包裝蛋白和由外殼包裝蛋白和l l-DNA組組成成 l l-DNA全長(zhǎng)全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸l l-DNA上上至少有至少有61個(gè)基因個(gè)基因l l 噬菌體生物學(xué)特性：噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)生物結(jié)構(gòu)5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos頭部合成基因頭部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻

21、遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重組基因重組基因刪除與整合基因刪除與整合基因l - DNA噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l 噬菌體生物學(xué)特性：噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期感染周期E.coli吸附吸附LamB受體受體注入注入復(fù)制復(fù)制包裝包裝裂解裂解噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l 噬菌體生物學(xué)特性：噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期感染周期體內(nèi)包裝體內(nèi)包裝100個(gè)左右的拷貝個(gè)左右的拷貝包裝范圍為原包裝范圍為原DNA的的75 - 105%即即 36 - 51 kbDA包裝范圍為原包裝范圍

22、為原DNA的的75 - 105%即即 36 - 51 kb噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l 噬菌體生物學(xué)特性：噬菌體生物學(xué)特性： 溶原狀態(tài)溶原狀態(tài) l l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)溶原狀態(tài)。整合主要由。整合主要由l l-DNA上的上的cI和和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開(kāi)放與關(guān)閉又取決于兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基

23、因的開(kāi)放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l l-DNA或宿主細(xì)或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶原狀態(tài)溶原狀態(tài)，或處于裂解狀態(tài)，或處于裂解狀態(tài) DNA重組技術(shù)一般需要重組技術(shù)一般需要l l噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài)噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài)噬菌體整個(gè)基因組如圖所示，可分為三個(gè)部分噬菌體整個(gè)基因組如圖所示，可分為三個(gè)部分n 左臂：從左臂：從A到到J長(zhǎng)約長(zhǎng)約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。n中段：長(zhǎng)約中段：長(zhǎng)約20kb

24、，是，是DNA整合和切出，溶原生長(zhǎng)所需的整合和切出，溶原生長(zhǎng)所需的序列。序列。n右臂：長(zhǎng)約右臂：長(zhǎng)約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長(zhǎng)最重要，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長(zhǎng)最重要的調(diào)控基因和序列、以及的調(diào)控基因和序列、以及DNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含右臂包含DNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，中段是非必體、溶菌生長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，中段是非必需的。需的。 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載

25、體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度縮短長(zhǎng)度 野生型野生型l l-DNA包裝的上限為包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有只有當(dāng)插入的外源當(dāng)插入的外源DNA片段不大于片段不大于2.5kb時(shí)時(shí)，才能被包裝成有感染，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l l-DNA的長(zhǎng)度的長(zhǎng)度，可以提高裝，可以提高裝載量。其實(shí)野生型載量。其實(shí)野生型l l-DNA上約有上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l l-DNA分成兩大類(lèi)載體：分成兩大類(lèi)載體： 插入型載體插入型載體取代型載體取代型載

26、體 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度縮短長(zhǎng)度 插入型載體插入型載體體外包裝體外包裝插入位點(diǎn)插入位點(diǎn)體外包裝體外包裝插入片段插入片段載體長(zhǎng)度載體長(zhǎng)度 37 kb插入片段大?。翰迦肫未笮。? - 14 kb（51 37）噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度縮短長(zhǎng)度 取代型載體（置換型載體）取代型載體（置換型載體）體外包裝體外包裝體外包裝體外包裝插入片段插入片段最小裝載長(zhǎng)度最小裝載長(zhǎng)度 10 kb（51 26）載體長(zhǎng)度載

27、體長(zhǎng)度 26 kb插入片段插入片段最大裝載長(zhǎng)度最大裝載長(zhǎng)度 25 kb（36 26）n允許外源允許外源 DNA 片段替換非必須片段替換非必須 DNA 片段的載體，稱(chēng)為片段的載體，稱(chēng)為置換型載體（置換型載體（replacement vectors）。一般情況下，置）。一般情況下，置換型載體克隆外源片段的大小范圍是換型載體克隆外源片段的大小范圍是 9-23kb ，故而該載，故而該載體主要用來(lái)構(gòu)建基因組文庫(kù)。體主要用來(lái)構(gòu)建基因組文庫(kù)。 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的野生型

28、的l l-DNA鏈上有鏈上有5個(gè)個(gè)EcoRI位點(diǎn)和位點(diǎn)和7個(gè)個(gè)HindIII位點(diǎn)，位點(diǎn)，不不利于重組操作，必須刪除至利于重組操作，必須刪除至1 - 2個(gè)個(gè)同時(shí)，為了便于各種來(lái)源的同時(shí)，為了便于各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增加一片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)些單一的酶切位點(diǎn)除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)位點(diǎn)噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型與質(zhì)粒不同，野生型l l-DNA上缺少合適

29、的選擇標(biāo)記，因此上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝加裝選擇標(biāo)記是選擇標(biāo)記是l l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類(lèi)：克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類(lèi)：免疫功能類(lèi)標(biāo)記免疫功能類(lèi)標(biāo)記顏色反應(yīng)類(lèi)標(biāo)記顏色反應(yīng)類(lèi)標(biāo)記噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記加裝選擇標(biāo)記 imm434imm434基因編碼一種阻止基因編碼一種阻止l l-噬菌體噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的基因的l l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立

30、溶載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，活， l l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑透明斑噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記加裝選擇標(biāo)記 lacZlacZ基因編碼基因編碼b b-半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化無(wú)色的無(wú)色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能基因中，基因滅活，

31、不能合成藍(lán)色化合物；而空載體合成藍(lán)色化合物；而空載體l l-DNA則產(chǎn)則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑生藍(lán)色透明斑噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：構(gòu)建琥珀密碼子的突變體構(gòu)建琥珀密碼子的突變體 琥珀型突變（琥珀型突變（sup) )是指由是指由CAG（Gln）向向UAG（stop）的突變。的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專(zhuān)一性地糾正這一突變。能專(zhuān)一性地糾正這一突變。將野生型將野生型l l-DNA上上D和和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的兩個(gè)頭

32、部包裝蛋白的基因中的CAG密碼密碼子突變成子突變成UAG。當(dāng)這種當(dāng)這種l l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的主要類(lèi)型：載體的主要類(lèi)型：插入滅活型載體插入滅活型載體C

33、haron2、Charon6、l lgt11取代型載體取代型載體l lEMBL4、l lgtl lc、l lNM762、Charon40正選擇型載體正選擇型載體l lEMBL1、l lL47、l l1059野生型的野生型的l l噬菌體不能在噬菌體不能在P2噬菌體溶源性噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（的細(xì)菌中繁殖（Spi+），），這種生長(zhǎng)抑制表型受這種生長(zhǎng)抑制表型受l l-DNA上的上的red和和gam兩個(gè)基因控制。若將外兩個(gè)基因控制。若將外源源DNA取代取代red和和gam，重組重組噬菌體便擁有噬菌體便擁有Spi-表型，能在表型，能在P2噬菌噬菌體體溶源性溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑的

34、大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA重組分子的體外包裝：重組分子的體外包裝：l l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l l噬菌體的大腸桿菌中提噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少一部分缺少E組份，另一部分則缺少組份，另一部

35、分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組這兩部分包裝蛋白與重組l l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組行，任何一種蛋白包裝液被重組l l-DNA污染后，均不能被包裝污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA及其重組分子的分離純化：及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)

36、期 加入加入l l噬菌體或重組噬菌體或重組l l噬菌體的懸浮液，噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)培養(yǎng)1小時(shí)小時(shí) 用新鮮培養(yǎng)基稀釋?zhuān)^續(xù)培養(yǎng)用新鮮培養(yǎng)基稀釋?zhuān)^續(xù)培養(yǎng)4 -12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒 密度已達(dá)密度已達(dá)1013 -1014 / L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放苯酚抽提，釋放l l-DNA 乙醇或異丙醇沉淀乙醇或異丙醇沉淀l l-DNA 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：作為載體的優(yōu)點(diǎn)：l l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能

37、高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 l l-DNA載體的裝載能力為載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 重組重組l l-DNA分子分子的篩選較為方便的篩選較為方便 重組重組l l-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便分子的提取較為簡(jiǎn)便 l l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)片段，但不適合表達(dá) 外源基因外源基因n表達(dá)載體表達(dá)載體 pET-5a 是典型的是典型的 pET 載體，其組成是在載體的載體，其組成是在載體的基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上加入了基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上加入了 T7 噬菌體啟動(dòng)子序列及其下游的噬菌體啟動(dòng)子序列及

38、其下游的幾個(gè)酶切位點(diǎn)。當(dāng)外源基因插入到這些酶切位點(diǎn)后，就可幾個(gè)酶切位點(diǎn)。當(dāng)外源基因插入到這些酶切位點(diǎn)后，就可在特定的宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。在特定的宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀噬菌體的外型呈絲狀M13 噬菌體噬菌體由外殼包裝蛋白和由外殼包裝蛋白和正正鏈鏈DNA組成組成 M13 DNA全長(zhǎng)全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸M13 DNA上上至少有至少有10個(gè)基因個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子個(gè)外殼蛋白分子M13 噬菌體噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制

39、其生長(zhǎng)不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng) nM13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂。菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂。M13 噬菌體的基因組為單鏈?zhǔn)删w的基因組為單鏈 DNA ，由，由 6407 的堿基組成的堿基組成 （GenBank 注冊(cè)號(hào)為注冊(cè)號(hào)為 V00604） ?；蚪M?；蚪M 90% 以上的序列可編以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有碼蛋白質(zhì)，共有 11 個(gè)編碼基因個(gè)編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個(gè)，基因

40、之間的間隔區(qū)多為幾個(gè)堿基。較大的間隔位于基因堿基。較大的間隔位于基因 和基因和基因 以及基因以及基因 和基因和基因 之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和和 DNA 合成的元件。合成的元件。M13 噬菌體基因組可編碼噬菌體基因組可編碼 3 類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（基因蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（基因 ， 和和 ），形態(tài)發(fā)生蛋白），形態(tài)發(fā)生蛋白（基因（基因， 和和 ），結(jié)構(gòu)蛋），結(jié)構(gòu)蛋白（基因白（基因 、 和和 ）?；蚪M）。基因組 DNA 為正鏈，按為正鏈，按基因基因 至基因至基因 方向合成，方向合成，與噬菌體的與噬菌體的 mRNA 序列同義。序列同義。 nM13 噬菌體顆粒為絲狀長(zhǎng)管

41、噬菌體顆粒為絲狀長(zhǎng)管狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng) 880nm ，直徑，直徑 6-7nm 。噬菌體顆粒的核心。噬菌體顆粒的核心由由 2700 個(gè)基因個(gè)基因 編碼的結(jié)編碼的結(jié)構(gòu)蛋白呈管狀排列而成，成構(gòu)蛋白呈管狀排列而成，成熟的基因熟的基因 的產(chǎn)物為由的產(chǎn)物為由 50 個(gè)氨基酸殘基組成的個(gè)氨基酸殘基組成的 螺旋螺旋蛋白。頂端由蛋白。頂端由 5 個(gè)基因個(gè)基因 和和 5 個(gè)基因個(gè)基因 產(chǎn)物組成，作用產(chǎn)物組成，作用于間隔區(qū)中的包裝信號(hào)。于間隔區(qū)中的包裝信號(hào)。 5 個(gè)基因個(gè)基因 蛋白和蛋白和 5 個(gè)基因個(gè)基因 蛋白位于絲桿的末端，參蛋白位于絲桿的末端，參與對(duì)性纖毛的吸咐。右圖是與對(duì)性纖毛的吸咐。右圖是 M13 噬菌

42、體結(jié)構(gòu)模型。噬菌體結(jié)構(gòu)模型。噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：噬菌體的生物學(xué)特性： 感染周期感染周期+ DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA- DNAIIV在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删w DNA （正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈 DNA ，用于 DNA 的復(fù)制，因此這種雙鏈 DNA 稱(chēng)為復(fù)制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA 。通過(guò) 復(fù)制方式， RF DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，基因的轉(zhuǎn)錄也隨即開(kāi)始?；蚪M中的任意一個(gè)啟動(dòng)子都可以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，單方向地終止于下游的終止

43、子。啟動(dòng)子和終止子的位置關(guān)系使得靠近終止子的基因轉(zhuǎn)錄更頻繁。 n單鏈單鏈 DNA 的酶切和連接是比較困難的，因此的酶切和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌噬菌體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈狀態(tài)的體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈狀態(tài)的 RF DNA。RF DNA 很容易從感染細(xì)胞中純化出來(lái)，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)很容易從感染細(xì)胞中純化出來(lái)，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過(guò)轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。行操作，并可通過(guò)轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删wDNAM13 DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：III VI I IV II X V VII IX VIII

44、野生型野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列載體系列載體lacZpolylinker噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删wDNAM13 DNA載體的特點(diǎn)：載體的特點(diǎn)：使克隆的使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在這在DNA定向突變中非常有用定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡(jiǎn)便重組分子篩選簡(jiǎn)便被被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越

45、大，混濁斑的混濁度亦越大斑的混濁度亦越大 但但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA 與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病 毒基因組毒基因組DNA。 動(dòng)植物病毒種類(lèi)繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病動(dòng)植物病毒種類(lèi)繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類(lèi)：按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類(lèi)： 單鏈單鏈DNA病毒病毒雙鏈雙鏈DNA病毒病毒單鏈單鏈RNA病毒病毒雙鏈雙鏈RNA病毒病毒 RNA病毒在自我復(fù)制

46、時(shí)大多存在相應(yīng)的病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組重組?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒考斯質(zhì)粒與噬菌粒 l l-DNA載體和載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為載體的裝載量最大分別為25 kb和和1.5 kb，但在很多情況下，往往需要但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源克隆更大的外源DNA片段，片段， 考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。的裝載量。 在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌

47、體DNA的長(zhǎng)度，的長(zhǎng)度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，同時(shí)列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，同時(shí)又能保證重組又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。不能形成噬菌體顆粒。n

48、粘粒（粘粒（cosmid）實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物，是帶有）實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物，是帶有 cos 序序列的質(zhì)粒。列的質(zhì)粒。 cos 序列是序列是 l l 噬菌體噬菌體 DNA 中將中將 DNA 包裝到包裝到噬菌體顆粒中所需的噬菌體顆粒中所需的 DNA 序列。序列。n粘粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（粘粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（colE1），抗性標(biāo)記（），抗性標(biāo)記（ampr），）， cos 位點(diǎn)，因而能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它位點(diǎn)，因而能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它的大小一般的大小一般 5-7kb 左右，用來(lái)克隆大片段左右，用來(lái)克隆大片段 DNA ，克隆，克隆的最大的最大 DNA 片段可達(dá)片段可達(dá) 45kb 。有

49、的粘粒載體含有兩個(gè)。有的粘粒載體含有兩個(gè) cos 位點(diǎn)，在某種程度上可提高使用效率。位點(diǎn)，在某種程度上可提高使用效率?？妓官|(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒考斯質(zhì)粒（考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類(lèi)人工構(gòu)建的含有考斯質(zhì)粒是一類(lèi)人工構(gòu)建的含有1978年年Collins和和Hohn發(fā)明構(gòu)建發(fā)明構(gòu)建pHC796400 bpTcrl l fragmentcosoriAprPstIBamHISalIl l-DNA cos序列和序列和質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類(lèi)型的載體特殊類(lèi)型的載體cos site - carrying plasmid1.8 kb的的l l-DN

50、A片段片段 + pBR322片段片段裝載范圍為裝載范圍為31 - 45 kb考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒考斯質(zhì)粒（考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像能像l l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量大（裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞受體細(xì)胞考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（phagemid or

51、 phasmid）噬菌粒載體的特點(diǎn)：噬菌粒載體的特點(diǎn)：噬菌粒是一類(lèi)人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w噬菌粒是一類(lèi)人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子包裝序列、復(fù)制子以及以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類(lèi)型的載體質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類(lèi)型的載體能像能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量比常規(guī)的裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（系列要大很多（10 kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易通過(guò)克隆雙鏈通過(guò)克隆雙鏈DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈能獲得同等長(zhǎng)度

52、的單一單鏈DNA考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒載體：重要的噬菌粒載體：pUC118 / 119pUC118 pUC18 + M13間隔區(qū)間隔區(qū) IGpUC119 pUC19 + M13間隔區(qū)間隔區(qū) IG500 個(gè)拷貝個(gè)拷貝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-MGpUC118 / 119表示表示M13輔助噬菌體輔助噬菌體DNA考斯質(zhì)粒與噬菌粒考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒載體：重要的噬菌粒載體：pBluescript 體外轉(zhuǎn)錄載體體外轉(zhuǎn)錄載體pBlues

53、cript = pUC + f1-ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZPT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動(dòng)子噬菌體啟動(dòng)子PT3和和PT7強(qiáng)化外強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄源基因的轉(zhuǎn)錄提取出來(lái)的單鏈提取出來(lái)的單鏈DNA重組分重組分子子在噬菌體在噬菌體RNA聚合酶的存聚合酶的存在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄的體外轉(zhuǎn)錄n人們?cè)O(shè)計(jì)出一些多功能的質(zhì)粒載體，這人們?cè)O(shè)計(jì)出一些多功能的質(zhì)粒載體，這類(lèi)質(zhì)粒載體有多克隆位點(diǎn)、類(lèi)質(zhì)粒載體有多克隆位點(diǎn)、 -互補(bǔ)、互補(bǔ)、噬菌體啟動(dòng)子和單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制與包噬菌體啟動(dòng)子和單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制與包裝信號(hào)。裝信號(hào)。

54、n典型的這類(lèi)質(zhì)粒有典型的這類(lèi)質(zhì)粒有 pBluescriptKS（），這類(lèi)質(zhì)粒一般由），這類(lèi)質(zhì)粒一般由 4 個(gè)質(zhì)粒組成一個(gè)質(zhì)粒組成一套系統(tǒng)，其差別在于多克隆位點(diǎn)方向相套系統(tǒng)，其差別在于多克隆位點(diǎn)方向相反（根據(jù)多克隆位點(diǎn)兩端反（根據(jù)多克隆位點(diǎn)兩端 Kpn 和和 Sac 的順序，用的順序，用 KS 或或 SK 表示），表示），或單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制啟始方向相反（或或單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制啟始方向相反（或者說(shuō)，引導(dǎo)者說(shuō)，引導(dǎo) DNA 雙鏈中不同鏈合成單雙鏈中不同鏈合成單鏈鏈 DNA ，用，用 + 或或 - 表示）。表示）。 pBluescriptKS（） 的多克隆位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)與與 pUC18/19 的不同，

55、且使用的不同，且使用 f1 噬菌噬菌體的復(fù)制與包裝信號(hào)序列體的復(fù)制與包裝信號(hào)序列 。 人造染色體載體人造染色體載體 人類(lèi)、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往人類(lèi)、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要需要克隆數(shù)百克隆數(shù)百甚至上千甚至上千 kb 的的DNA片段，片段， 此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源源DNA克隆在這些染

56、色體載體上后，便形成重組人造染色體，克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 目前常用的人造染色體載體包括：目前常用的人造染色體載體包括：細(xì)菌人造染色體（細(xì)菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（酵母人造染色體（YAC）人造染色體載體人造染色體載體細(xì)菌人造染色體（細(xì)菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在構(gòu)建的，其裝載量

57、范圍在50 - 300 kb之間之間各種類(lèi)型的各種類(lèi)型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝pBACs主要適用于：主要適用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù)構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù)F 質(zhì)粒質(zhì)粒n大腸桿菌的大腸桿菌的 F 因子是一個(gè)約因子是一個(gè)約 100kb 的質(zhì)粒。它編碼的質(zhì)粒。它編碼60多多種參與復(fù)制、分配和接合過(guò)程的蛋白質(zhì)（種參與復(fù)制、分配和接合過(guò)程的蛋白質(zhì)（Willetts and Skurray，1987）。）。n雖然雖然F因子通常以雙鏈閉環(huán)因子通常以雙鏈閉環(huán)DNA（1-2個(gè)拷貝個(gè)拷貝/細(xì)胞）的形細(xì)胞

58、）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少30個(gè)位點(diǎn)處個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行隨機(jī)整合（進(jìn)行隨機(jī)整合（Low，1987）。）。n攜帶攜帶F因子的細(xì)胞，或以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)表達(dá)三根因子的細(xì)胞，或以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)表達(dá)三根發(fā)樣狀的發(fā)樣狀的F菌毛。菌毛。F菌毛為供體與受體細(xì)胞之間產(chǎn)生性接菌毛為供體與受體細(xì)胞之間產(chǎn)生性接觸所必需。觸所必需。n細(xì)菌人工染色體是基于大腸桿菌的細(xì)菌人工染色體是基于大腸桿菌的 F 質(zhì)粒構(gòu)建的，高通質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載體。量低拷貝的質(zhì)粒載體。n每個(gè)環(huán)狀每個(gè)環(huán)狀 DNA 分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記，一個(gè)來(lái)分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo)

59、記，一個(gè)來(lái)源于大腸桿菌源于大腸桿菌 F 因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一個(gè)易于），一個(gè)易于 DNA 復(fù)制復(fù)制的由的由 ATP 驅(qū)動(dòng)的解旋酶（驅(qū)動(dòng)的解旋酶（ （RepE） 以及三個(gè)確保低拷以及三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座 （ parA , parB , 和和 parC ） 。 nBAC 載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產(chǎn)生，減小外源載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產(chǎn)生，減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用。20

60、060424真核生物載體真核生物載體n電穿孔技術(shù)是利用脈沖電場(chǎng)改變細(xì)胞膜的電穿孔技術(shù)是利用脈沖電場(chǎng)改變細(xì)胞膜的狀態(tài)和通透性，達(dá)到將狀態(tài)和通透性，達(dá)到將DNA導(dǎo)入細(xì)胞以及導(dǎo)入細(xì)胞以及促使細(xì)胞發(fā)生融合的目的。促使細(xì)胞發(fā)生融合的目的。n該技術(shù)目前一方面應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、植該技術(shù)目前一方面應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，另物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，另一方面應(yīng)用于細(xì)胞融合制備雜交細(xì)胞和動(dòng)一方面應(yīng)用于細(xì)胞融合制備雜交細(xì)胞和動(dòng)物克隆等。物克隆等。 顯微注射技術(shù)將外源顯微注射技術(shù)將外源DNA注入細(xì)胞注入細(xì)胞基因槍技術(shù)基因槍技術(shù)n是一種將核酸直接發(fā)送至細(xì)胞內(nèi)是一種將核酸直接發(fā)送至細(xì)