第六章免疫標記技術(shù)

1、免疫標記技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù) 沉淀反應(yīng) 凝集反應(yīng) 補體參與的抗原抗體反應(yīng) 中和反應(yīng)沉淀反應(yīng)凝集反應(yīng)補體參與的抗原抗體反應(yīng)中和反應(yīng)經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)的不足 靈敏度 周期長 可重復(fù)性 無法定量 無法定位 特異性差關(guān)鍵問題免疫標記技術(shù)（immunolabelling technique） 用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)。免疫標記技術(shù)分類：免疫酶技術(shù)(ng)、放射免疫技術(shù)(pg)、免疫熒光技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)、發(fā)光免疫測定。特點：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位第八章 免疫標記技術(shù)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)第三

2、節(jié) 酶免疫技術(shù)第四節(jié) 其他免疫標記技術(shù)第八章 免疫標記技術(shù)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)第三節(jié) 酶免疫技術(shù)第四節(jié) 其他免疫標記技術(shù)一、放射免疫技術(shù) 二、免疫放射技術(shù) 第一節(jié)放射免疫技術(shù) 一、放射免疫技術(shù) 二、免疫放射技術(shù) 第一節(jié)放射免疫技術(shù) （一）放射免疫技術(shù)的原理 （二）放射免疫技術(shù)的基本條件 （三）放射免疫技術(shù)的基本類型一、放射免疫技術(shù)（一）放射免疫技術(shù)的原理 （二）放射免疫技術(shù)的基本條件 （三）放射免疫技術(shù)的基本類型一、放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)（radioimmunoassay，RIA）（1977年獲諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎）放射免疫技術(shù)的原理 RIA是以放射性同位素標記抗原的一種競

3、爭性免疫抑制試驗（一）放射免疫技術(shù)的原理 （二）放射免疫技術(shù)的基本條件 （三）放射免疫技術(shù)的基本類型一、放射免疫技術(shù)（二）放射免疫技術(shù)的基本條件 1抗原標準品與待測抗原 2放射性同位素 3特異性抗體 4常用的同位素標記方法5B與F的分離技術(shù)1抗原標準品與待測抗原 標準品是放免技術(shù)的定量依據(jù) 標準品：與待測樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同 替代品：與待測樣品的結(jié)構(gòu)相似，但要與抗體的親和力相近，應(yīng)列出與真標準品的換算系數(shù)。2. 放射性同位素3. 特異性抗體 放射免疫技術(shù)的抗體應(yīng)具備：特異性高、親和力高（平衡常數(shù)K值大）、效價高（即抗血清高度稀釋時仍能迅速與抗原結(jié)合，極少解離，保證檢測的靈敏度） 4. 常用的

4、同位素標記方法 氯胺T氧化標記法 乳過氧化物酶標記法 半抗原標記法5. B與F的分離技術(shù)（1）雙抗體沉淀分離法（2）化學(xué)試劑分段沉淀分離法（3）固相法（4）吸附法 結(jié)合態(tài)標記抗原B與游離態(tài)標記抗原F能否有效地分離是放射免疫技術(shù)的一個重要環(huán)節(jié)。分離劑的要求 能使B和F完全分離 不受外界因素的干擾 與游離抗原的非特異性作用盡可能小 操作簡便、分離迅速、重復(fù)性好 來源廣，經(jīng)濟，便于使用（1）雙抗體沉淀分離法 優(yōu)點： 本法操作簡便、穩(wěn)定缺點： 易受免疫反應(yīng)液中其他蛋白質(zhì)或鹽的干擾，使非特異性吸附有較大變異，且第二抗體消耗量大。 加入第二抗體使微量抗原抗體復(fù)合物的分子加大，從而使原來不能用普通離心法沉淀

5、的抗原抗體復(fù)合物易于沉淀而分離。 （2）化學(xué)試劑分段沉淀分離法利用鹽類或有機化合物使反應(yīng)液中的-球蛋白在等電點沉淀，從而達到分離的目的。如：聚乙二醇（PEG）、硫酸銨等優(yōu)點： 試劑來源廣泛、 價格便宜缺點： 影響因素多（溫度、pH值、濃度等）（3）固相法 將測定用的第一抗體（或第二抗體）牢固地結(jié)合于固相載體表面，相應(yīng)抗原（或第一抗體）經(jīng)溫育被吸附，只要將固相表面洗滌即將B和F分離。 優(yōu)點：操作簡便、快速 新的固相分離方法： 纖維固相抗體競爭法 可磁化顆粒固相抗體競爭法 試管固相法（4）吸附法 本法多用于小分子半抗原的放射免疫分析。 如：活性炭、硅鎂吸附劑、滑石粉等性質(zhì)：對蛋白質(zhì)、多肽、藥物等具

6、有非特異性 吸附的能力應(yīng)用：在其表面包被一層白蛋白或右旋糖苷等 物質(zhì)時，將會限制大分子物質(zhì)的吸附。 沉 淀 中：吸附有游離的抗原或半抗原 上清液中：抗原抗體復(fù)合物優(yōu)點：操作簡便、分離迅速缺點：專一性不強 （一）放射免疫技術(shù)的原理 （二）放射免疫技術(shù)的基本條件 （三）放射免疫技術(shù)的基本類型一、放射免疫技術(shù)（三）放射免疫技術(shù)的基本類型1液相法（1）平衡法（又稱一步法）（2）順序加樣法2固相法（1）競爭法 Ag+Ag*+Ab-（2）改良法 Ag+Ag*+Ab+AntiAb-一、放射免疫技術(shù) 二、免疫放射技術(shù) 第一節(jié)放射免疫技術(shù) （一）免疫放射技術(shù)的原理 （二）免疫放射技術(shù)的基本條件 （三）免疫放射技

7、術(shù)的基本類型二、免疫放射技術(shù)（一）免疫放射技術(shù)的原理 （二）免疫放射技術(shù)的基本條件 （三）免疫放射技術(shù)的基本類型二、免疫放射技術(shù) 1986年Miles和Hales建立免疫放射分析技術(shù)（immunoradiometric assay，IRMA） 標記抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的抗體，待測物（或標準品）和同位素標記抗體全量反應(yīng)。優(yōu)點： 靈敏度高（可提高6-10倍）、準確度高、重復(fù)性好、檢樣量少缺點： 干擾因素較多、檢測儀器貴、有放射性污染免疫放射技術(shù)（immunoradiometric assay，IRMA）（一）免疫放射技術(shù)的原理 （二）免疫放射技術(shù)的基本條件 （三）免疫放射技術(shù)的基本類

8、型二、免疫放射技術(shù)（二）免疫放射技術(shù)的基本條件 1標記抗體的制備 2固相抗原免疫吸附劑（一）免疫放射技術(shù)的原理 （二）免疫放射技術(shù)的基本條件 （三）免疫放射技術(shù)的基本類型二、免疫放射技術(shù)（三）放射免疫技術(shù)的基本類型1. 經(jīng)典IRMA法2. 雙抗體夾心法3. 二抗標記法4. 雙標記抗體法1. 經(jīng)典IRMA法2. 雙抗體夾心法標記3. 二抗標記法4. 雙標記抗體法 雙標記抗體是將兩種針對不同表位的抗體（Ab2、Ab3）標記上不同的同位素，可以用不同的檢測儀進行測定。放射分析技術(shù)方法學(xué)考核指標第八章 免疫標記技術(shù)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)第三節(jié) 酶免疫技術(shù)第四節(jié) 其他免疫標記技術(shù)一、免

9、疫熒光技術(shù)的原理二、免疫熒光技術(shù)的基本條件三、經(jīng)典熒光抗體染色法四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)第二節(jié)免疫熒光技術(shù) 一、免疫熒光技術(shù)的原理二、免疫熒光技術(shù)的基本條件三、經(jīng)典熒光抗體染色法四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)第二節(jié)免疫熒光技術(shù) Albert Hewett Coons（19121978） 20世紀40年代Coons等首先用熒光素FITC標記抗體，成功地檢測了小鼠肺臟組織內(nèi)存在的肺炎雙球菌多糖抗原，從而創(chuàng)建免疫熒光技術(shù)（ immuno-fluorescence technique ）。 一、免疫熒光技術(shù)的原理 三結(jié)合： 抗原抗體反應(yīng)的高度特異性 熒光的敏感可測性 顯微技術(shù)的高度精確性 優(yōu)點： 特異性強、敏感性高

10、、速度快，結(jié)果直觀，可以檢測和定位微量抗原 缺點： 熒光易發(fā)生淬滅，熒光染色標本保存困難、易出現(xiàn)非特異性染色問題，鏡檢結(jié)果判定客觀性不足一、免疫熒光技術(shù)的原理二、免疫熒光技術(shù)的基本條件三、經(jīng)典熒光抗體染色法四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)第二節(jié)免疫熒光技術(shù) 1. 熒光素 2. 熒光標記物的制備 3. 熒光檢測儀二、免疫熒光技術(shù)的基本條件1. 熒光素 2. 熒光標記物的制備 3. 熒光檢測儀二、免疫熒光技術(shù)的基本條件1熒光素 熒光素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染色物質(zhì)熒光素的性質(zhì) 吸收光后電子躍遷 保持固有的熒光特性 熒 光 的 波 長 總 是 大 于 激 發(fā) 光 波 長（STOKES 法則） 熒光強度小于激發(fā)光的

11、強度熒光效率=發(fā)射光量子數(shù)/吸收光量子數(shù)100%熒光強度=吸收光量子數(shù)熒光效率熒光的種類自發(fā)熒光二次熒光非特異性熒光： 自發(fā)熒光 誘發(fā)熒光 酶誘發(fā)熒光熒光素選擇條件 熒光強度高且穩(wěn)定 能輕易與蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定共價鍵 熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法應(yīng)簡便、快速 產(chǎn)生的熒光顏色應(yīng)與自發(fā)熒光對比鮮明 結(jié)合物在一般貯存條件下性能穩(wěn)定，可保存較長時間熒光素1. 熒光素 2. 熒光標記物的制備 3. 熒光檢測儀二、免疫熒光技術(shù)的基本條件熒光標記抗體的制備（1）攪拌標記法（Marshall法）（2）半透膜透析標記法（Clark法）熒光標記抗體的純化（1）去除游離熒光素（2）去除未標記和過度標記的抗體熒光標記抗體

12、的鑒定（1）抗體與熒光的活性鑒定（2）熒光素與蛋白質(zhì)的摩爾比值（F/P） 采用紫外分光比色法測定FITC（F）OD值和 蛋白質(zhì)（P）OD值以后，用以下公式計算F/P比值： F/P比值=（2.87OD495）/（OD2800.35OD495）（3）熒光抗體濃度的測定（4）熒光抗體特異性的鑒定：特異性吸收試驗， 競爭抑制試驗1. 熒光素 2. 熒光標記物的制備 3. 熒光檢測儀二、免疫熒光技術(shù)的基本條件3. 熒光檢測儀（1） 熒光顯微鏡 （2） 熒光分光光度計（1）熒光顯微鏡透射式落射式透射熒光顯微鏡原理低倍鏡較明亮，高倍鏡較暗，在油浸和調(diào)中時，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的

13、視野背景。透射式不適用于非透明的被檢物體。落射式熒光顯微鏡激發(fā)濾光板 位于聚光鏡和光源之間，可濾過由熒光燈源發(fā)射出的其他光，只允許波長為275480nm的紫外光（MG）和藍紫光（BG）通過，以激發(fā)熒光結(jié)合物發(fā)射熒光。汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G) 激發(fā)濾色鏡: 波長選擇分色鏡:反射激發(fā)光,透過熒光 吸收濾色鏡:透過熒光,阻擋雜光落射熒光顯微鏡原理對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實現(xiàn)整個視場的均勻照明。（2）熒光分光光度計 用于掃描熒光標記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強度、量子產(chǎn)率、熒光

14、壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。一、免疫熒光技術(shù)的原理二、免疫熒光技術(shù)的基本條件三、經(jīng)典熒光抗體染色法四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)第二節(jié)免疫熒光技術(shù) 1. 直接熒光抗體染色法 2. 間接熒光抗體染色法 3. 補體熒光染色法4. 特殊染色法三、經(jīng)典熒光抗體染色法1. 直接熒光抗體染色法 2. 間接熒光抗體染色法 3. 補體熒光染色法4. 特殊染色法三、經(jīng)典熒光抗體染色法1. 直接熒光抗體染色法優(yōu)點： 簡單、快速、特異性高缺點： 檢測每種抗原需制備相應(yīng)抗體、敏感性差將熒光素標記在特異性抗體上，直接檢測抗原1. 直接熒光抗體染色法 2. 間接熒光抗體染色法 3. 補體熒光

15、染色法4. 特殊染色法三、經(jīng)典熒光抗體染色法2. 間接熒光抗體染色法優(yōu)點： 敏感性高、一種二抗可檢測多種抗原抗體系統(tǒng)缺點： 干擾因素多、操作流程長將熒光素標記在第二抗體（抗抗體）上或標記在SPA上，檢測與抗原結(jié)合的特異性抗體腫瘤組織中M2型巨噬細胞1. 直接熒光抗體染色法 2. 間接熒光抗體染色法 3. 補體熒光染色法4. 特殊染色法三、經(jīng)典熒光抗體染色法3. 補體熒光染色法優(yōu)點： 可檢測所有抗原抗體系統(tǒng)，具有通用性；敏感性高缺點： 操作過程較復(fù)雜，干擾因素多，易出現(xiàn)非特異性染色，補體易失活將熒光素標記在補體的抗體上（抗C3抗體），檢測抗原抗體復(fù)合物。1. 直接熒光抗體染色法 2. 間接熒光抗

16、體染色法 3. 補體熒光染色法4. 特殊染色法三、經(jīng)典熒光抗體染色法4特殊染色法 （1 1）雙標記免疫熒光技術(shù)（2 2）雙色免疫熒光技術(shù)（3 3）反襯染色法 （1）雙標記免疫熒光技術(shù)在同一標本中，可用兩種不同顏色的熒光標記抗體進行染色，同時顯示兩種不同的細胞或同一細胞上不同的抗原。如：FITC（黃綠色熒光）標記Ab1 RB200或TRITC9（桔紅色熒光）標記Ab2細胞內(nèi)雙標記熒光染色（2）雙色免疫熒光技術(shù) 如FITC標記抗體和細胞核染色劑PI（紅色）DAPI（藍色） （3）反襯染色法 是用一種非特異染色來反襯一種免疫熒光試劑的特異性染色。如：用RB200標記BSA作為非特異性反襯標記，用FI

17、TC標記特異性抗體。一、免疫熒光技術(shù)的原理二、免疫熒光技術(shù)的基本條件三、經(jīng)典熒光抗體染色法四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)第二節(jié)免疫熒光技術(shù) 1. 流式細胞術(shù) 2. 熒光偏振免疫分析技術(shù) 3. 時間分辨熒光免疫測定四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)1. 流式細胞術(shù) 2. 熒光偏振免疫分析技術(shù) 3. 時間分辨熒光免疫測定四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)1. 流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）又稱熒光激活細胞分類器 （fluorescing activating cell sorter，F(xiàn)ACS）流式細胞儀原理物理參數(shù)分析FSCSSC細胞分類單參數(shù)數(shù)據(jù)分析細胞凋亡的檢測細胞表面標志鑒定三參數(shù)數(shù)據(jù)分析1. 流式細胞術(shù) 2

18、. 熒光偏振免疫分析技術(shù) 3. 時間分辨熒光免疫測定四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)2. 熒光偏振免疫分析技術(shù)（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA） 利用熒光素經(jīng)單一波長的偏振光照射后，吸收光能并發(fā)射出相應(yīng)的偏振熒光，其強弱程度與熒光分子的顆粒大小呈正相關(guān)。 反應(yīng)系統(tǒng)中同時加入待測藥物、一定量的熒光素標記的相應(yīng)藥物（小分子）和抗藥物抗體，使待測藥物和熒光素標記藥物與有限量的特異性抗體（大分子）進行競爭結(jié)合。熒光偏振光分析儀Transcreener UDP2 FP AssayFPIA技術(shù)特點優(yōu)點：標本可直接用于測定樣品用量少測定時間短精密度高缺點：儀器價格昂

19、貴藥品試劑盒專用性強不易普及應(yīng)用1. 流式細胞術(shù) 2. 熒光偏振免疫分析技術(shù) 3. 時間分辨熒光免疫測定四、現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)3. 時間分辨熒光免疫測定（TrFIA） 是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點（強度高、衰變時間長），用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。實驗原理類線光譜： 有利于降低本底熒光強度，提高分辨率較大的Stokes位移： 有利于排除非特異熒光的干擾，增強測量的特異性螯合物： 熒光強度高，壽命長，有利于消除樣品及環(huán)境中熒光物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響 分析速

20、度快、標記物制備較簡便、標記物有效使用期長、無放射性污染、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點第八章 免疫標記技術(shù)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)第三節(jié) 酶免疫技術(shù)第四節(jié) 其他免疫標記技術(shù)一、酶免疫技術(shù)的原理二、酶免疫技術(shù)的基本條件三、酶免疫技術(shù)的基本類型四、ELISA方法的發(fā)展第三節(jié)酶免疫技術(shù) 一、酶免疫技術(shù)的原理二、酶免疫技術(shù)的基本條件三、酶免疫技術(shù)的基本類型四、ELISA方法的發(fā)展第三節(jié)酶免疫技術(shù) 酶催化反應(yīng)原理酶催化反應(yīng)的兩種基本形式： E+S（ES） E+P E+S（ES） + D1 E + P + D2E：酶 S：酶作用的底物P：底物分解后的產(chǎn)物（有色化合物）D1：供氫體 D2：為D1的氧化型

21、（有色化合物）酶免疫技術(shù)（enzyme immunoassay，EIA）優(yōu)點：靈敏度高，特異性強，操作簡便，易掌握和推廣；試劑易制備，且穩(wěn)定保存期長；結(jié)果可肉眼觀察，也可用儀器定量檢測，且儀器價格較低廉。缺點：檢測可溶性樣品，靈敏度和重復(fù)性不及放免疫測定法；免疫組化中，易受細胞內(nèi)源性酶的干擾，直觀性比熒光免疫染色法差。一、酶免疫技術(shù)的原理二、酶免疫技術(shù)的基本條件三、酶免疫技術(shù)的基本類型四、ELISA方法的發(fā)展第三節(jié)酶免疫技術(shù) 二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標記酶2酶標記物的制備3酶底物的選擇4 . 固相載體的選擇5 . 酶標檢測儀二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標記酶2酶標記物的制備3酶底物的選擇4 .

22、 固相載體的選擇5 . 酶標檢測儀1. 標記酶 辣根過氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP）堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP）葡萄糖氧化酶 （glucooxidase，Glu）-D-半乳糖苷酶 （-D-galactosidase，-D-Gal）二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標記酶2酶標記物的制備3酶底物的選擇4 . 固相載體的選擇5 . 酶標檢測儀酶標記物的制備 免疫酶結(jié)合物： 酶標記抗原的制備酶標記抗體的制備戊二醛交聯(lián)法即將標記酶通過具有雙功能或多功能化學(xué)基團的交聯(lián)劑連接到抗原或抗體分子上。過碘酸氧化交聯(lián)法 將酶分子氧化產(chǎn)生活性基團，再與抗

23、原或抗體分子結(jié)合，使之成為與相應(yīng)靶分子具有特異性結(jié)合活性的酶標抗原或抗體。 二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標記酶2酶標記物的制備3酶底物的選擇4 . 固相載體的選擇5 . 酶標檢測儀3. 酶底物的選擇二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標記酶2酶標記物的制備3酶底物的選擇4 . 固相載體的選擇5 . 酶標檢測儀4. 固相載體的選擇 ELISA法最常用的固相載體： 要求：蛋白質(zhì)吸附性能強、吸附后不影響抗原抗體的活性、價格低廉、形狀可塑 聚苯乙烯吸附性能好、透明度好 聚氯乙烯質(zhì)軟板薄，容易剪割，價廉，吸附性能高于聚苯乙烯，但光潔度稍差、空白值也略高 硝酸纖維素膜及微孔濾膜用于快速斑點免疫結(jié)合試驗酶標板種類 高結(jié)

24、合力酶標板（表面處理）400-500ng IgG/cm2 MW10kD 中結(jié)合力酶標板（疏水鍵結(jié)合）200-300ng IgG/cm2 MW20kD 氨基化酶標板（表面正電荷氨基）100ng/cm2 小分子蛋白蛋白的包被（coating） pH9.6的碳酸鹽緩沖液 4度 過夜 1%-5% BSA blocking 低溫保存二、酶免疫技術(shù)的基本條件1標記酶2酶標記物的制備3酶底物的選擇4 . 固相載體的選擇5 . 酶標檢測儀一、酶免疫技術(shù)的原理二、酶免疫技術(shù)的基本條件三、酶免疫技術(shù)的基本類型四、ELISA方法的發(fā)展第三節(jié)酶免疫技術(shù) 三、免疫酶技術(shù)的類型酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked

25、 immunosorbent，ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）1. 直接法2. 間接法3. 夾心法4. 競爭法5. 抗酶抗體法ELISA的檢測類型1. 直接法2. 間接法3. 夾心法Additional Materials RequiredTypical Standard Curve4. 競爭法5. 抗酶抗體法ELISA實驗條件優(yōu)化 蛋白的包被：載體、蛋白濃度、溫度、時間 封阻：BSA、血清、脫脂奶粉 洗滌：生理鹽水、PBS、Tris-HCl 酶結(jié)合物的濃度：標準為OD值1.0 標本的選擇 結(jié)果判斷一、酶免疫技術(shù)的原

26、理二、酶免疫技術(shù)的基本條件三、酶免疫技術(shù)的基本類型四、ELISA方法的發(fā)展第三節(jié)酶免疫技術(shù) 1. 酶聯(lián)免疫熒光測定法 2. IgM型抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗 3. 斑點ELISA4. 酶聯(lián)免疫斑點法四、ELISAELISA方法的發(fā)展1. 酶聯(lián)免疫熒光測定法（enzyme linked fluorescence immunoassay，ELFIA） 熒光底物使ELISA的檢測極限提高了幾十倍，達到渺克（ag=10-18g）水平2. IgM型抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗3. 斑點ELISA（dot-ELISA） 采用硝酸纖維素膜（NC膜）作為固相載體，將抗原點加于膜上，干燥后以BSA-PBS封閉，然后

27、滴加待檢血清和酶標抗體，反應(yīng)后，滴加底物溶液，當膜上呈現(xiàn)肉眼可見的著色斑點即為陽性反應(yīng)，本法常作為定性檢測。4. 酶聯(lián)免疫斑點法（enzyme linked immunospot，ELISPOT）第八章 免疫標記技術(shù)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)第三節(jié) 酶免疫技術(shù)第四節(jié) 其他免疫標記技術(shù)一、生物素-親和素放大系統(tǒng)二、免疫分析技術(shù)中的通用系統(tǒng) SPA通用系統(tǒng)三、免疫金溶膠技術(shù)第四節(jié)其他免疫標記技術(shù) 一、生物素-親和素放大系統(tǒng)二、免疫分析技術(shù)中的通用系統(tǒng) SPA通用系統(tǒng)三、免疫金溶膠技術(shù)第四節(jié)其他免疫標記技術(shù) 生物素-親合素系統(tǒng)（Biotin-avidin system，BAS） 198

28、0年，Hsu首先用生物素親合素化酶進行組織化學(xué)研究 1983年，Yolken和Kendall首次用BAS與ELISA相結(jié)合檢測特異性抗原和抗體，并獲得成功 BSA與酶、同位素、熒光素等標記技術(shù)有機結(jié)合，可使各種示蹤免疫分析的靈敏度進一步提高，可用于微量蛋白分子的定量檢測。生物素（biotin，B）生物素分子式為C10H16O3N2S，分子量為244.31，pI為3.5。可從含量較高的卵黃（型）和肝組織（型）中提取，也可合成。親合素（avidin，A） A是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白 pI 1010.5 MW68,000 由4個亞單位組成Ka = 1015mol/L1個A與4個B結(jié)合又稱卵白

29、蛋白、抗生物素鏈霉親和素（streptavidin，SA） 在結(jié)構(gòu)上因不含有任何糖基，因此在測定中的非特異性遠低于親合素。 SA是由Streptomyces avidin菌分泌的一種略偏酸性蛋白質(zhì) MW 65,000 pI 6.0 SA不含任何糖基Ka = 1015mol/L1個A與4個B結(jié)合生物素-親合素標記技術(shù) 生物素的活化 生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯（BNHS）羧基與蛋白質(zhì)賴氨酸上的氨基以酰胺鍵偶聯(lián)、常用于標記抗體及中性偏堿的抗原長臂活化生物素（BCNHS）更易與抗體、酶等生物大分子結(jié)合而發(fā)揮效應(yīng)生物素酰肼（BHZ）主要用于標記偏酸性糖蛋白 生物素標記物 活化生物素可偶聯(lián)抗體、酶、蛋白

30、質(zhì)、多肽、激素、凝集素、糖類及DNA、RNA等生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用直接法間接法親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合體法一、生物素-親和素放大系統(tǒng)二、免疫分析技術(shù)中的通用系統(tǒng) SPA通用系統(tǒng)三、免疫金溶膠技術(shù)第四節(jié)其他免疫標記技術(shù) SPA的發(fā)現(xiàn) 1940年Verwey發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的某些菌株，可與人正常血清在雙相免疫擴散試驗中出現(xiàn)沉淀線1958年Jensen用離子交換樹脂分析證明，該成分是一種細菌胞壁上不含糖的蛋白質(zhì)，命名為金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A，SPA)Forsgren等證明SPA與IgG分子的Fc段結(jié)合，為假免疫反應(yīng)生產(chǎn)SPA的國際標準菌株:Cow