儀器分析講稿(第3章液相)

1、Instrumental Analytical 儀器儀器 高效液相色譜分析高效液相色譜分析High Performance Liquid High Performance Liquid Chromatography,HPLCChromatography,HPLC第第 3 3 章章內(nèi)容提要內(nèi)容提要1 1 高效液相色譜法的特點(diǎn)高效液相色譜法的特點(diǎn)2 2 影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素3 3 高效液相色譜法的主要類型及其分離原理高效液相色譜法的主要類型及其分離原理4 4 液相色譜法的固定相液相色譜法的固定相5 5 液相色譜法流動相液相色譜法流動相6 6 高效液相色譜儀高

2、效液相色譜儀7 7 高效液相色譜分離類型的選擇高效液相色譜分離類型的選擇8 8 高效液相色譜法應(yīng)用實(shí)例高效液相色譜法應(yīng)用實(shí)例9 9 液相制備色譜液相制備色譜10 10 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳3.13.1高效液相色譜的特點(diǎn)高效液相色譜的特點(diǎn)一、定義：液相色譜法是指一、定義：液相色譜法是指流動相為液體流動相為液體的色譜技術(shù)。的色譜技術(shù)。高效液相色譜是高效液相色譜是2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)年代迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高效、快速的分離技術(shù)。（液相色譜高效、快速的分離技術(shù)。（液相色譜+ +氣相色譜理氣相色譜理論論+ +高壓泵、高效固定相高壓泵、高效固定相+ +高靈敏檢測器）。高靈敏檢測器）

3、。二、特點(diǎn)二、特點(diǎn)1.1.高壓高壓: : 可達(dá)可達(dá)150350105 Pa2.2.高速高速: : 例，分離例，分離2020種氨基酸，經(jīng)典色譜法要種氨基酸，經(jīng)典色譜法要2020多小多小時(shí)，用時(shí)，用HPLCHPLC只需只需1 1小時(shí)小時(shí). .3.3.高效高效：3 3萬塔板萬塔板/ /米（米（GC2000GC2000塔板塔板/ /米）米）4.4.高靈敏度高靈敏度： 紫外檢測器紫外檢測器1010-9-9 g g；熒光檢測器；熒光檢測器1010-11-11g g三、應(yīng)用范圍三、應(yīng)用范圍 氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對高沸點(diǎn)化合物、非

4、揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型對高沸點(diǎn)化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應(yīng)用受到一化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應(yīng)用受到一定程度的限制，定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計(jì)只有大約據(jù)統(tǒng)計(jì)只有大約20%20%的有機(jī)物能用氣相色譜分的有機(jī)物能用氣相色譜分析析；而液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非；而液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物的占有機(jī)物

5、的70 - 70 - 80%80%。 。 因此，高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不因此，高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?，不受試樣揮發(fā)性的限制。需要?dú)饣?，不受試樣揮發(fā)性的限制。從分離原理、儀器構(gòu)造及應(yīng)用范圍上簡要比較氣相色譜及液從分離原理、儀器構(gòu)造及應(yīng)用范圍上簡要比較氣相色譜及液相色譜的異同點(diǎn)。相色譜的異同點(diǎn)。解：二者都是根據(jù)樣品組分與流動相和固定相相互作用力的差別進(jìn)行解：二者都是根據(jù)樣品組分與流動相和固定相相互作用力的差別進(jìn)行分離的。分離的。從儀器構(gòu)造上看，液相色譜需要增加高壓泵以提高流動相的流動速度，從儀器構(gòu)造上看，液相色譜需要增加高壓泵以提高流動相的流動速度，克

6、服阻力。同時(shí)液相色譜所采用的固定相種類要比氣相色譜豐富的多，克服阻力。同時(shí)液相色譜所采用的固定相種類要比氣相色譜豐富的多，分離方式也比較多樣。氣相色譜的檢測器主要采用熱導(dǎo)檢測器、氫焰分離方式也比較多樣。氣相色譜的檢測器主要采用熱導(dǎo)檢測器、氫焰檢測器和火焰光度檢測器等。而液相色譜則多使用紫外檢測器、熒光檢測器和火焰光度檢測器等。而液相色譜則多使用紫外檢測器、熒光檢測器及電化學(xué)檢測器等。但是二者均可與檢測器及電化學(xué)檢測器等。但是二者均可與MS等聯(lián)用。等聯(lián)用。二者均具分離能力高、靈敏度高、分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但二者均具分離能力高、靈敏度高、分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定

7、性差的物質(zhì)難以用氣相色譜進(jìn)行分析。而只沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)難以用氣相色譜進(jìn)行分析。而只要試樣能夠制成溶液，即可用于要試樣能夠制成溶液，即可用于HPLC分析，而不受沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性分析，而不受沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大的限制。差、相對分子量大的限制。3.23.2影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素 與與GC GC 比較比較65/165/1；基本概念及理論基礎(chǔ)與；基本概念及理論基礎(chǔ)與GCGC一致；一致；主要區(qū)別：流動相不同主要區(qū)別：流動相不同. .液相色譜中對色譜峰擴(kuò)展及色譜分離影響的因素：液相色譜中對色譜峰擴(kuò)展及色譜分離影響的因素：一、柱內(nèi)展寬一、柱內(nèi)展

8、寬1.1.渦流擴(kuò)散項(xiàng)渦流擴(kuò)散項(xiàng) ： H He e = 2d = 2dp p : :填充不均勻因子；填充不均勻因子；d dp p填充粒度直徑填充粒度直徑 高效液相色譜法的固定相是高效填料，其顆粒直高效液相色譜法的固定相是高效填料，其顆粒直徑比氣相色譜法更??；且裝柱多采用勻漿法裝柱，徑比氣相色譜法更??；且裝柱多采用勻漿法裝柱，填充很均勻，填充很均勻， 變得很小，所以變得很小，所以H He e值比較小值比較小。2.2.縱向擴(kuò)散項(xiàng)縱向擴(kuò)散項(xiàng)65/-165/-1： H Hd d = = C Cd dD Dm m/u/u； 當(dāng)試樣分子在色譜柱內(nèi)被流動相帶向前時(shí)，由當(dāng)試樣分子在色譜柱內(nèi)被流動相帶向前時(shí)，由于

9、分子本身運(yùn)動所引起的縱向擴(kuò)散同樣引致色于分子本身運(yùn)動所引起的縱向擴(kuò)散同樣引致色譜峰的擴(kuò)展。由于分子在液體中的擴(kuò)散系數(shù)譜峰的擴(kuò)展。由于分子在液體中的擴(kuò)散系數(shù)DmDm比在氣體中小比在氣體中小4-54-5個(gè)數(shù)量級，個(gè)數(shù)量級，在在LCLC中可忽略中可忽略,GC,GC中重要。中重要。 3、傳質(zhì)阻力項(xiàng) 組分分子在固定相與流動相之間傳質(zhì)緩慢引起局部不平衡，組分分子在固定相與流動相之間傳質(zhì)緩慢引起局部不平衡，從而引起峰擴(kuò)展。從而引起峰擴(kuò)展。（1 1）固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)（主要發(fā)生在液液分配色譜中）固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)（主要發(fā)生在液液分配色譜中） 當(dāng)流動相中的試樣分子擴(kuò)散進(jìn)入到涂漬在載體表面的固當(dāng)流動相中的試樣分子擴(kuò)散

10、進(jìn)入到涂漬在載體表面的固定液內(nèi)進(jìn)行質(zhì)量交換時(shí)，由于滲入固定液膜的深度不同，定液內(nèi)進(jìn)行質(zhì)量交換時(shí)，由于滲入固定液膜的深度不同，其返回到流動相中的時(shí)間也不同，因而引起峰擴(kuò)展。其返回到流動相中的時(shí)間也不同，因而引起峰擴(kuò)展。擴(kuò)散系數(shù)。試樣分子在固定液內(nèi)的固定液的液膜厚度。容量因子）有關(guān)的系數(shù)是與式中sfssfssdkDdCHD(C) 33(2 采取措施：采取措施： 1 1）液）液- -液分配色譜：薄的固定相層；吸附、排液分配色譜：薄的固定相層；吸附、排阻、離子交換色譜：小的顆粒填料。阻、離子交換色譜：小的顆粒填料。 2 2）采用擴(kuò)散系數(shù)大的液相固定相。）采用擴(kuò)散系數(shù)大的液相固定相。 3 3）減小流動相

11、的流速，改善傳質(zhì)。）減小流動相的流速，改善傳質(zhì)。（2 2）流動相傳質(zhì)阻力項(xiàng)）流動相傳質(zhì)阻力項(xiàng)( (二種形式二種形式: :在流動的流動相中的傳在流動的流動相中的傳質(zhì)和滯留的流動相中的傳質(zhì)質(zhì)和滯留的流動相中的傳質(zhì)) ) i. i.流動的流動相中的傳質(zhì)阻力項(xiàng)流動的流動相中的傳質(zhì)阻力項(xiàng)H Hm m 當(dāng)流動相流經(jīng)色譜柱內(nèi)的填充物時(shí)，靠近填充物顆粒當(dāng)流動相流經(jīng)色譜柱內(nèi)的填充物時(shí)，靠近填充物顆粒表面的流速較慢，而流路通道中心的流速則較快，表面的流速較慢，而流路通道中心的流速則較快，移動移動速度不一樣速度不一樣從而引起峰形變寬。從而引起峰形變寬。.D(C)43(2流動相線速度擴(kuò)散系數(shù)。試樣分子在流動相中的固定

12、相的粒度。容量因子）函數(shù)。是與式中udkuDdCHmmmmpmm ii.ii.滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力項(xiàng)滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力項(xiàng)H Hsmsm 由于固定相的多孔性能使流動相滯留在其微孔內(nèi)，微孔內(nèi)由于固定相的多孔性能使流動相滯留在其微孔內(nèi)，微孔內(nèi)的流動相稱為滯留區(qū)流動相（靜止?fàn)顟B(tài)，不流動）。當(dāng)流動的流動相稱為滯留區(qū)流動相（靜止?fàn)顟B(tài)，不流動）。當(dāng)流動相中的試樣分子與固定相進(jìn)行質(zhì)量交換時(shí)，必須先從流動相相中的試樣分子與固定相進(jìn)行質(zhì)量交換時(shí)，必須先從流動相擴(kuò)散進(jìn)入到滯留區(qū)。如果固定相中微孔既小又深，則滯留就擴(kuò)散進(jìn)入到滯留區(qū)。如果固定相中微孔既小又深，則滯留就越嚴(yán)重，傳質(zhì)就越慢，對峰擴(kuò)展影響也越大。越

13、嚴(yán)重，傳質(zhì)就越慢，對峰擴(kuò)展影響也越大。.D,C)43(2流動相線速度擴(kuò)散系數(shù)。試樣分子在流動相中的固定相的粒度。分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。相所占據(jù)部分的它與顆粒微孔中被流動是一常數(shù)式中uduDdCHmmsmmpmssm 由于柱內(nèi)色譜峰擴(kuò)展所引起的塔板高度的變化可歸由于柱內(nèi)色譜峰擴(kuò)展所引起的塔板高度的變化可歸納為：納為： H=A+B/H=A+B/u+Cuu+Cu 由于由于B/uB/u這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)，影響柱效的主要因這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)，影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力項(xiàng)素是傳質(zhì)阻力項(xiàng)，高效液相色譜的方程可寫成：，高效液相色譜的方程可寫成： H=H=A+CuA+Cu)63()(2:222uDdCDdCDd

14、CudCdHsfsmpmsmpmmdp板高度的總變化色譜峰擴(kuò)展所引起的塔1. 1. 提高柱內(nèi)填料裝填的均勻性和減小粒度。提高柱內(nèi)填料裝填的均勻性和減小粒度。 （選粒徑小的、分布均勻的薄殼型擔(dān)體（選粒徑小的、分布均勻的薄殼型擔(dān)體dp10m,5mdp10m,5m目前應(yīng)用最廣泛，提高裝柱技術(shù)，濕目前應(yīng)用最廣泛，提高裝柱技術(shù)，濕法勻漿法裝柱）法勻漿法裝柱）2. 2. 選粘度小、低流速的流動相（甲醇，約選粘度小、低流速的流動相（甲醇，約1ml/min1ml/min） 3. 3. 適當(dāng)提高柱溫以降低流動相粘度。適當(dāng)提高柱溫以降低流動相粘度。4 4、采用最佳流速。、采用最佳流速。5 5、減小柱外展寬。、減小

15、柱外展寬。其中，減小粒度是提高柱效能的最有效的方法。其中，減小粒度是提高柱效能的最有效的方法。HPLCHPLC與與GCGC的的H-uH-u曲線見曲線見圖圖3-13-1：（1 1）兩者曲線形狀相）兩者曲線形狀相似，都有一個(gè)似，都有一個(gè)H H最小值；最小值；（2 2）HPLCHPLC的的H H最小值比最小值比GCGC的最小值小一個(gè)數(shù)量的最小值小一個(gè)數(shù)量級以上，柱效更高；級以上，柱效更高；（3 3） HPLCHPLC的最佳流速的最佳流速u u比比GCGC的最佳流速的最佳流速u u也小也小一個(gè)數(shù)量級以上。一個(gè)數(shù)量級以上。二、柱外展寬：指色譜柱外各種因素引起的峰擴(kuò)二、柱外展寬：指色譜柱外各種因素引起的峰

16、擴(kuò)展展. . a. a.柱前展寬：主要由進(jìn)樣所引起；柱前展寬：主要由進(jìn)樣所引起； 進(jìn)樣方式：將試樣注入色譜柱的頂端濾塞上或進(jìn)樣方式：將試樣注入色譜柱的頂端濾塞上或注入進(jìn)樣器的液流中。注入進(jìn)樣器的液流中。 由于進(jìn)樣器的死體積以及進(jìn)樣時(shí)的液流擾動引由于進(jìn)樣器的死體積以及進(jìn)樣時(shí)的液流擾動引起色譜峰不對稱和展寬。起色譜峰不對稱和展寬。 解決：試樣注入柱頂端中心點(diǎn)或填料中心解決：試樣注入柱頂端中心點(diǎn)或填料中心12mm處。處。 b.b.柱后展寬：主要由接管、檢測器流通池體積柱后展寬：主要由接管、檢測器流通池體積所引起所引起. . 解決：連接管的體積、檢測器的死體積應(yīng)盡可解決：連接管的體積、檢測器的死體積應(yīng)

17、盡可能小能小. . Instrumental Analytical 儀器儀器 液相色譜中影響色譜峰展寬的因素有哪些液相色譜中影響色譜峰展寬的因素有哪些? 與氣相色譜相比較與氣相色譜相比較, 有哪些主要不同之處有哪些主要不同之處?解解:液相色譜中引起色譜峰擴(kuò)展的主要因素為液相色譜中引起色譜峰擴(kuò)展的主要因素為渦流擴(kuò)散、流動的流動相傳質(zhì)、滯留的流動相渦流擴(kuò)散、流動的流動相傳質(zhì)、滯留的流動相傳質(zhì)以及柱外效應(yīng)。傳質(zhì)以及柱外效應(yīng)。在氣相色譜中徑向擴(kuò)散往往比較顯著，而液相在氣相色譜中徑向擴(kuò)散往往比較顯著，而液相色譜中徑向擴(kuò)散的影響較弱，往往可以忽略。色譜中徑向擴(kuò)散的影響較弱，往往可以忽略。另外，在液相色譜中

18、還存在比較顯著的滯留流另外，在液相色譜中還存在比較顯著的滯留流動相傳質(zhì)及柱外效應(yīng)。動相傳質(zhì)及柱外效應(yīng)。 1、在液相色譜中，提高色譜柱柱效的最有效途徑是（ ）。 A 減小填料粒度 B 適當(dāng)升高柱溫 C 降低流動相的流速 D 增大流動相的流速 2、高效液相色譜中，可以忽略不計(jì)的影響色譜峰擴(kuò)展的因素是（ ）。 A 渦流擴(kuò)散項(xiàng) B 縱向擴(kuò)散項(xiàng) C 傳質(zhì)阻力項(xiàng) D 柱外展寬 3、在液相色譜中，縱向擴(kuò)散項(xiàng)HdB/u較小，通?？梢院雎圆挥?jì)。（ ） 4、要提高液相色譜分離的效率，必須提高柱內(nèi)填料填裝的均勻性和_以加快傳質(zhì)速率，其中_是提高柱效的最有效途徑。練習(xí)練習(xí)3.3高效液相色譜的主要類型及其分離原理高效液

19、相色譜的主要類型及其分離原理類型類型：液：液-液色譜；液液色譜；液-固色譜；離子交換色譜；離子對色譜；固色譜；離子交換色譜；離子對色譜；離子色譜；空間排阻色譜離子色譜；空間排阻色譜一一.液液-液分配色譜法及化合鍵合相色譜液分配色譜法及化合鍵合相色譜 1.特點(diǎn)特點(diǎn)：a.流動相和固定相都是液體流動相和固定相都是液體 b.兩相應(yīng)互不相溶，有明顯的分界面兩相應(yīng)互不相溶，有明顯的分界面 2.分離機(jī)制：試樣組分溶于流動相后分離機(jī)制：試樣組分溶于流動相后,在固定相和流動相之在固定相和流動相之間的相對間的相對溶解度存在差異溶解度存在差異，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。 分離的順序分離的順序決定

20、于分配系數(shù)的大小，分配系數(shù)大的組分決定于分配系數(shù)的大小，分配系數(shù)大的組分保留值大，而且保留值大，而且流動相的種類對分配系數(shù)有較大的影響流動相的種類對分配系數(shù)有較大的影響. 3.解決固定液流失問題方法：解決固定液流失問題方法：1）一般為了避免固定液的流失，對于親水性的固）一般為了避免固定液的流失，對于親水性的固定液常采用疏水性的流動相，而疏水性的固定定液常采用疏水性的流動相，而疏水性的固定相則采用親水性的流動相，從而使固定液不至相則采用親水性的流動相，從而使固定液不至于由于溶解于流動相而帶走流失，即所謂的正于由于溶解于流動相而帶走流失，即所謂的正反色譜法。反色譜法。 問題問題：何謂正相色譜及反相

21、色譜？在應(yīng)用上有何謂正相色譜及反相色譜？在應(yīng)用上有什么特點(diǎn)？什么特點(diǎn)？ 答：在色譜法中，流動相的極性小于固定液的極答：在色譜法中，流動相的極性小于固定液的極性，稱為正相色譜；在色譜法中，流動相的極性，稱為正相色譜；在色譜法中，流動相的極性大于固定液的極性，稱為反相色譜。在應(yīng)用性大于固定液的極性，稱為反相色譜。在應(yīng)用上，正相色譜主要用于分離極性物質(zhì)；反相色上，正相色譜主要用于分離極性物質(zhì)；反相色譜主要用于分離弱極性或非極性物質(zhì)。譜主要用于分離弱極性或非極性物質(zhì)。2）在色譜分離過程中由于固定液在流動相中仍有微量溶）在色譜分離過程中由于固定液在流動相中仍有微量溶解，以及流動相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊，

22、固定液也會解，以及流動相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊，固定液也會不斷流失而導(dǎo)致保留行為的變化，柱效和分離選擇性變不斷流失而導(dǎo)致保留行為的變化，柱效和分離選擇性變壞等不良后果。為了更好地解決固定相從載體上流失的壞等不良后果。為了更好地解決固定相從載體上流失的問題，采用化學(xué)鍵合固定相。問題，采用化學(xué)鍵合固定相。 問題問題：何謂化學(xué)鍵合固定相？它有什么突出的優(yōu)點(diǎn)？：何謂化學(xué)鍵合固定相？它有什么突出的優(yōu)點(diǎn)？ 答：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的有機(jī)官能團(tuán)答：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的有機(jī)官能團(tuán)共價(jià)共價(jià)鍵合在載鍵合在載體表面體表面的流離羥基上的流離羥基上形成的固定相稱為化學(xué)鍵合固定相形成的固定相稱為化學(xué)鍵合固定相。 優(yōu)點(diǎn)：

23、固定相表面沒有液坑優(yōu)點(diǎn)：固定相表面沒有液坑,比一般液體固定相傳質(zhì)快的比一般液體固定相傳質(zhì)快的多；無固定相流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性及壽命；可多；無固定相流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性及壽命；可以鍵合不同的官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性，可應(yīng)用與以鍵合不同的官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性，可應(yīng)用與多種色譜類型及樣品的分析；有利于梯度洗提，也有利多種色譜類型及樣品的分析；有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的收集。于配用靈敏的檢測器和餾分的收集。 目前反相鍵合相色譜法，已成為高效液相色譜中應(yīng)用最目前反相鍵合相色譜法，已成為高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的一個(gè)分支，液廣泛的一個(gè)分支，液-液分配色譜極少采用。

24、液分配色譜極少采用?；瘜W(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相 根據(jù)在硅膠表面的化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相根據(jù)在硅膠表面的化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相可分為：硅氧碳鍵型（可分為：硅氧碳鍵型（Si-O-C)；硅氧硅碳鍵；硅氧硅碳鍵型（型（Si-O-Si-C);硅碳鍵型（硅碳鍵型（Si-C)；硅氮鍵；硅氮鍵型（型（Si-N)。 硅烷化反應(yīng)：硅烷化反應(yīng)：二二.液液-固色譜法（或液固色譜法（或液-固吸附色譜法）固吸附色譜法）1.特點(diǎn)特點(diǎn)：流動相為液體，固定相為吸附劑。：流動相為液體，固定相為吸附劑。2.分離機(jī)制：根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離。分離機(jī)制：根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離。（溶質(zhì)分子（溶質(zhì)分子X與溶劑分子

25、與溶劑分子S對吸附劑表面競爭吸附）對吸附劑表面競爭吸附）3.結(jié)論結(jié)論69/-5： 如果溶劑分子吸附性更強(qiáng)，則被吸附的溶質(zhì)分子將相應(yīng)減小。顯然，分配系數(shù)大的組分，顯然，分配系數(shù)大的組分，吸附劑對它的吸附力強(qiáng)，保留值就大吸附劑對它的吸附力強(qiáng)，保留值就大.4.作用作用：a.適用分離相對分子質(zhì)量中等油性試樣。適用分離相對分子質(zhì)量中等油性試樣。 b.對具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較對具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高的選擇性。高的選擇性。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：由于非線性等溫吸附常引起峰的拖尾現(xiàn)象：由于非線性等溫吸附常引起峰的拖尾現(xiàn)象. 三、離子對色譜法三、離子對色譜法 1.特點(diǎn)特點(diǎn)：對各種強(qiáng)極性的有機(jī)酸或有

26、機(jī)堿的分離，分離效能高，：對各種強(qiáng)極性的有機(jī)酸或有機(jī)堿的分離，分離效能高，分析速度快，操作簡便分析速度快，操作簡便. 2.分離機(jī)制分離機(jī)制（P71）：將一種或多種與溶質(zhì)電荷相反的離子）：將一種或多種與溶質(zhì)電荷相反的離子（稱為對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶（稱為對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為，采用液保留行為，采用液-液分配原理進(jìn)行分離。液分配原理進(jìn)行分離。 3.分離過程分離過程：流動相中待分離有機(jī)離子與固定相或流動相中帶：流動相中待分離有機(jī)離子與固定相或

27、流動相中帶相反電荷的對離子結(jié)合，形成離子對化合物，然后在兩相間相反電荷的對離子結(jié)合，形成離子對化合物，然后在兩相間進(jìn)行分配進(jìn)行分配. X+水相水相 (被測離子被測離子)+ Y水相水相(對離子對離子) X+Y有機(jī)有機(jī)相相（疏水）（疏水）4.4.分類分類 正相離子對色譜法：極性固定相正相離子對色譜法：極性固定相-非極性流動相。非極性流動相。 反相離子對色譜法：非極性的疏水固定相，含有反相離子對色譜法：非極性的疏水固定相，含有對離子對離子Y的甲醇水（或乙腈水）溶液作為的甲醇水（或乙腈水）溶液作為極性流動相極性流動相.試樣離子試樣離子X進(jìn)入柱內(nèi)以后，與對離子進(jìn)入柱內(nèi)以后，與對離子Y生成疏生成疏水性離子

28、對水性離子對XY，后者在疏水性固定相表面分，后者在疏水性固定相表面分配或吸附。配或吸附。5.應(yīng)用應(yīng)用：解決了以往難分離混合物的分離問題：解決了以往難分離混合物的分離問題,諸如諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣試樣.另外，還可借助離子對的生成給試樣引入此另外，還可借助離子對的生成給試樣引入此外吸收或發(fā)熒光的基團(tuán)，以提高檢測靈敏度。外吸收或發(fā)熒光的基團(tuán)，以提高檢測靈敏度。四四.離子交換色譜法離子交換色譜法 1.分離機(jī)制分離機(jī)制70/2；離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中；離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交

29、換，依據(jù)這些離子對具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子對交換劑具有不同的親和力而將它們分離。交換劑具有不同的親和力而將它們分離。 2.適用范圍適用范圍70/3；凡能在溶劑中電離的物質(zhì)一般均可用該法；凡能在溶劑中電離的物質(zhì)一般均可用該法進(jìn)行分離。進(jìn)行分離。離子交換樹脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離離子交換樹脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)： )83()73(N3NM443樹脂）（樹脂）陰離子交換：樹脂）（樹脂）（陽離子交換：NRXClNRClXSOMaSOa3.結(jié)論結(jié)論：親合力高的，在柱

30、中保留值就愈大，分配：親合力高的，在柱中保留值就愈大，分配系數(shù)也愈大，表示溶質(zhì)的離子與離子交換劑的相系數(shù)也愈大，表示溶質(zhì)的離子與離子交換劑的相互作用愈強(qiáng)?；プ饔糜鷱?qiáng)。 4.應(yīng)用應(yīng)用：a.分離離子或可離解成離子的化合物。分離離子或可離解成離子的化合物。 b.已成功地分離氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等已成功地分離氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等.五、離子色譜法五、離子色譜法這是這是20世紀(jì)世紀(jì)70年代中期發(fā)展年代中期發(fā)展起來的一項(xiàng)新的液相色譜法，起來的一項(xiàng)新的液相色譜法，很快發(fā)展成為水溶液中陰離子很快發(fā)展成為水溶液中陰離子分析的最佳方法。分析的最佳方法。 1.固定相固定相:離子交換樹脂離子交換樹脂 流動相流動相:電

31、解質(zhì)溶液電解質(zhì)溶液 檢測器檢測器:電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器 主配件：抑制柱（抑制流動相主配件：抑制柱（抑制流動相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子的干擾）中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子的干擾） 2. 流程圖：流程圖：fig3-2例：例：陰離子交換柱（分離柱）：陰離子交換柱（分離柱）：ROH + Na+Br-(待測待測) RBr- + Na+OH-（交換）（交換）R RBr-Br- + + Na+OHNa+OH ( (洗洗脫劑脫劑) ) R ROH-+ Na+ Br-OH-+ Na+ Br-（洗（洗脫脫）抑制柱（消除本底電導(dǎo)影響），則發(fā)生下列反應(yīng)：抑制柱（消除本底電導(dǎo)影響），則發(fā)生下列反應(yīng)：RH + Na+OH-(流動相流動相

32、) RNa+ + H2O RH + Na+Br-(流動相流動相) RNa+ + H+Br-可見，不僅大量堿轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測離子轉(zhuǎn)化為具有可見，不僅大量堿轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的酸，大大提高檢測靈敏度。更大淌度的酸，大大提高檢測靈敏度。3.分離機(jī)制分離機(jī)制 a.雙柱型：化學(xué)抑制型離子色譜法。雙柱型：化學(xué)抑制型離子色譜法。 b.單柱型：非抑制型單柱型：非抑制型. 問題問題：何謂化學(xué)抑制型離子交換色譜及非抑制型：何謂化學(xué)抑制型離子交換色譜及非抑制型離子色譜？試述它們的基本原理。離子色譜？試述它們的基本原理。4.應(yīng)用應(yīng)用： 離子色譜法是目前唯一快速、靈敏和準(zhǔn)確的多離

33、子色譜法是目前唯一快速、靈敏和準(zhǔn)確的多組分分析的方法因而得到廣泛重視和迅速發(fā)展。組分分析的方法因而得到廣泛重視和迅速發(fā)展。從無機(jī)和有機(jī)陰離子到金屬陽離子，從有機(jī)陽從無機(jī)和有機(jī)陰離子到金屬陽離子，從有機(jī)陽離子到糖類、氨基酸等均可用該法分析離子到糖類、氨基酸等均可用該法分析.六、空間排阻色譜法六、空間排阻色譜法 1.固定相：凝膠固定相：凝膠 2.機(jī)制機(jī)制73/-9：類似于分子篩作用，分離只與凝：類似于分子篩作用，分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流體力學(xué)體積和分子膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流體力學(xué)體積和分子大小有關(guān)大小有關(guān). 排阻法是建立在分子大小的基礎(chǔ)上的。組分排阻法是建立在分子大小的基礎(chǔ)上的。組分中太大

34、的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，先中太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，先出峰；組分中太小的分子可以進(jìn)入所有膠體出峰；組分中太小的分子可以進(jìn)入所有膠體微孔中，最后出峰。微孔中，最后出峰。 洗脫次序?qū)⑷Q于相對分子質(zhì)量的大小，相洗脫次序?qū)⑷Q于相對分子質(zhì)量的大小，相對分子質(zhì)量大的先洗脫，相對分子質(zhì)量小的對分子質(zhì)量大的先洗脫，相對分子質(zhì)量小的后洗脫。后洗脫。 分子的形狀也對保留有重要的作用。分子的形狀也對保留有重要的作用。3.分離示意圖，分離示意圖，fig3-3 a.排斥極限排斥極限A點(diǎn)點(diǎn)74/2;3: b.全滲透極限全滲透極限B點(diǎn)點(diǎn)74/2;6: 相對分子質(zhì)量介于上述相對分子質(zhì)量介于上述 兩個(gè)極限之

35、間的化合物，兩個(gè)極限之間的化合物， 將按相對分子質(zhì)量降低的將按相對分子質(zhì)量降低的 次序被洗脫而可以分離次序被洗脫而可以分離. 4.特點(diǎn)特點(diǎn)75/2;3:1）試樣色譜峰全部在溶劑的保留時(shí)）試樣色譜峰全部在溶劑的保留時(shí)間前出峰。間前出峰。2）用于分離相對分子質(zhì)量大的化合）用于分離相對分子質(zhì)量大的化合物（約為物（約為2000以上）；以上）；3）只能分離相對分子質(zhì)）只能分離相對分子質(zhì)量差別在量差別在10%以上的分子。以上的分子。液相色譜有幾種類型液相色譜有幾種類型?它們的保留機(jī)理是什么它們的保留機(jī)理是什么? 在這些類型的在這些類型的應(yīng)用中應(yīng)用中,最適宜分離的物質(zhì)是什么最適宜分離的物質(zhì)是什么?解解:液相

36、色譜有以下幾種類型液相色譜有以下幾種類型:液液-液分配色譜液分配色譜; 液液-固吸附色譜固吸附色譜; 化學(xué)鍵合色譜化學(xué)鍵合色譜;離子交換色譜離子交換色譜; 離子對色譜離子對色譜; 空間排阻色譜等空間排阻色譜等.液液-固吸附色譜是通過組分在兩相間的多次吸附與解吸平衡實(shí)固吸附色譜是通過組分在兩相間的多次吸附與解吸平衡實(shí)現(xiàn)分離的現(xiàn)分離的.最適宜分離的物質(zhì)為中等相對分子質(zhì)量的油溶性試最適宜分離的物質(zhì)為中等相對分子質(zhì)量的油溶性試樣，凡是能夠用薄層色譜分離的物質(zhì)均可用此法分離。樣，凡是能夠用薄層色譜分離的物質(zhì)均可用此法分離。其中其中;液液-液分配色譜的保留機(jī)理是通過組分在固定相和流動相液分配色譜的保留機(jī)理

37、是通過組分在固定相和流動相間的多次分配進(jìn)行分離的?？梢苑蛛x各種無機(jī)、有機(jī)化合物。間的多次分配進(jìn)行分離的?？梢苑蛛x各種無機(jī)、有機(jī)化合物。化學(xué)鍵合色譜中由于鍵合基團(tuán)不能全部覆蓋具有吸附能力的載化學(xué)鍵合色譜中由于鍵合基團(tuán)不能全部覆蓋具有吸附能力的載體體,所以同時(shí)遵循吸附和分配的機(jī)理所以同時(shí)遵循吸附和分配的機(jī)理,最適宜分離的物質(zhì)為與液最適宜分離的物質(zhì)為與液-液色譜相同。液色譜相同。離子交換色譜和離子色譜是通過組分與固定相間親合力差別而離子交換色譜和離子色譜是通過組分與固定相間親合力差別而實(shí)現(xiàn)分離的實(shí)現(xiàn)分離的.各種離子及在溶液中能夠離解的物質(zhì)均可實(shí)現(xiàn)分各種離子及在溶液中能夠離解的物質(zhì)均可實(shí)現(xiàn)分離，包括無

38、機(jī)化合物、有機(jī)物及生物分子，如氨基酸、核酸及離，包括無機(jī)化合物、有機(jī)物及生物分子，如氨基酸、核酸及蛋白質(zhì)等。蛋白質(zhì)等。在離子對色譜色譜中在離子對色譜色譜中,樣品組分進(jìn)入色譜柱后樣品組分進(jìn)入色譜柱后,組分的離子與對離組分的離子與對離子相互作用生成中性化合物子相互作用生成中性化合物,從而被固定相分配或吸附進(jìn)而實(shí)現(xiàn)從而被固定相分配或吸附進(jìn)而實(shí)現(xiàn)分離的分離的.各種有機(jī)酸堿特別是核酸、核苷、生物堿等的分離是離各種有機(jī)酸堿特別是核酸、核苷、生物堿等的分離是離子對色譜的特點(diǎn)。子對色譜的特點(diǎn)?？臻g排阻色譜是利用凝膠固定相的孔徑與被分離組分分子間的相空間排阻色譜是利用凝膠固定相的孔徑與被分離組分分子間的相對大小

39、關(guān)系對大小關(guān)系,而分離、分析的方法。最適宜分離的物質(zhì)是：而分離、分析的方法。最適宜分離的物質(zhì)是：用于用于分離相對分子質(zhì)量大的化合物（約為分離相對分子質(zhì)量大的化合物（約為20002000以上）；只能分以上）；只能分離相對分子質(zhì)量差別在離相對分子質(zhì)量差別在10%10%以上的分子。以上的分子。另外尚有手性色譜、膠束色譜、環(huán)糊精色譜及親合色譜等機(jī)理。另外尚有手性色譜、膠束色譜、環(huán)糊精色譜及親合色譜等機(jī)理。3.4 液相色譜法固定相液相色譜法固定相 色譜柱是色譜法的心臟，固定相及裝柱技術(shù)是關(guān)鍵色譜柱是色譜法的心臟，固定相及裝柱技術(shù)是關(guān)鍵.一、液一、液-液色譜法、鍵合相色譜法及離子對色譜法固定相液色譜法、鍵

40、合相色譜法及離子對色譜法固定相1.全多孔型擔(dān)體：直徑小于全多孔型擔(dān)體：直徑小于10m,由由nm級的硅膠微粒堆聚而級的硅膠微粒堆聚而成為成為5m直徑的全多孔型擔(dān)體。顆粒小，柱效高。直徑的全多孔型擔(dān)體。顆粒小，柱效高。2.表層多孔型擔(dān)體：直徑為表層多孔型擔(dān)體：直徑為3040m的實(shí)心核的實(shí)心核(玻璃微珠玻璃微珠)，表層上附有一層厚度約為表層上附有一層厚度約為12 m的多孔硅膠，填柱容易，的多孔硅膠，填柱容易，重現(xiàn)性好，但試樣容量低。目前重現(xiàn)性好，但試樣容量低。目前510m直徑是使用最廣直徑是使用最廣泛的高效填料。泛的高效填料。3.化學(xué)鍵合固定相（化學(xué)鍵合固定相（P76及及P69） 定義：用化學(xué)反應(yīng)的

41、方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)定義：用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體表面體表面. 化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相 根據(jù)在硅膠表面的化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相根據(jù)在硅膠表面的化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相可分為：硅氧碳鍵型（可分為：硅氧碳鍵型（Si-O-C)；硅氧硅碳鍵；硅氧硅碳鍵型（型（Si-O-Si-C);硅碳鍵型（硅碳鍵型（Si-C)；硅氮鍵；硅氮鍵型（型（Si-N)。 硅烷化反應(yīng)：硅烷化反應(yīng)：化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)： （1）表面沒有液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多；）表面沒有液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多； （2）無固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命；）無

42、固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命； （3）可以鍵合不同的官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性，）可以鍵合不同的官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性，應(yīng)用于多種色譜類型及樣品的分析；應(yīng)用于多種色譜類型及樣品的分析； （4）有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器和）有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的收集。餾分的收集。分離機(jī)制分離機(jī)制77/2：既不是全部吸附過程，亦不是典型的液：既不是全部吸附過程，亦不是典型的液-液分配過程，而是雙重機(jī)制兼而有之，只是按鍵合量液分配過程，而是雙重機(jī)制兼而有之，只是按鍵合量的多少而各有側(cè)重的多少而各有側(cè)重.二、液二、液-固吸附色譜法固定相固吸附色譜法固定相 目前較常

43、用目前較常用5-10m的硅膠微粒（全多孔型）的硅膠微粒（全多孔型）.三、離子交換色譜法固定相三、離子交換色譜法固定相 1.薄膜型離子交換樹脂，以薄殼玻珠為擔(dān)體，表面涂薄膜型離子交換樹脂，以薄殼玻珠為擔(dān)體，表面涂1%離子離子交換樹脂交換樹脂. 2.離子交換鍵合固定相：用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合在離子交換鍵合固定相：用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合在惰性擔(dān)體表面。惰性擔(dān)體表面。 a.鍵合薄殼型：擔(dān)體，薄殼玻珠；鍵合薄殼型：擔(dān)體，薄殼玻珠； b.鍵合微粒擔(dān)體型：擔(dān)體，微粒硅膠鍵合微粒擔(dān)體型：擔(dān)體，微粒硅膠.四、排阻色譜法固定相四、排阻色譜法固定相 a.軟質(zhì)凝膠：葡萄糖凝膠；瓊脂糖凝膠；軟質(zhì)凝膠：葡萄糖

44、凝膠；瓊脂糖凝膠；(水流動相水流動相,常壓常壓) b.半硬質(zhì)凝膠：交聯(lián)聚苯乙烯凝膠；半硬質(zhì)凝膠：交聯(lián)聚苯乙烯凝膠；(有機(jī)溶劑，較高壓有機(jī)溶劑，較高壓) c.硬質(zhì)凝膠：多孔硅膠；多孔玻珠；硬質(zhì)凝膠：多孔硅膠；多孔玻珠；(高速高速)3.5 液相色譜法流動相液相色譜法流動相1.重要性：重要性：GC載氣僅三四種，要提高柱效選載氣僅三四種，要提高柱效選擇性，主要是改變固定相的性質(zhì)；擇性，主要是改變固定相的性質(zhì)； LC則不同，當(dāng)固定相選定時(shí)，流動相的種則不同，當(dāng)固定相選定時(shí)，流動相的種類，配比能顯著地影響分離效果，因此類，配比能顯著地影響分離效果，因此流流動相的選擇很重要。動相的選擇很重要。2.選擇流動相

45、應(yīng)注意的因素選擇流動相應(yīng)注意的因素79/2：5點(diǎn)點(diǎn)， 選擇流動相的注意因素：選擇流動相的注意因素：（1）流動相的純度：一般是采用分析純試劑，必）流動相的純度：一般是采用分析純試劑，必要時(shí)需進(jìn)一步純化，以除去干擾的雜質(zhì)。要時(shí)需進(jìn)一步純化，以除去干擾的雜質(zhì)。（2）應(yīng)避免使用會引起柱效損失或保留值特性變）應(yīng)避免使用會引起柱效損失或保留值特性變化的溶劑。（固定相不能吸附溶劑或與流動相互化的溶劑。（固定相不能吸附溶劑或與流動相互溶。）溶。）（3）對試樣要有適宜的溶解度，否則會在柱頭易）對試樣要有適宜的溶解度，否則會在柱頭易產(chǎn)生沉淀。產(chǎn)生沉淀。（4）溶劑的粘度小些為好，否則會降低試樣組分）溶劑的粘度小些為

46、好，否則會降低試樣組分的擴(kuò)散系數(shù)，造成傳質(zhì)速率緩慢，柱效下降。的擴(kuò)散系數(shù)，造成傳質(zhì)速率緩慢，柱效下降。（5）應(yīng)柱檢測器相匹配（溶劑不能被相應(yīng)的檢）應(yīng)柱檢測器相匹配（溶劑不能被相應(yīng)的檢測器檢測出來）測器檢測出來）3.溶劑的選擇溶劑的選擇79/-3： a. 依據(jù)依據(jù)：溶劑的極性是重要依據(jù)。：溶劑的極性是重要依據(jù)。 b.溶劑極性順序，水最大，煤油最小。溶劑極性順序，水最大，煤油最小。 c.采用多元組合溶劑系統(tǒng)作為流動相（底采用多元組合溶劑系統(tǒng)作為流動相（底液和洗脫液）（底劑決定基本的色譜分離液和洗脫液）（底劑決定基本的色譜分離情況；洗脫劑則調(diào)節(jié)試樣組分的滯留并對情況；洗脫劑則調(diào)節(jié)試樣組分的滯留并對幾

47、個(gè)具有選擇性的分離作用）幾個(gè)具有選擇性的分離作用） d.根據(jù)不同的方法選擇合適的底液和洗脫根據(jù)不同的方法選擇合適的底液和洗脫液液 選用溶劑的依據(jù)：溶劑的極性。選用溶劑的依據(jù)：溶劑的極性。 正相色譜：底劑（弱極性）洗脫劑（極性較強(qiáng)）正相色譜：底劑（弱極性）洗脫劑（極性較強(qiáng)） 反相色譜：水（主體）有機(jī)溶劑調(diào)節(jié)劑。反相色譜：水（主體）有機(jī)溶劑調(diào)節(jié)劑。 離子交換色譜：組分保留值通過流動相的離子強(qiáng)離子交換色譜：組分保留值通過流動相的離子強(qiáng)度（鹽的濃度）和度（鹽的濃度）和pH來控制。增加鹽的濃度，來控制。增加鹽的濃度，保留值降低；陽離子交換柱流動相保留值降低；陽離子交換柱流動相pH增加，保增加，保留值增加

48、，陰離子交換柱相反。留值增加，陰離子交換柱相反。 排阻色譜：所用的溶劑必須與凝膠本身非常相似，排阻色譜：所用的溶劑必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠并防止吸附作用。這樣才能潤濕凝膠并防止吸附作用。3-6 高效液相色譜儀高效液相色譜儀 high performance liquid chromatograph液相色譜儀（液相色譜儀（2）液相色譜儀（液相色譜儀（3）液相色譜儀（液相色譜儀（4）一、概述一、概述80/1：高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、：高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀梯度洗提裝置、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、恒溫

49、器、記錄儀等主要部件。等主要部件。 二、結(jié)構(gòu)示意圖，二、結(jié)構(gòu)示意圖，fig3-4.三、部件介紹三、部件介紹 1.高壓泵（壓力高壓泵（壓力150 350105 Pa）要求要求：a.流量要穩(wěn)定；流量要穩(wěn)定；80/-1b.壓力平穩(wěn)無脈動；壓力平穩(wěn)無脈動；81/2.c.對流速要有一定的可調(diào)范圍對流速要有一定的可調(diào)范圍.81/4.動畫 類型：類型： a .往復(fù)式柱塞泵往復(fù)式柱塞泵是目前廣泛使用的是目前廣泛使用的恒流泵恒流泵. 機(jī)理機(jī)理特點(diǎn)特點(diǎn)81/-2;6: 1)不受整個(gè)色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，不受整個(gè)色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供連續(xù)供給恒定體積的流動相給恒定體積的流動相；

50、 2）可方便地通過改變柱塞沖程的大小或往復(fù)的頻率來調(diào)節(jié)流）可方便地通過改變柱塞沖程的大小或往復(fù)的頻率來調(diào)節(jié)流量；量； 3）由于死體積小（約）由于死體積?。s0.1mL），更換溶劑方便，很適用于梯），更換溶劑方便，很適用于梯度洗提度洗提. 不足不足： 1）輸出有脈沖波動，會干擾檢測器正常工作；）輸出有脈沖波動，會干擾檢測器正常工作；2）由于產(chǎn)生基）由于產(chǎn)生基線噪聲而影響檢測的靈敏度線噪聲而影響檢測的靈敏度.b.氣動放大泵氣動放大泵恒壓泵恒壓泵 原理：原理： p1SA = p2SB 其工作原理其工作原理:這是一種恒壓這是一種恒壓泵。泵。 特點(diǎn)特點(diǎn)82/-6: 1）能供給無脈沖的穩(wěn)定流）能供給無脈沖

51、的穩(wěn)定流量的輸出量的輸出. 2）液缸體積大，更換流動）液缸體積大，更換流動相不方便；相不方便； 3）不便于梯度洗提）不便于梯度洗提. 4）適合勻漿法填裝色譜柱。）適合勻漿法填裝色譜柱。2.梯度洗提（梯度洗脫、梯度淋洗）裝置梯度洗提（梯度洗脫、梯度淋洗）裝置82/ a.作用：作用：與與GC 中的程序升溫一樣中的程序升溫一樣.（P22、23） b.定義定義83/1：所謂梯度洗提，就是：所謂梯度洗提，就是載液中含有兩種以上載液中含有兩種以上不同極性的溶劑，不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改載液中溶劑的配比和

52、極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以變被分離組分的分離因素，以提高分離效果提高分離效果。應(yīng)用梯度。應(yīng)用梯度洗提還可以使分離時(shí)間縮短，分辨能力增加，還可提高洗提還可以使分離時(shí)間縮短，分辨能力增加，還可提高最小檢測量和定量分析的精度。最小檢測量和定量分析的精度。 外梯度外梯度（低壓梯度）：先混合后輸入色譜柱；（低壓梯度）：先混合后輸入色譜柱； 內(nèi)梯度內(nèi)梯度（高壓梯度）：先泵入梯度混合室再入色譜柱；（高壓梯度）：先泵入梯度混合室再入色譜柱；何謂梯度洗提？它與氣相色譜中的程序升溫有何異同之處？何謂梯度洗提？它與氣相色譜中的程序升溫有何異同之處？解：在一個(gè)分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改

53、變流動相的組成解：在一個(gè)分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動相的組成或濃度配比，稱為梯度洗提是改進(jìn)液相色譜分離的重要手或濃度配比，稱為梯度洗提是改進(jìn)液相色譜分離的重要手段段梯度洗提與氣相色譜中的程序升溫類似，但是前者連續(xù)改變梯度洗提與氣相色譜中的程序升溫類似，但是前者連續(xù)改變的是流動相的極性、的是流動相的極性、pH或離子強(qiáng)度，而后者改變的溫度或離子強(qiáng)度，而后者改變的溫度程序升溫也是改進(jìn)氣相色譜分離的重要手段程序升溫也是改進(jìn)氣相色譜分離的重要手段3.進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置 a.重要性重要性83/1：進(jìn)樣方式及試樣體積對柱效有很大進(jìn)樣方式及試樣體積對柱效有很大影響影響.要獲得良好的分離效果和重現(xiàn)性，需要將

54、要獲得良好的分離效果和重現(xiàn)性，需要將試樣試樣“濃縮濃縮”地瞬間注入色譜柱入擔(dān)體的中心成地瞬間注入色譜柱入擔(dān)體的中心成一個(gè)點(diǎn)。一個(gè)點(diǎn)。 b.進(jìn)樣方式進(jìn)樣方式 1）注射器進(jìn)樣裝置：）注射器進(jìn)樣裝置： 由于不能承受高壓，所以需用停流進(jìn)樣方法，但由于不能承受高壓，所以需用停流進(jìn)樣方法，但該方式無法取得精確的保留時(shí)間，峰形的重現(xiàn)性該方式無法取得精確的保留時(shí)間，峰形的重現(xiàn)性亦較差亦較差.2）高壓定量進(jìn)樣閥高壓定量進(jìn)樣閥通過進(jìn)樣閥（通常是六通閥）直接向壓力系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)樣而不通過進(jìn)樣閥（通常是六通閥）直接向壓力系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)樣而不必停止流動相的一種裝置（必停止流動相的一種裝置（fig3-7） a.進(jìn)樣準(zhǔn)備：進(jìn)樣準(zhǔn)備：1

55、和和6，2和和3連通，試樣由連通，試樣由5、4注入定量管；注入定量管；b.進(jìn)樣：閥芯順時(shí)針進(jìn)樣：閥芯順時(shí)針旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)600，這時(shí)，這時(shí)1和和2，3和和4，5和和6連通，試連通，試樣送入柱中樣送入柱中.特點(diǎn)：特點(diǎn)：進(jìn)樣準(zhǔn)確，重現(xiàn)進(jìn)樣準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適于定量分析性好，適于定量分析.高效液相色譜進(jìn)樣技術(shù)與氣相色譜進(jìn)樣技術(shù)有和不同之處？高效液相色譜進(jìn)樣技術(shù)與氣相色譜進(jìn)樣技術(shù)有和不同之處？解：在液相色譜中為了承受高壓，常常采用停流進(jìn)樣與高壓解：在液相色譜中為了承受高壓，常常采用停流進(jìn)樣與高壓定量進(jìn)樣閥進(jìn)樣的方式定量進(jìn)樣閥進(jìn)樣的方式4.色譜柱色譜柱 a.參數(shù)：參數(shù)：id， 4.6或或3.9 mm； L=15

56、-30cm； 填料顆粒度，填料顆粒度，5-10 m； n=5000-10000 b.發(fā)展趨勢發(fā)展趨勢 1）減小填料粒度，）減小填料粒度，3-5 m； 2）減小柱內(nèi)徑，）減小柱內(nèi)徑， 1mm； c.裝填方式裝填方式 1）干法，填料粒度大于）干法，填料粒度大于20 m； 2）濕法（勻漿法），粒度小于）濕法（勻漿法），粒度小于20 m；(生成生成勻漿，高壓裝柱）勻漿，高壓裝柱）5.檢測器檢測器 要求要求84/-1：具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、響應(yīng)快、現(xiàn)性范：具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、響應(yīng)快、現(xiàn)性范圍寬、適用范圍廣、對流動相和溫度波動不敏感、死體圍寬、適用范圍廣、對流動相和溫度波動不敏感、死體積小等特點(diǎn)積小

57、等特點(diǎn).a.紫外光度檢測器紫外光度檢測器85/11）原理，被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收，）原理，被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度關(guān)系遵守比爾定律。組分濃度與吸光度關(guān)系遵守比爾定律。2）光路圖，圖）光路圖，圖3-8；3）特點(diǎn)特點(diǎn)85/3；a.具有很高靈具有很高靈敏度；敏度； b. 對溫度和流速不敏感，對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗提可用于梯度洗提. 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：不適用于對紫外光：不適用于對紫外光不吸收的試樣不吸收的試樣.4）發(fā)展）發(fā)展85-1；光電二極管；光電二極管211/1024個(gè)個(gè)陣列檢測器陣列檢測器. 紫外檢測器的重要進(jìn)展；紫外檢測器的重要進(jìn)展；

58、光電二極管陣列檢測器：光電二極管陣列檢測器：211/1024個(gè)二極管陣列，各檢個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器b.熒光檢測器熒光檢測器86/ 1）原理：許多物質(zhì)，特別是具有對稱共軛結(jié)構(gòu)的）原理：許多物質(zhì)，特別是具有對稱共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)芳環(huán)分子受紫外光激發(fā)后，能輻射出比紫外有機(jī)芳環(huán)分子受紫外光激發(fā)后，能輻射出比紫外光波長較長的熒光，某些不發(fā)射熒光的物質(zhì)亦可光波長較長的熒光，某些不發(fā)射熒光的物質(zhì)亦可通過通過化學(xué)衍生化學(xué)衍生轉(zhuǎn)變成能發(fā)出熒光的物質(zhì)而得到檢轉(zhuǎn)變成能發(fā)出熒光的物

59、質(zhì)而得到檢測。測。當(dāng)入射光強(qiáng)度、試樣池長度不變時(shí)，稀溶液當(dāng)入射光強(qiáng)度、試樣池長度不變時(shí)，稀溶液的熒光強(qiáng)度與溶液濃度成正比。的熒光強(qiáng)度與溶液濃度成正比。 2）光路圖：圖）光路圖：圖3-11； 3）特點(diǎn)：熒光檢測器比紫外光度檢測器的靈敏度）特點(diǎn)：熒光檢測器比紫外光度檢測器的靈敏度要高要高2個(gè)數(shù)量級。但線性范圍僅個(gè)數(shù)量級。但線性范圍僅103，利用可調(diào)諧，利用可調(diào)諧的激光作光源（的激光作光源（激光誘導(dǎo)熒光激光誘導(dǎo)熒光）可使檢測靈敏度）可使檢測靈敏度和準(zhǔn)確度都得到提高。和準(zhǔn)確度都得到提高。熒光檢測器（fluorescence detector） 高靈敏度、高選擇性高靈敏度、高選擇性應(yīng)用：應(yīng)用：對多環(huán)芳烴

60、，維對多環(huán)芳烴，維生素生素B、黃曲霉素、卟、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)物等有響應(yīng) c.差示折光檢測器差示折光檢測器通用型通用型87/1）原理：借連續(xù)測定流通池中溶液折射率的方法來測）原理：借連續(xù)測定流通池中溶液折射率的方法來測定試樣濃度的檢測器。溶有試樣的流動相和純流動相定試樣濃度的檢測器。溶有試樣的流動相和純流動相之間折射率之差，表示試樣在流動相中的濃度。之間折射率之差，表示試樣在流動相中的濃度。2）類型：偏轉(zhuǎn)式；反射式）類型：偏轉(zhuǎn)式；反射式3）定量方法：偏轉(zhuǎn)式是利用測量折射角偏轉(zhuǎn)值的大小定量方法：偏轉(zhuǎn)式是利用測量折