蛋白質定量實驗

1、 生命科學是以探求生命奧秘為中心課題。生命科學是以探求生命奧秘為中心課題。 蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能。功能。 沒有足夠純度的生物大分子，結構與功能沒有足夠純度的生物大分子，結構與功能的研究就無從談起。的研究就無從談起。 必須首先解決生物大分子的制備問題。必須首先解決生物大分子的制備問題。 對獲得的生物大分子進行鑒定。對獲得的生物大分子進行鑒定。離心離心分子分子生物學技術生物學技術電泳電泳層析層析光學光學生化生化實驗實驗生化實驗內容安排生化實驗內容安排實驗室實驗室實驗內容實驗內容一一實驗實驗16：DEAE纖維素離子交換層析纖維素離子交換層析二二

2、實驗實驗17：血清：血清-球蛋白的提純球蛋白的提純實驗實驗8 ：醋酸纖維素薄膜電泳：醋酸纖維素薄膜電泳三三實驗實驗9 ：聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳四四實驗實驗3 ：測定蛋白質的比色分析法：測定蛋白質的比色分析法實驗實驗12：血脂蛋白電泳：血脂蛋白電泳五五實驗實驗18：真核基因組：真核基因組DNA的分離提取的分離提取六六實驗實驗7 ：酶促反應：酶促反應動力學動力學實驗實驗19：質粒：質粒DNA的提取及酶切鑒定的提取及酶切鑒定第一輪第一輪實驗本身實驗本身:實驗室規(guī)則實驗室規(guī)則:時間、穿著、時間、穿著、儀器不能亂動儀器不能亂動、賠償制度、賠償制度、整潔、整潔、衛(wèi)生。衛(wèi)生。預習報告、預習報

3、告、規(guī)范操作規(guī)范操作（辨認標簽（辨認標簽）、）、如實記錄、如實記錄、污染物、毒物、廢棄物污染物、毒物、廢棄物（酸堿燒傷大量自來水沖洗）（酸堿燒傷大量自來水沖洗）l實驗實驗 實驗報告要求：實驗報告要求：題目，組號題目，組號實驗目的實驗目的實驗原理實驗原理實驗記錄：實驗記錄：如實記錄如實記錄實驗結果及結果分析：實驗結果及結果分析：實事求是實事求是討論或小結：討論或小結：生物化學實驗室規(guī)則生物化學實驗室規(guī)則 實驗前需預習實驗指導和有關理論，明確實驗目的、原理、預期的結果、實驗前需預習實驗指導和有關理論，明確實驗目的、原理、預期的結果、 操作關鍵步驟及注意事項操作關鍵步驟及注意事項,寫預習報告寫預習報

4、告。 實驗要嚴肅認真地按照操作規(guī)程進行，注意觀察實驗中出現的現象和結果，實驗要嚴肅認真地按照操作規(guī)程進行，注意觀察實驗中出現的現象和結果，并把實驗數據和結果并把實驗數據和結果及時如實及時如實記錄在實驗記錄本上，課后根據實驗結果進記錄在實驗記錄本上，課后根據實驗結果進行科學分析。行科學分析。 實驗室和實驗臺應實驗室和實驗臺應保持整潔保持整潔。公用試劑用畢，立即蓋嚴并還原。實驗完畢，。公用試劑用畢，立即蓋嚴并還原。實驗完畢，儀器洗凈放好。儀器洗凈放好。 注意節(jié)約藥品、試劑和各種物品，愛護儀器，按規(guī)程操作儀器，注意節(jié)約藥品、試劑和各種物品，愛護儀器，按規(guī)程操作儀器，以免損壞以免損壞。 實驗室實驗室嚴

5、禁吸煙！嚴禁吸煙！乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加熱，并遠離火源。實乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加熱，并遠離火源。實驗結束離開實驗室之前，關好窗戶，切斷電源，水源，確保安全。驗結束離開實驗室之前，關好窗戶，切斷電源，水源，確保安全。 若發(fā)生酸堿灼燒事故，若發(fā)生酸堿灼燒事故，應用大量自來水沖洗應用大量自來水沖洗，酸灼傷者用飽和，酸灼傷者用飽和NaHCO3溶溶液中和，堿灼傷者用飽和液中和，堿灼傷者用飽和H3BO3溶液中和，氧化劑傷害者用溶液中和，氧化劑傷害者用Na2S2O4處理。處理。 所有所有固體廢棄物固體廢棄物如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于垃圾桶中。如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于

6、垃圾桶中。強強酸、強堿酸、強堿必須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽。必須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽。血漿脂蛋白的分類血漿脂蛋白的分類血漿脂蛋白組成特點血漿脂蛋白組成特點血漿脂蛋白的結構血漿脂蛋白的結構血脂代謝的臨床意義血脂代謝的臨床意義電泳技術簡介電泳技術簡介 電泳定義電泳定義 電泳技術電泳技術 影響電泳速度的主要因素影響電泳速度的主要因素 電泳的分類電泳的分類 水平電泳裝置水平電泳裝置 瓊脂糖的特點瓊脂糖的特點實驗原理實驗原理： 各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類及數量不同，各種脂蛋白顆粒大小、及數量不同，各種脂蛋白顆粒大小、帶電荷的數量相差也很大，因此以

7、帶電荷的數量相差也很大，因此以瓊脂糖凝膠為支持物，在電場中可瓊脂糖凝膠為支持物，在電場中可使各種脂蛋白顆粒分離開來。使各種脂蛋白顆粒分離開來。 實驗方法（概括）實驗方法（概括） 將血清脂蛋白用脂類染料（如蘇丹將血清脂蛋白用脂類染料（如蘇丹黑或油紅等）進行預染。再將預染黑或油紅等）進行預染。再將預染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進行過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進行電泳分離，通電后，可以看出脂蛋電泳分離，通電后，可以看出脂蛋白向正極移動，并分離為幾個區(qū)帶。白向正極移動，并分離為幾個區(qū)帶。實驗操作 、預染血清、預染血清 2 2、制備瓊脂糖凝膠板、制備瓊脂糖凝膠板 、點加血清、點加血清 、電泳、電泳 、觀察

8、并記錄電泳結果、觀察并記錄電泳結果 (1)蘇丹黑染色液：稱取100nag蘇丹黑B加0.2mL2氧六環(huán)混勻，加3mL無水乙醇，37 0C水浴30min。 (2)巴比妥緩沖液：稱取巴比妥鈉5.4g，巴比妥2.76g及EDTA0.29g，加水溶解后再加蒸餾水至1000mL(pH為8.6離子強度0.075)，為電極緩沖液。 (3)凝膠緩沖液：取三羥甲基氨基甲烷1.212g，EDTA0.29g及NaCl5.85g，用蒸餾水溶解后，稀釋至1000mL，pH為8.6。 (4)瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖0.5g溶于50mL凝膠緩沖液中，再加水50ml。在水浴中加熱至沸。待瓊脂糖完全溶解后，立即停止加熱。試劑實驗目

9、的實驗目的1. 掌握雙縮脲法測定蛋白濃度的原理。掌握雙縮脲法測定蛋白濃度的原理。2. 掌握掌握Lowry氏法測定蛋白濃度的原理。氏法測定蛋白濃度的原理。3. 學會使用分光光度計。學會使用分光光度計。 4. 總結蛋白質定量方法的設計思路?？偨Y蛋白質定量方法的設計思路。實驗原理實驗原理一、雙縮脲法測定血清總蛋白一、雙縮脲法測定血清總蛋白 雙縮脲反應雙縮脲反應 操作操作 計算計算 試劑及器材試劑及器材二、二、Lowry氏法測定蛋白質含量法氏法測定蛋白質含量法 原理原理 操作操作 計算計算 試劑及器材試劑及器材試劑使用規(guī)則試劑使用規(guī)則 使用試劑前應該使用試劑前應該仔細辨認標簽仔細辨認標簽，看清名稱及濃

10、度，是，看清名稱及濃度，是 否否為本實驗所需。為本實驗所需。 取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試劑決不可倒回原瓶。劑決不可倒回原瓶。 取標準溶液時，取標準溶液時，應該將標準溶液倒入干試管中應該將標準溶液倒入干試管中，再用干，再用干凈吸管吸取標準液，凈吸管吸取標準液，以免污染瓶中的標準液體。以免污染瓶中的標準液體。 使用滴管時，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內。使用滴管時，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內。 使用有毒試劑及強酸強堿時，盡可能用量筒取，若用吸使用有毒試劑及強酸強堿時，盡可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸

11、取，以免造成意外。管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。吸量管的種類吸量管的種類 奧氏吸量管奧氏吸量管 供準確量取供準確量取0.50、1.0、2.0、3.0ml液體所用。這液體所用。這種吸量管只有一個刻度，當放出所量取的液體時，管尖余留種吸量管只有一個刻度，當放出所量取的液體時，管尖余留的液體必須吹入容器內。的液體必須吹入容器內。 移液管移液管 常用量取常用量取50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0ml的液體，的液體，這種吸量管只有一個刻度，放液時，量取的液體自然流出后，這種吸量管只有一個刻度，放液時，量取的液體自然流出后，管尖需在容器內滯留管尖需在容器內滯留15秒。秒。

12、注意管尖殘留的液體不要吹出。注意管尖殘留的液體不要吹出。 刻度吸量管刻度吸量管 供量取供量取10 ml以下任意體積的溶液。一般刻度包以下任意體積的溶液。一般刻度包括尖端部分。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管括尖端部分。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管尖的溶液。此類吸量管為尖的溶液。此類吸量管為“吹出式吹出式”，吸量管上端標有，吸量管上端標有“吹吹”字。未標字。未標“吹吹”字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體。字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體。吸量管的使用吸量管的使用原則原則 量取整數量液體，并且取量要求準確時，應該選用奧氏量取整數量液體，并且取量要求準確時，應該選用奧氏吸量

13、管。量取大體積時要用移液管。同一定量實驗中，吸量管。量取大體積時要用移液管。同一定量實驗中，如欲加同種試劑于不同的管中，并且取量不多時，如欲加同種試劑于不同的管中，并且取量不多時，應應選擇一支與最大取液量接近的刻度吸量管。選擇一支與最大取液量接近的刻度吸量管。吸量管的使用方法吸量管的使用方法 正確拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂正確拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端端 取液：用橡皮球吸液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸取液：用橡皮球吸液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上端。完后用食指頂住吸量管上端。 調刻度：吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸

14、，并調刻度：吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應在一水平面上。面、刻度和視線應在一水平面上。 放液：吸量管移入準備接受溶液的容器中，仍使其出口尖放液：吸量管移入準備接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開食指，端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開食指，使液體自動流出。奧氏吸量管和刻度到底的吸量管應吹出使液體自動流出。奧氏吸量管和刻度到底的吸量管應吹出尖端殘留的液體。移液管應最后靠壁尖端殘留的液體。移液管應最后靠壁15秒。秒。 加

15、樣器的正確使用加樣器的正確使用 移液管的正確使用（特別注意每種試劑移液管的正確使用（特別注意每種試劑的專用管不可混用）的專用管不可混用） 加樣量的準確性加樣量的準確性 溫度與時間的準確性溫度與時間的準確性 分光光度計的校準和使用分光光度計的校準和使用 開啟電源，儀器預熱開啟電源，儀器預熱20分鐘。分鐘。 波長調至測試用波長。波長調至測試用波長。 將比色皿架處于空白管位置，打開試樣室蓋，選將比色皿架處于空白管位置，打開試樣室蓋，選擇擇“T”檔，調節(jié)檔，調節(jié)“0”按鈕，使數字顯示為按鈕，使數字顯示為“0.00”。 蓋上試樣室蓋，使光電管受光，調節(jié)透過率蓋上試樣室蓋，使光電管受光，調節(jié)透過率“100

16、%”按鈕，使數字顯示為按鈕，使數字顯示為“100.0”。 吸光度的測量，將選擇開關置于吸光度的測量，將選擇開關置于“A”，調節(jié)吸光，調節(jié)吸光度調零按鈕，使數字顯示為度調零按鈕，使數字顯示為0.00，然后將被測，然后將被測樣品移入光路，顯示值即為被測樣品的吸光度值。樣品移入光路，顯示值即為被測樣品的吸光度值。 722機的光譜范圍在機的光譜范圍在360nm-800nm722分光光度計使用方法分光光度計使用方法該機的光譜范圍在該機的光譜范圍在360nm-800nm。 接通電源，打開機器開關，使儀器通電，打開箱蓋，預熱接通電源，打開機器開關，使儀器通電，打開箱蓋，預熱10分鐘。分鐘。 將空白液或對照液

17、及測定液分別裝入比色杯將空白液或對照液及測定液分別裝入比色杯3/4體積并用軟紙擦清外壁，體積并用軟紙擦清外壁， 放入樣品室。放入樣品室。 調節(jié)電流計上零點調節(jié)器，使讀書盤上指針的吸光度為調節(jié)電流計上零點調節(jié)器，使讀書盤上指針的吸光度為A或透光率為或透光率為0。 調節(jié)測定所用波長。調節(jié)測定所用波長。 蓋上箱蓋，光徑開關自動打開。轉動光量調節(jié)器使空白或對照管的吸光蓋上箱蓋，光徑開關自動打開。轉動光量調節(jié)器使空白或對照管的吸光 度為度為0，或透光率為，或透光率為100，待讀數指針穩(wěn)定后，逐步拉出樣品盒滑干，待讀數指針穩(wěn)定后，逐步拉出樣品盒滑干， 通過讀數指針，讀取測定管上的吸光度。有時需調節(jié)靈敏度開

18、關，才能通過讀數指針，讀取測定管上的吸光度。有時需調節(jié)靈敏度開關，才能 正確讀得吸光度。此時應重新轉動零點調節(jié)器至吸光度為正確讀得吸光度。此時應重新轉動零點調節(jié)器至吸光度為A。 讀數完畢，打開儀器蓋板，關閉開關，將比色杯沖洗干凈。讀數完畢，打開儀器蓋板，關閉開關，將比色杯沖洗干凈。 溶液定量測定時，應注意吸光度在溶液定量測定時，應注意吸光度在0.11.0范圍，濃度太大時應適當稀范圍，濃度太大時應適當稀 釋。釋。 *注意事項：注意事項： 1）用手拿比色杯的磨砂面。）用手拿比色杯的磨砂面。 2）液體的體積裝滿比色杯的）液體的體積裝滿比色杯的3/4。 3）不要將比色杯放在分光光度計上）不要將比色杯放在分光光度計上。1.比色杯光學表面不能有任何污損，否則會比色杯光學表面不能有任何污損，否則會引起光吸收的增加。用手拿比色杯的磨砂面。引起光吸收的增加。用手拿比色杯的磨砂面。 3.裝液量不能超過裝液量不能超過3/4,用前潤洗。用前潤洗。2.2.比色杯的外表面應以高質量的柔軟擦鏡紙或比色杯的外表面應以高質量的柔軟擦鏡紙或綢布擦干凈，不能使用易磨損比色杯的濾紙。綢布擦干凈，不能使用易磨損比