第3次課2學(xué)時(shí)

1、河北科技大學(xué)教案用紙第7次課2學(xué)時(shí)上次課復(fù)習(xí)：1. -氨基酸的烴基化反應(yīng)常用的二種試劑是？2. -氨基酸的茚三酮反應(yīng)呈現(xiàn)的顏色是否都一樣？3. 常用的打開(kāi)二硫鍵的氧化劑和還原劑是什么？4. 哪三種氨基酸在 280nm 紫外光下有吸收峰？本次課題（或教材章節(jié)題目）：第三章蛋白質(zhì)第二節(jié)蛋白質(zhì)概述第三節(jié)肽及蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)教學(xué)要求：1. 了解蛋白質(zhì)的分類、形狀及大小、構(gòu)象和結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能、肽與蛋白質(zhì)的人工合成；2. 理解并掌握肽鍵、肽平面、二面角、 ，肽鍵的雙鍵性質(zhì)以及由此帶來(lái)的對(duì)蛋白質(zhì)肽鍵構(gòu)象的影響；蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能3. 熟記幾種主要蛋白酶的作用部位和蛋白質(zhì)氨基酸序列確定的方法，能根

2、據(jù)實(shí)驗(yàn)推斷簡(jiǎn)單多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)。重點(diǎn)：蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定步驟；蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能；蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念；肽鍵的特點(diǎn)難點(diǎn)：蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定教學(xué)手段及教具：課堂講授與PowerPoint 演示相結(jié)合。講授內(nèi)容及時(shí)間分配：復(fù)習(xí)：5分第三章蛋白質(zhì)第二節(jié)蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成與分類二、蛋白質(zhì)的形狀和大小三、蛋白質(zhì)的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能四、蛋白質(zhì)生物學(xué)功能第三節(jié)肽及蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（15 分）一、肽二、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)三、蛋白質(zhì)氨基酸序列與生物功能四、肽與蛋白質(zhì)的人工合成小結(jié)：5分1. 蛋白質(zhì)系數(shù)；單純蛋白質(zhì)；結(jié)合蛋白質(zhì)；單體蛋白質(zhì)；寡聚蛋白質(zhì)；去污劑；多肽的等電點(diǎn)

3、；肽平面、二面角2. 肽鍵的特點(diǎn)；蛋白質(zhì)紫外吸收特點(diǎn)；茚三酮反應(yīng)；雙縮脲反應(yīng)；3. 肽的酸堿特性；求某肽的 pI 及在某 pH 下所帶凈電荷；課后作業(yè)4.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定序列的步驟？5.舉例說(shuō)明氨基酸序列與生物功能的關(guān)系？6.某肽加入測(cè)定 氨基 N 末端的試劑后沒(méi)反應(yīng)。說(shuō)明此肽是環(huán)肽？7.胰島素人工合成的主要途徑？195 頁(yè)習(xí)題： 3,4,5 ，8參考資料生物化學(xué)科學(xué)出版社現(xiàn)代生物學(xué)精要速覽中文版王鏡巖等譯蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)高教出版社第二版陶慰孫等第1頁(yè)共9頁(yè)河北科技大學(xué)教案用紙第三節(jié) 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)162頁(yè)肽蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)及序列測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能肽與蛋白質(zhì)的人工合成一、肽肽和

4、肽鍵的結(jié)構(gòu)肽的兩性解離肽的化學(xué)性質(zhì)天然存在的活性肽1. 肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽是氨基酸的線性聚合物。氨基酸順序： N端C端氨基酸殘基；寡肽與多肽；環(huán)肽肽鍵的特點(diǎn)具有部分雙鍵特性，不能自由旋轉(zhuǎn), 呈現(xiàn)相對(duì)的剛性和平面化。肽鍵的亞氨基沒(méi)有明顯的解離和質(zhì)子化。除脯氨酸外多以反式結(jié)構(gòu)存在。肽平面、肽單位、二面角多肽中的二硫鍵肽的命名開(kāi)鏈肽都具有游離的氨基和 羧基？有的開(kāi)鏈肽的N端或 C端的游離的 氨基或 羧基被別的基團(tuán)結(jié)合（如烷基化、酰化等）或N端殘基自身環(huán)化（如：谷氨酸）。脯氨酸在 N端也沒(méi)有游離的 氨基。2. 肽的兩性解離166 頁(yè)具有兩性解離和等電點(diǎn)：多肽鏈中可解離功能團(tuán)的pKa值）例： pH7 時(shí)，

5、所帶靜電荷是？pI 是？是 0 pI=(4.6+7.8)/2求：三肽 Lys-Lys-Lys的 pI每個(gè)側(cè)鏈解離后帶有1/3 個(gè)正電荷，此時(shí)的pH為 pI 。利用公式：pH = p Ka + lg（ 堿 /酸 ）pH = 10.2 lg （2/3/1/3）pH = 10.2 0.303. 肽的化學(xué)反應(yīng)多肽鏈的水解：酸水解、堿水解、酶水解具有旋光性顏色反應(yīng)第2頁(yè)共9頁(yè)河北科技大學(xué)教案用紙紫外吸收顏色反應(yīng)茚三酮反應(yīng)紫色，用于定性和定量肽。雙縮脲反應(yīng)紫色或蘭紫色( 540nm）。雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物有此反應(yīng)。氨基酸沒(méi)有紫外吸收具紫外吸收：在280nm處有最大吸收峰，

6、可進(jìn)行肽類定量測(cè)定。原因是：含Trp 、 Tyr 、 Phe紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量4. 天然存在的重要多肽以蛋白質(zhì)形式存在:相對(duì)分子質(zhì)量在6000以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。多肽與蛋白質(zhì)無(wú)嚴(yán)格的界線。以天然活性肽形式存在：分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。具有特殊的生理功能，常稱為活性肽在天然活性肽中含有非蛋白質(zhì)氨基酸和肽鍵。生物活性肽 (Natural peptide)167頁(yè)腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。腦啡肽（五肽）Leu- 腦啡肽和 Met- 腦啡肽。H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COOH3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO前體物

7、：前腦啡肽原（含267個(gè)殘基）有和嗎啡類似的鎮(zhèn)痛作用（大腦中有嗎啡受體）。內(nèi)啡肽包括 內(nèi)啡肽（ 16肽） 內(nèi)啡肽（ 31肽） 內(nèi)啡肽（ 17肽）前體物：促黑素促皮質(zhì)激素原多肽類抗生素：一類具有很強(qiáng)抗菌能力的肽.青霉素（二肽衍生物）：短桿菌肽（ 10肽）：催產(chǎn)素和加壓素谷胱甘肽： - 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸谷胱甘肽重要的生物功能第3頁(yè)共9頁(yè)河北科技大學(xué)教案用紙作為抗氧化劑維護(hù)蛋白質(zhì)活性中心的巰基游離。參與二硫化合物相互轉(zhuǎn)化。某些酶的輔酶，在體內(nèi)氧化還原過(guò)程中起重要的作用。GSH：在紅細(xì)胞中作為巰基緩沖劑存在，維持血紅蛋白和其他紅細(xì)胞蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基處于還原態(tài)。肽的應(yīng)用及發(fā)展近年來(lái)，多肽的分離純

8、化、結(jié)構(gòu)分析、化學(xué)合成、生物、放射免疫測(cè)定、免疫細(xì)胞化學(xué)以及遺傳工程等新技術(shù)的應(yīng)用，新的活性肽不斷發(fā)現(xiàn)，對(duì)活性肽功能認(rèn)識(shí)不斷增長(zhǎng)，促使這一領(lǐng)域迅速發(fā)展練習(xí)題在一些天然肽中含有蛋白質(zhì)中不存在的_、_等特殊結(jié)構(gòu)。 這些結(jié)構(gòu)上的變化可使這些肽免受蛋白水解酶的作用。蛋白質(zhì)之所以出現(xiàn)各種內(nèi)容豐富的構(gòu)象是因?yàn)開(kāi) 鍵和 _鍵能有不同程度的轉(zhuǎn)動(dòng)。雙縮脲反應(yīng)肽、蛋白質(zhì)、氨基酸都具有的反應(yīng)。在酸溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行紙層析分離Lys和 Leu混合物，問(wèn)哪種Rf 大？用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離PH7的氨基酸混合液Lys、 Glu ，問(wèn)哪種先被洗脫出來(lái)？二、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（化學(xué)結(jié)構(gòu)）168頁(yè)指蛋白質(zhì)分子中氨基酸的組成、排列順序、

9、連接方式以及多肽鏈的數(shù)目和關(guān)聯(lián)。（主要為肽鍵，包括二硫鍵）是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和生理功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定多肽鏈氨基酸順序測(cè)定要求樣品必須是均一的。純度在>97% 以上知道蛋白質(zhì)的分子量步驟（待測(cè)樣品分成多份分別進(jìn)行各步驟測(cè)定）測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈和二硫鍵分析每一多肽鏈的氨基酸組成測(cè)定并確定多肽鏈的氨基酸序列確定原多肽鏈中二硫鍵的位置第一步：測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目測(cè)定末端基（C端或 N端），看蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)與末端基的摩爾數(shù)的比例？若 1：1？ 1： 2？ 1：3？第二步：拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈和二硫鍵借助非共價(jià)相互作用締合的（亞基之間）采用變性劑

10、：8mol/L 尿素； 6mol/L 鹽酸胍； SDS處理。通過(guò)共價(jià)二硫橋（S S）交聯(lián)的肽鏈采用氧化劑或還原劑：將二硫鍵斷裂。分離、純化多肽鏈：電泳、層析等方法。第三步：分析每一多肽鏈的氨基酸組成待測(cè)樣品經(jīng)酸(6mol/L HCl)和堿 (5mol/L NaOH) 完全水解。用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定（強(qiáng)陽(yáng)離子交換，茚三酮反應(yīng)）。測(cè)定水解液中的氨基酸組成和比例，氨量。第4頁(yè)共9頁(yè)河北科技大學(xué)教案用紙第四步：測(cè)定多肽鏈的氨基酸序列N末端氨基酸測(cè)定C末端分析多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化確定肽段在多肽鏈中的次序1.N 末端氨基酸測(cè)定2,4 二硝基氟苯法（Sanger 試劑， DNFB或 FD

11、NB）1945 年由 Sanger 發(fā)明此法，曾用此方法測(cè)定了胰島素的N - 末端PITC（苯異硫氰酸酯、Edman法）Edman （苯異硫氰酸酯法）能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。一次可以連續(xù)測(cè)出80個(gè)左右的殘基順序。大的肽鏈測(cè)序前要化大為小，不能采用全水解。蛋白質(zhì)順序儀是以此法為原理設(shè)計(jì)的。Edman降解法的改進(jìn)方法- DNS-Edman 降解法用 DNS(二甲基萘磺酰氯 ) 測(cè)定 N端氨基酸原理 DNFB法相同但水解后的 DNS-氨基酸不需分離，可直接用電泳或?qū)游龇ㄨb定由于 DNS有強(qiáng)烈熒光，靈敏度比 DNFB法高 100倍，比 Edman法高幾到十幾倍可用于

12、微量氨基酸的定量用 Edman降解法提供逐次減少一個(gè)殘基的肽鏈靈敏度提高，能連續(xù)測(cè)定。多肽順序自動(dòng)分析儀樣品最低用量可在5pmol氨肽酶法：從N端依次切斷肽鍵H2NVal His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu Lys COOH2.C 末端分析羧肽酶法羧肽酶 A：水解除 Pro,Arg 和Lys 以外的所有 C-末端氨基酸羧肽酶 B：只能水解Arg 和Lys 為 C-末端殘基的肽鍵。C- 末端第二個(gè)是Pro時(shí)不作用還原法肼解法天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸被破壞不易測(cè)定出。3. 多肽鏈部分裂解和肽段混合物的分離純化要求：選用專一性強(qiáng)的、斷裂點(diǎn)少的、反應(yīng)產(chǎn)率高的蛋白水解酶或化學(xué)試劑進(jìn)行有控

13、制的裂解。后將所得混合物進(jìn)行分離純化。經(jīng) N未端和 C未端測(cè)定，確定出每一肽段的序列。酶解法（表現(xiàn)出專一性）174頁(yè)化學(xué)法溴化氰水解法(CNBr):切割Met的羧基所形成的肽鍵。Rm=Met，形成高絲氨酸內(nèi)酯。第5頁(yè)共9頁(yè)河北科技大學(xué)教案用紙用羥胺斷裂 :它斷裂 Asn-Gly- , 但專一性不高。 蛋白質(zhì)中出現(xiàn)機(jī)率低， 適于分子量大的蛋白質(zhì)序列的測(cè)定。 Rm=Asn Rn=Gly4. 確定肽段在多肽鏈中的次序所得資料：N 末端殘基HC末端殘基S第一套肽段OUS PSEOVE RLAHOWT第二套肽段SEO WTOU VERLAPSHO借助重疊肽確定肽段次序：HOWT OUS EOVERLAP

14、S第五步：確定原多肽鏈中二硫鍵的位置采用胃蛋白酶：專一性低，切點(diǎn)多。肽段比較小，分離、鑒定比較容易。作用 pH在酸性范圍。肽段混合物進(jìn)行的對(duì)角線電泳對(duì)角線電泳巰基的保護(hù)例：有一個(gè) A肽？酸水解得到：Ala 、Arg 、 Ser 、 Glu 、Phe、 Met；當(dāng) A肽與 FDNB試劑反應(yīng)后得：DNP-Ala ；當(dāng) A肽用 CNBr降解時(shí)得到：游離的Ser 和一種肽；當(dāng) A肽用胰蛋白酶降解時(shí)得到兩種肽：一種含 Ala 、 Arg ，另一種含其它氨基酸當(dāng) A肽用糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）降解時(shí)得到兩種肽：一種含 Met、 Ser ，另一種含其它氨基酸；問(wèn) A肽的氨基酸排列順序如何？三、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)

15、構(gòu)與生物功能181頁(yè)同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化同源蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化起源血液凝固與氨基酸序列的局部斷列同種蛋白質(zhì)氨基酸個(gè)體差異和分子病1. 同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化同源蛋白質(zhì)可變殘基不變殘基序列同源細(xì)胞色素 C 182 頁(yè)是一類以鐵卟啉為輔基的蛋白質(zhì)，呼吸鏈的組分。不同生物體的細(xì)胞色素 C序列間 氨基酸差異數(shù)目的比較系統(tǒng)樹(shù)2. 同源蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化起源第6頁(yè)共9頁(yè)河北科技大學(xué)教案用紙氧合血紅素蛋白（序列同源，相似的生物功能）原始珠蛋白基因肌紅蛋白（ 153）；血紅蛋白（141,146 ）絲氨酸蛋白酶類（序列同源，趨異的生物功能）祖先絲氨酸蛋白酶基因胰蛋白酶；胰凝乳蛋白酶；凝血酶

16、；纖溶酶一些功能差異很大的蛋白質(zhì)（序列同源，三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，不同的生物功能）溶菌酶； - 乳清蛋白3. 血液凝固與氨基酸序列的局部斷列185頁(yè)血液凝固的生物化學(xué)機(jī)理凝血系統(tǒng)凝血因子，以無(wú)活性的前體或酶原形式存在。纖溶系統(tǒng)：纖溶酶原單鏈糖蛋白纖溶酶原激活劑(PA)主要是 t-PA其他凝血酶原的結(jié)構(gòu)示意圖血纖蛋白原的結(jié)構(gòu)示意圖分子含 29個(gè)二硫鍵， 6條多肽鏈由這些二硫鍵交聯(lián)成一個(gè)整體分子。凝血酶斷裂血纖蛋白原中央球狀區(qū)的4個(gè) Arg-Gly鍵，釋放出的肽稱血纖肽。血纖蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)檐浹w蛋白塊血纖蛋白單體以非共價(jià)鍵結(jié)合成血纖蛋白軟凝塊纖溶系統(tǒng)t-PA 激活纖溶酶原及纖溶酶降解血纖蛋白凝塊。4. 同種

17、蛋白質(zhì)氨基酸個(gè)體差異和分子病同種蛋白質(zhì)：來(lái)自同種 生物行使同一生物功能的蛋白質(zhì)。例 : 鐮刀形紅細(xì)胞貧血病分子病正常血紅蛋白-Hb,非正常血紅蛋白-HbS血紅蛋白的結(jié)構(gòu)由 4個(gè)多肽亞基組成， 屬寡聚蛋白質(zhì)。 成人血紅蛋白主要是 HbA（ 2 ( 各 141肽 ) ，2( 各 146肽) ）。鐮刀形紅細(xì)胞貧血病的分子基礎(chǔ)分子基礎(chǔ)第7頁(yè)共9頁(yè)河北科技大學(xué)教案用紙HbA: Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS: Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys 鏈12345678脫氧 HbS高濃度存在時(shí)，形成長(zhǎng)纖維，使紅細(xì)胞變形四、肽與蛋白質(zhì)的人工合成1

18、958 年，北大生物系在國(guó)內(nèi)首次合成了具有生物活性的八肽催產(chǎn)素。1965 年 9月，中科院生物化學(xué)研究所、有機(jī)化學(xué)研究所和北大化學(xué)系協(xié)作，在世界上首次人工合成了結(jié)晶牛胰島素。肽的人工合成有兩種類型：由不同氨基酸按照一定順序控制合成。由一種或兩種氨基酸聚合或共聚合?？刂坪铣傻睦щy：接肽反應(yīng)所需的試劑的選擇。接肽以前必須首先把不需參與反應(yīng)的基團(tuán)封閉保護(hù)。保護(hù)劑應(yīng)具備兩個(gè)條件在接肽時(shí)能起保護(hù)作用。在接肽以后又很容易除去，致引起肽鍵的斷裂。常用保護(hù)基的結(jié)構(gòu)式肽鍵形成方法羧基活化法：氨基先保護(hù)起來(lái)，再將羧基轉(zhuǎn)變成一個(gè)活潑的羧酸衍生物。偶聯(lián)劑縮合法常用的是： N， N二環(huán)已基碳二亞胺（DCC），能夠促進(jìn)羧

19、基和氨基之間的縮合反應(yīng)。DCC先與一分子氨基酸的羧基反應(yīng)，生成類似酸酐的中間產(chǎn)物，這種不穩(wěn)定的中間物能夠進(jìn)一步與第二分子氨基酸的氨基作用，形成肽鍵。消旋化可能性小，是多肽合成中應(yīng)用最廣的一種試劑。多肽的固相合成1962 年， Merrifiele R B發(fā)展起來(lái)的 . 此技術(shù)對(duì)分子生物學(xué)和基因工程研究具有重大影響和重要意義。肽鏈的逐步延長(zhǎng)是在不溶性聚苯乙烯脂小珠上進(jìn)行，反應(yīng)后通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾回收被延長(zhǎng)的產(chǎn)物，用于下一步全成。整個(gè)合成過(guò)程可在程序控制的自動(dòng)化固相合成儀上進(jìn)行。美國(guó) Merrifield等人報(bào)道，利用這種肽合成儀（peptidesynthesizer)成功地合成了九肽舒緩激肽?；?2