第五章_分子發(fā)光分析法(好)

1、 螢火蟲發(fā)光螢火蟲發(fā)光第四章 分子發(fā)光分析法4.2 分子熒光與磷光光譜分析法分子熒光與磷光光譜分析法4.3 化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)發(fā)光分析法4.1 概論概論本章學(xué)習(xí)要求掌握掌握分子熒光光譜法、分子磷光光譜法和化學(xué)分子熒光光譜法、分子磷光光譜法和化學(xué)發(fā)光分析的基本原理；發(fā)光分析的基本原理；熟悉熟悉影響熒光、磷光及化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的因素；影響熒光、磷光及化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的因素；了解三種光譜儀的基本組成部件及其作用；了解三種光譜儀的基本組成部件及其作用；熟悉三種方法的基本應(yīng)用。熟悉三種方法的基本應(yīng)用。 16 16世紀(jì)人們發(fā)現(xiàn)紫外和可見光照射到某些物質(zhì)時，這世紀(jì)人們發(fā)現(xiàn)紫外和可見光照射到某些物質(zhì)時，這些物質(zhì)會發(fā)光

2、，當(dāng)光照停止時，物質(zhì)發(fā)光會停止。些物質(zhì)會發(fā)光，當(dāng)光照停止時，物質(zhì)發(fā)光會停止。18521852年年斯托克斯斯托克斯（stokes) stokes) 進(jìn)行了解釋。進(jìn)行了解釋。18671867年年GoppelsroderGoppelsroder應(yīng)用鋁應(yīng)用鋁- -桑色素絡(luò)合物的熒光對鋁進(jìn)桑色素絡(luò)合物的熒光對鋁進(jìn)行了測定。行了測定?，F(xiàn)在已是一種重要的分析方法現(xiàn)在已是一種重要的分析方法4.1 概論物質(zhì)分子吸收能量躍遷到電子激發(fā)態(tài)后，在返回物質(zhì)分子吸收能量躍遷到電子激發(fā)態(tài)后，在返回基態(tài)的過程中伴隨有光輻射，這種現(xiàn)象稱為基態(tài)的過程中伴隨有光輻射，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)分子發(fā)光光，以此建立起來的分析方法稱為，以此建

3、立起來的分析方法稱為分子發(fā)光分析法分子發(fā)光分析法。分子發(fā)光分析分子發(fā)光分析法法 光致發(fā)光分析（）光致發(fā)光分析（） 電致發(fā)光分析（）電致發(fā)光分析（） 化學(xué)發(fā)光分析（）化學(xué)發(fā)光分析（） 生物發(fā)光分析（）生物發(fā)光分析（）分子發(fā)光分析法的特點(diǎn)分子發(fā)光分析法的特點(diǎn)(1)靈敏度高: 比吸收光度高23個數(shù)量級。(2)選擇性比較高: 物質(zhì)吸光后能有發(fā)光現(xiàn)象的不多，且吸收波長和發(fā)射波長也不同，可通過調(diào)節(jié)激發(fā)波長和發(fā)射波長進(jìn)行選擇性測定。(3)試樣量小，操作簡便，工作曲線的動態(tài)線性范圍寬。 (4) 在光學(xué)分子傳感器以及在生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和環(huán)境科學(xué)等方面的應(yīng)用優(yōu)越性顯著。一、熒光和磷光的產(chǎn)生 當(dāng)一個電子被激發(fā)時，通常

4、躍遷至第一激發(fā)軌道上，也可能躍遷到能級更高的單重態(tài)上。處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式再回到基態(tài)，輻射躍遷主要包括熒光、延遲熒光或磷光的發(fā)射。4.24.2 分子分子熒光與磷光光譜分析法熒光與磷光光譜分析法一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生 具有不飽和基團(tuán)的基態(tài)分子光照后，價電子躍遷產(chǎn)生熒光和磷光 基態(tài)分子 價電子躍遷到激發(fā)態(tài)光照激發(fā)光照激發(fā)去激發(fā)光去激發(fā)光 * * n 、n n去激發(fā)光去激發(fā)光 * * n分子能級與躍遷分子能級與躍遷基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射(是量子化的)；躍遷一次到位；第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二

5、、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 ；激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式(見圖8-1)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)化振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)移l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)化振動弛豫2.電子激發(fā)態(tài)的多重度 電子激發(fā)態(tài)的多重度：電子激發(fā)態(tài)的多重度：M M=2=2S S+1+1： 當(dāng)當(dāng)S S0 0時，即時，即M=2SM=2S1 11 1，稱為，稱為單重態(tài)單重態(tài) 當(dāng)當(dāng)S S1 1時，即時，即M=2SM=2S1 13 3，稱為，稱為叁重態(tài)叁重態(tài) 大多數(shù)基態(tài)分子處于單重態(tài)，表示為大多數(shù)基態(tài)分子處于單重態(tài)，表示為S S0 0

6、（基態(tài)單重態(tài)）（基態(tài)單重態(tài)）S0T1 為禁阻躍遷；必須通過其他途徑(系間竄越)進(jìn)入，進(jìn)入的幾率??； 根據(jù)洪特規(guī)則，平行自旋比成對自旋穩(wěn)定；而三根據(jù)洪特規(guī)則，平行自旋比成對自旋穩(wěn)定；而三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低，所以平均壽命長。重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低，所以平均壽命長。注：注：1 1、單重態(tài)有抗磁性；叁重態(tài)有順磁性。、單重態(tài)有抗磁性；叁重態(tài)有順磁性。 2 2、多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，分子的電子基態(tài)、多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，分子的電子基態(tài)多為單重態(tài)；沒有基態(tài)叁重態(tài)。多為單重態(tài)；沒有基態(tài)叁重態(tài)。 3 3、從、從S S0 0到到T T1 1的躍遷是禁阻的。的躍遷是禁阻的。 4 4、E (SE (S1

7、1)E (T)E (T1 1) )。3.激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑 電子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時失去能量方式：電子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時失去能量方式：傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間竄越振動弛豫非輻射躍遷第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)各振動能級。第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)各振動能級。 振動施豫振動施豫(VR): (VR): 同一電子能級同一電子能級中，電子由高振動能級轉(zhuǎn)移至低中，電子由高振動能級轉(zhuǎn)移至低振動能級而將多余的能量以熱的形式發(fā)出，振動施豫時間為振動能級而將多余的能量以熱的形式發(fā)出，振動施豫時間為1010- -1212s s。 內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移(ic) (ic) ：

8、當(dāng)：當(dāng)兩個電子能級兩個電子能級非?？拷灾缕湔駝幽芗売蟹浅？拷灾缕湔駝幽芗売兄丿B重疊時，常發(fā)生有高能級以無輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級。時，常發(fā)生有高能級以無輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級。 外轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移：激發(fā)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)：激發(fā)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移而去活的過程稱外轉(zhuǎn)移。移而去活的過程稱外轉(zhuǎn)移。使熒光或磷光強(qiáng)度減弱或消失的過程（使熒光或磷光強(qiáng)度減弱或消失的過程（熄滅或淬滅熄滅或淬滅）。）。系間竄越系間竄越躍遷躍遷(isc) (isc) ：指：指不同多重態(tài)不同多重態(tài)間的無輻射躍遷。改變電間的無輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷。子自旋，禁阻躍遷。 非輻射

9、能量傳遞過程非輻射能量傳遞過程S2S0S1T1l2l1振動弛豫（振動弛豫（VR）：）：同一電子能級同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由內(nèi)以熱能量交換形式由高振高振動能級至低相鄰振動動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間1010 -12-12-10-10-14-14s s。特點(diǎn)特點(diǎn)：無輻射；速率快：無輻射；速率快（10-1410-12 s內(nèi)完成）內(nèi)完成）內(nèi)轉(zhuǎn)移（內(nèi)轉(zhuǎn)移（ic） ：相同多重態(tài)相同多重態(tài)的的兩個電子能級兩個電子能級之間（如之間（如S2 S1）的非輻射躍遷）的非輻射躍遷 。S2S0S1T1l2l1內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)的特點(diǎn)（1）無輻射；）無輻射；（

10、2）速率取決于兩個能級之間的能量差，相鄰單重激）速率取決于兩個能級之間的能量差，相鄰單重激發(fā)態(tài)之間能級接近，振動能級常常發(fā)生重疊，內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)態(tài)之間能級接近，振動能級常常發(fā)生重疊，內(nèi)轉(zhuǎn)移很快；很快；（3）分子無論被激發(fā)到哪一個電子激發(fā)態(tài)，在）分子無論被激發(fā)到哪一個電子激發(fā)態(tài)，在10-1310-11 s內(nèi)經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)移和振動弛豫都會躍遷到最低的電子激內(nèi)經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)移和振動弛豫都會躍遷到最低的電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級上；發(fā)態(tài)的最低振動能級上；（4）So到到S1的能級差較大，內(nèi)轉(zhuǎn)移的速率相對較小，的能級差較大，內(nèi)轉(zhuǎn)移的速率相對較小，故故S1的壽命較長。的壽命較長。磷光發(fā)射磷光發(fā)射Phosphorescencel3S

11、2系間竄躍系間竄躍S0S1T1l2l1Intersystem Crossing體系間竄躍（體系間竄躍（ isc ）：不同多重態(tài)不同多重態(tài), ,有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷（射躍遷（ S S1 1TT1 1躍遷）躍遷） 。熒光發(fā)射熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)（多為基態(tài)（多為 S S1 1 S S0 0躍遷躍遷），），發(fā)射波長為發(fā)射波長為 l l 2 2的熒光的熒光 1010-8-810 10 -10-10 s s 。由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長

12、；l l 2 2 l l 2 2 l l 1 1 ；磷光發(fā)射磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)基態(tài)（T T1 1 S S0 0躍遷躍遷）；）； 電子由電子由S S0 0進(jìn)入進(jìn)入T T1 1的可能過程：（的可能過程：（ S S0 0 T T1 1禁阻躍遷）禁阻躍遷） S S0 0 激發(fā)激發(fā)振動弛豫振動弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移系間跨越系間跨越振動弛豫振動弛豫 T T1 1 發(fā)光速度很慢：發(fā)光速度很慢： 1010-4-410s 10s 。 光照停止后，可持續(xù)一段時間光照停止后，可持續(xù)一段時間輻射能量傳遞過程S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光

13、光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)化振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)移l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)化振動弛豫4、熒光、磷光的壽命和量子產(chǎn)率（發(fā)光參數(shù)）熒光壽命（f f）：熒光分子處于S1激發(fā)態(tài)的平均壽命。f f1/(k1/(kf fK)K)（ 10-810 -10 s ） 磷光壽命磷光壽命（p p ）：磷光分子處于T1激發(fā)態(tài)的平均壽命。P P1/(k1/(kP PK) K) （ 10-410s ）強(qiáng)度的衰變強(qiáng)度的衰變： lnIlnI0 0-lnI-lnIt t = t/= t/作出lnIt t關(guān)系曲線，由所得直線的斜率可計(jì)算得到熒光（或磷光）的壽命值。 熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率（f）：熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的

14、熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值。f fk kf f/(k/(kf fKKi i) )磷光的量子產(chǎn)率磷光的量子產(chǎn)率（p）: jPPSTPkkkK Kf f 為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，K Ki i為非輻射躍遷的速率常數(shù)之和。為非輻射躍遷的速率常數(shù)之和。 一般來說：一般來說：K Kf f主要取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)K Ki i主要取決于化學(xué)環(huán)境。熒光效率在主要取決于化學(xué)環(huán)境。熒光效率在0.1-1.00.1-1.0之間之間二、熒光、磷光與分子的關(guān)系 許多物質(zhì)能夠吸收紫外和可見光，但只有一部分物質(zhì)能發(fā)熒光或磷光很大程度上決定于分子結(jié)構(gòu)。強(qiáng)熒光性物

15、質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)特征：P.211212(1)共軛效應(yīng)共軛效應(yīng)：具有大的共軛雙鍵(鍵）體系；(2)剛性平面結(jié)構(gòu)剛性平面結(jié)構(gòu)：具有剛性的平面構(gòu)型可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用；(3)取代基效應(yīng)取代基效應(yīng)：環(huán)上的取代基是給電子取代基團(tuán)；(4)躍遷類型躍遷類型：其最低的電子激發(fā)單重態(tài)為（，）型。（1）共軛雙鍵體系）共軛雙鍵體系 分子中必須含有共軛雙鍵；分子中必須含有共軛雙鍵；共軛體系越大共軛體系越大， 電子電子的離域性越強(qiáng)，越易被激發(fā)而生熒光（熒光效率高）且的離域性越強(qiáng)，越易被激發(fā)而生熒光（熒光效率高）且熒光峰向長波方向移動。熒光峰向長波方向移動。芳香族化合物易產(chǎn)生熒光芳香族化合物易產(chǎn)生熒光，注，注

16、意：能夠發(fā)熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少。意：能夠發(fā)熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少。Ff: 0.29；f310nmFf: 0.46；f310nm再如：再如：Ff: 0.28Ff: 0.68(CHCH)3(CHCH)2共軛體系增加，熒光效率增大！共軛體系增加，熒光效率增大?。?）熒光物質(zhì)的剛性和共平面性增加）熒光物質(zhì)的剛性和共平面性增加，可使分子與溶，可使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減?。磩┗蚱渌苜|(zhì)分子的相互作用減?。赐廪D(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移能量損失能量損失減?。?，有利于熒光發(fā)射。減?。?，有利于熒光發(fā)射。例例1：Ff: 0.20Ff: 1.0Fluorene（芴）例例2：8羥基喹啉（弱熒光），當(dāng)

17、與羥基喹啉（弱熒光），當(dāng)與Mg2+絡(luò)合后，為絡(luò)合后，為強(qiáng)熒光物質(zhì)，可用剛性結(jié)構(gòu)的影響解釋。強(qiáng)熒光物質(zhì)，可用剛性結(jié)構(gòu)的影響解釋。例例3 ：紅色熒光紅色熒光滂鉻滂鉻BBR，無熒光，無熒光N=NOHOHSO3NaN=NSO3NaAlOOH2OOH2空間取代基效應(yīng)空間取代基效應(yīng)O3SN(CH3)2N(CH3)2SO3F Ff0.75F Ff0.03扭轉(zhuǎn)離開了平面構(gòu)型，影響了扭轉(zhuǎn)離開了平面構(gòu)型，影響了p- 共軛作用共軛作用立體異構(gòu)現(xiàn)象立體異構(gòu)現(xiàn)象無熒光無熒光強(qiáng)熒光強(qiáng)熒光CHCHCHCH（3）取代基效應(yīng)）取代基效應(yīng)（i）給電子的取代基給電子的取代基：如：如OH，NH2，NR2，OR等，等，p- 共軛，共軛

18、，使熒光增強(qiáng)使熒光增強(qiáng)。如：苯胺、苯酚。如：苯胺、苯酚苯，苯，（ii）吸電子的取代基吸電子的取代基：如：如NO2，COOH，NO等等使熒光減弱使熒光減弱。如：硝基苯為非熒光物質(zhì)。如：硝基苯為非熒光物質(zhì)。（iii）鹵素取代鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加，物質(zhì)的基隨原子序數(shù)的增加，物質(zhì)的熒光減弱，熒光減弱，而磷光增強(qiáng)而磷光增強(qiáng)（重原子效應(yīng)：重原子效應(yīng)：重原子取代促進(jìn)了熒光體中的電子自旋重原子取代促進(jìn)了熒光體中的電子自旋-軌道的偶合作用，系間竄越軌道的偶合作用，系間竄越S1T1概率大）。概率大）。三、影響分子發(fā)光的環(huán)境因素1溶劑的影響熒光體的基態(tài)與激發(fā)態(tài)的偶極矩不同，與溶劑分子的偶極之間存在的靜電相互作

19、用也不同；激發(fā)時發(fā)生躍遷，激發(fā)態(tài)的極性更大，若溶劑極性增大，熒光光譜向長波方向移動；熒光體與溶劑之間發(fā)生了特殊的化學(xué)作用（如形成氫鍵）。溶劑溶劑相對介電常數(shù)相對介電常數(shù)熒光峰熒光峰l/l/nmnm熒光效率熒光效率乙腈乙腈38.838.84104100.0640.064丙酮丙酮21.521.54054050.0550.055氯仿氯仿5.25.23983980.0410.041四氯化碳四氯化碳2.242.243903900.0020.002巰基喹啉在不同溶劑中的熒光峰和熒光效率巰基喹啉在不同溶劑中的熒光峰和熒光效率2介質(zhì)酸堿性的影響 如果熒光物質(zhì)是一種有機(jī)弱酸或弱堿，介質(zhì)的酸堿性變化將對熒光光譜的

20、形狀和強(qiáng)度產(chǎn)生影響。酸性基團(tuán)的解離作用或堿性基團(tuán)的質(zhì)子化作用，可能改變與發(fā)光過程相競爭的非輻射躍遷過程的性質(zhì)和速率，從而影響到化合物的發(fā)光特性。測定金屬離子時，改變?nèi)芤旱膒H將會影響到金屬離子與有機(jī)試劑所生成的發(fā)光絡(luò)合物的穩(wěn)定性和組成，從而影響它們的發(fā)光性質(zhì)。pH 的影響OHO-pH1有熒光pH13無熒光NH2NH3+H+pH4.8-3.4藍(lán)色熒光無熒光O-+H+SO3OHO3S-無 熒 光藍(lán) 色 熒 光pH6.47.43介質(zhì)的溫度和黏度的影響 溫度對于溶液的熒光強(qiáng)度尤其是對磷光強(qiáng)度有著顯著的影響。溫度升高，溶液的熒光和磷光強(qiáng)度下降。 介質(zhì)黏度的提高，將減小激發(fā)態(tài)分子振動和轉(zhuǎn)動的速率，從而降低

21、了與其他溶質(zhì)分子的碰撞概率，有利于提高熒光或磷光的強(qiáng)度。4有序介質(zhì)的影響 有序介質(zhì)（表面活性劑或環(huán)糊精溶液）對發(fā)光分子的發(fā)光特性有著顯著的影響。 在表面活性劑的膠束溶液中，發(fā)光分子被分散進(jìn)入膠束的內(nèi)核或欄柵部位，或者被束縛在膠束-水界面，降低了發(fā)光分子活動的自由度并起了屏蔽作用，對發(fā)光物質(zhì)起了增溶、增敏和增穩(wěn)作用，減小了非輻射衰變過程的速率，提高了發(fā)光強(qiáng)度。5、O2的存在：的存在： O2為順磁性分子，溶液中溶解氧的存在，使激為順磁性分子，溶液中溶解氧的存在，使激發(fā)單重態(tài)分子向三重態(tài)的系間竄躍速率加大，導(dǎo)致發(fā)單重態(tài)分子向三重態(tài)的系間竄躍速率加大，導(dǎo)致熒熒光效率降低光效率降低，甚至熄滅。其它順磁性

22、物質(zhì)也有這種作，甚至熄滅。其它順磁性物質(zhì)也有這種作用。用。四、熒光磷光的猝滅（P.214216）發(fā)光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用，引起發(fā)光強(qiáng)度下降或消失的現(xiàn)象稱為熒光（磷光）猝滅。 猝滅劑：與發(fā)光分子相互作用而引起發(fā)光強(qiáng)度下降的物質(zhì)。動態(tài)猝滅：猝滅過程發(fā)生于猝滅劑與發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用，以能量轉(zhuǎn)移的機(jī)制或電荷轉(zhuǎn)移的機(jī)制喪失其激發(fā)能而返回基態(tài)。靜態(tài)猝滅：猝滅過程發(fā)生于猝滅劑與發(fā)光物質(zhì)的基態(tài)分子之間的相互作用，所產(chǎn)生的絡(luò)合物在實(shí)際檢測的光譜區(qū)內(nèi)不發(fā)光。五、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線 固定待觀測的發(fā)射波長，改變激發(fā)光（入射光）波長，根據(jù)化合物發(fā)射的熒光(

23、磷光)強(qiáng)度與激發(fā)光波長的關(guān)系得激發(fā)光譜曲線 。 激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大。2.熒光發(fā)射光譜(或磷光光譜) 固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),掃描發(fā)射光波長，根據(jù)化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強(qiáng)度與發(fā)射光波長關(guān)系得到的曲線(圖中曲線II或III)。200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a. Stokes位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，是振動弛豫消耗了能量。b. 發(fā)射光

24、譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖l 2 ,l 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如l2 )。 c. 鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜成鏡像對稱關(guān)系。 鏡像規(guī)則的解釋 基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；每一個吸收能級對應(yīng)一個發(fā)射峰，構(gòu)成鏡像關(guān)系。 在有些情況下，吸收的光完全以聲子的形式釋放，則在發(fā)射峰中沒有對應(yīng)的峰，這也是完全可以的。也就是說，鏡像關(guān)系并不總是成立的 。 每一個吸收能級對應(yīng)一個發(fā)射峰，構(gòu)成鏡像關(guān)系。原則上，如果一個電子從一個能級吸收能量躍遷到另

25、一個能級，產(chǎn)生一個吸收峰，再釋放出來，形成一個發(fā)射峰，這種匹配是合理的。如果電子處于激發(fā)態(tài)時不經(jīng)馳豫(relaxation)直接反回基態(tài)，那激發(fā)峰和發(fā)射峰是完全重疊的；但事實(shí)上，處于激發(fā)態(tài)的電子往往要經(jīng)過馳豫，釋放聲子（熱運(yùn)動），然后再回到基態(tài)，因此產(chǎn)生了Stokes位移，此時產(chǎn)生的發(fā)射峰波長長于激發(fā)波長，構(gòu)成了一一對應(yīng)的鏡像關(guān)系。在有些情況下，吸收的光完全以聲子的形式釋放，則在發(fā)射峰中沒有對應(yīng)的峰，這也是完全可以的。也就是說，鏡像關(guān)系并不總是成立的。 200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜六.

26、熒光（磷光）強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系u熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 If 正比于正比于吸收的光吸收的光強(qiáng)度強(qiáng)度Ia和熒光量子效率和熒光量子效率 f ： If f Ia 由比耳定律：由比耳定律： Ia I0-It I0 (1-10- b c ) If f I0(1-10- b c ) f I0(1-e-2.3 bc ) 濃度很低時，將括號項(xiàng)近似處理后（濃度很低時，將括號項(xiàng)近似處理后（P.218）If 2.3 f I0 b c Kc （熒光定量關(guān)系式熒光定量關(guān)系式）u磷光強(qiáng)度磷光強(qiáng)度Ip: Ip=2.3 ST pI0 b c Kc （磷磷光定量關(guān)系式）光定量關(guān)系式） 隨著溶液濃度的進(jìn)一步增大，將會出現(xiàn)發(fā)光強(qiáng)度不僅

27、不隨溶液濃度線性增大、甚至出現(xiàn)隨濃度的增大而下降的濃度效應(yīng)。 發(fā)光的再吸發(fā)光的再吸：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波短端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；七、熒光、磷光分析儀器（一）熒光分析儀器（一）熒光分析儀器四部分四部分組成：激發(fā)光源、雙單色器系統(tǒng)、試樣池、檢測器。組成：激發(fā)光源、雙單色器系統(tǒng)、試樣池、檢測器。 特殊點(diǎn)特殊點(diǎn)：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。光源光源：高壓氙燈、汞燈、激光二極管、激光光源。單色器單色器：光柵和濾光片；含選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的

28、第二單色器；試樣池：試樣池：長、寬各為Icm的柱型石英液池，與流動注射分析技術(shù)聯(lián)用時則用石英微流通池。檢測器檢測器：光電倍增管、CCD檢測器 。同步掃描技術(shù)同步掃描技術(shù)可簡化光譜同步掃描技術(shù)可簡化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。合適的合適的ll可可減少光譜重疊減少光譜重疊；如：酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊，但l60nm時，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測定。（二）磷光分析儀器（二）磷光分析儀器l如果試樣只發(fā)磷光，可在熒光分光光度計(jì)上直接測定。l若試樣發(fā)熒光也發(fā)磷光，則必須在熒光分光光度計(jì)上配上“磷光鏡” 將熒光隔開后，再測定磷光的。 熒光計(jì)配上磷光測量附件，即

29、可在有熒光發(fā)射的同時測量磷光。試樣池： 在低溫磷光分析中，通常將試液裝入內(nèi)徑約 13 mm的石英細(xì)管（液池）中，然后將液地插入盛有液氮的杜瓦瓶內(nèi)（圖85）。固體表面室溫磷光分析基于測量室溫下吸附于固體表面的分析物所發(fā)射的磷光。將裁剪成合適大小的濾紙貼附在玻璃載片上，在濾紙中心的合適位置上滴加極小量的試液，適當(dāng)烘干后再滴加所需要的試劑溶液，再經(jīng)適當(dāng)烘干，然后將載片放入試樣室，使載片附有試樣的一面與入射光的方向成45o，并且濾紙上的試樣點(diǎn)必須落在入射光的照射范圍內(nèi)。八、熒光和磷光的常規(guī)測定方法（一）（一）熒光的常規(guī)測定方法（P.223224）1.1. 直接測定法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）直接測定法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法

30、）配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度。2.2. 間接測定法間接測定法熒光衍生法熒光猝滅法敏化熒光法 3.3. 多組分混合物分析多組分混合物分析通過選擇合適的激發(fā)波長或發(fā)射波長測定混合物中某種組分。采用同步熒光測定、導(dǎo)數(shù)熒光測定、時間分辨熒光測定、相分辨熒光測定等方法來達(dá)到分別測定或同時測定的目的。1.1.低溫磷光分析低溫磷光分析在低溫（液氮）條件下測量磷光。所用溶劑的要求：在液氮溫度下具有足夠的黏度并能形成明凈的剛性玻璃體，對分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光譜區(qū)內(nèi)沒有很強(qiáng)的吸收和發(fā)射，容易制備和提純。2.2.室溫磷光分析（室溫磷光分析（RTPRTP） 固體基質(zhì)表面室溫磷光分析（SSRTP） 膠束穩(wěn)定的室溫磷光分析（MSRTP） 敏化室溫磷光分析（SRTP）（二）磷（二）磷光的測定方法（P.224226）4.3化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)發(fā)光是由化學(xué)反應(yīng)提供的能量激發(fā)物質(zhì)所產(chǎn)生的光輻射。生物發(fā)光是指產(chǎn)生于生物體系中的化學(xué)發(fā)