熒光報(bào)告基因試驗(yàn)

1、熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)一、什么是熒光素酶和雙熒光素酶?熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)是以熒光素(luciferin)為底物來檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(FireflyLuciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence,可通過熒光測(cè)定儀設(shè)備測(cè)定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光，常應(yīng)用于miRNA靶基因驗(yàn)證及啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控等方向研究。利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)

2、染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶。螢火蟲熒光素酶是從甲蟲(Photinuspyralis)中分離得到，分子量為61kDa；海腎熒光素酶(RenillaLuciferase)則是從海腎(Renillareniformis)中分離，分子量為36kDa。(一)兩種酶的區(qū)別?1 .底物和輔因子不同：螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時(shí)存在才能發(fā)光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素(coelenterazin*和氧氣。.CQQHFir«(|ylucif

3、ecSMs*CQ?+Uight2 .發(fā)光的顏色不同：螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色，波長(zhǎng)550-570nm；而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍(lán)光，波長(zhǎng)480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。(二)為什么采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)？單報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)往往會(huì)受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，而雙報(bào)告基因則通過共轉(zhuǎn)染的對(duì)照”作為內(nèi)參為試驗(yàn)提供一基準(zhǔn)線，從而可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。一般情況下，海腎熒光素酶基因作為內(nèi)參使用，將帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；或是將兩個(gè)報(bào)告基因構(gòu)建到同一個(gè)質(zhì)粒上，分別用不同的啟

4、動(dòng)子啟動(dòng)其表達(dá)。計(jì)算結(jié)果時(shí)，將螢火蟲熒光素酶的檢測(cè)值比上海腎熒光素酶檢測(cè)值(FireflyLuciferase/RenillaLuciferase),這樣就可以減少內(nèi)在變化因素對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，相當(dāng)于做了標(biāo)準(zhǔn)化，使測(cè)試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾。(三)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)有哪些常用的載體?1 .兩種熒光素酶分別位于兩個(gè)載體上。比如研究miRNA的靶基因?qū)嶒?yàn)時(shí)，這兩種載體分別為：(1) pMIR-REPORT載體：它用來插入miRNA靶序列，評(píng)估細(xì)胞內(nèi)miRNA功能。該載體包含一個(gè)CMV啟動(dòng)子控制下的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因。在熒光素酶基因的3'UTR區(qū)域包含一個(gè)多克隆位點(diǎn)，用于插入預(yù)

5、測(cè)miRNA的結(jié)合靶序列或其他核甘酸序列。若熒光素酶活性下降，說明該段插入序列受到miRNA調(diào)節(jié)，這模仿了miRNA靶序列的作用方式。Purcncin-v；.LU£M中值pMIRREPORTLUCireraseAmptcilFin-CIWPromoder(2) pRL系列載體(以pRL-CMV為例)，pRL系列載體可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中組成型地表達(dá)海腎熒光素酶。又如，研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)時(shí)，兩種載體分別為：(1) pGL4.20載體，pGL4.20載體含Luciferase熒光素酶報(bào)告基因，無啟動(dòng)子，用于研究目的啟動(dòng)子的功能，在熒光素酶基因的上游包含一個(gè)多克隆位點(diǎn)，用于插入啟動(dòng)子序

6、列，若Luciferase熒光素酶活性上升，說明該段啟動(dòng)子受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。(2) pRL系列載體。svokai&pcilyTAjsiglSnthFPicpol/iM30?0BamHI領(lǐng)帕加a信仃61刖缶1口即用e國(guó)怕|tariwbCHQroijiHdreduction!ACg65IKpnVEcolCRlSkINrelECORV2.兩種熒光素酶位于同一個(gè)載體上。這樣偏差更小，畢竟轉(zhuǎn)染一個(gè)質(zhì)粒比轉(zhuǎn)染兩個(gè)質(zhì)粒要容易，在這方面，根據(jù)檢索到的資料顯示，現(xiàn)在的這類質(zhì)粒比較有名的是Promega公司的pmirGLO質(zhì)粒。、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)有哪些應(yīng)用?（一）驗(yàn)證microRNA同某基因mRNA靶

7、向互作。將待測(cè)mRNA的3'UTFff列插入報(bào)告基因載體，再共轉(zhuǎn)入該microRNA,如果螢光素酶活性下降，則提示為其靶序列。*U【RliKiteraextniRNAJllll.3,UTRlucifeie（二）驗(yàn)證microRNA同IncRNA靶向互作。將候選的IncRNA序列插入報(bào)告基因載體中F-Luc的3'UTRE域，檢測(cè)螢光素酶活性。（三）驗(yàn)證特定轉(zhuǎn)錄因子同其調(diào)控序列的作用。將該序列（通常為啟動(dòng)子區(qū)域）插入報(bào)告基因載體，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中共轉(zhuǎn)過表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子，可分析轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)是否提高螢光素酶活性。promotorluciferaseTranscripTionfactor

8、promotoi'hicifemse（四）啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析。將啟動(dòng)子區(qū)域序列（通常2k左右）進(jìn)行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c(diǎn)進(jìn)行突變，再分別構(gòu)建入luciferase報(bào)告載體，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。（五）啟動(dòng)子SNP分析。一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在單核甘酸多態(tài)性，可運(yùn)用螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析其相對(duì)活性。（六）可以分析信號(hào)通路是否激活。將該信號(hào)通路的下游響應(yīng)原件序列構(gòu)建入報(bào)告基因載體，在不同上游信號(hào)條件下，螢光素酶活性代表了通路的下游響應(yīng)。如將HIF1a的響應(yīng)原件hypoxia-responsiveelement（HRE）插入luciferase報(bào)告載體構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，可以用于低氧相關(guān)通路的研究。又如，

9、在GPCR研究中，將cAMPresponseelement（CRE）載入報(bào)告基因載體，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，可以用于分析GPCR的激活與抑制劑篩選。三、實(shí)驗(yàn)步驟（以驗(yàn)證GeneA為miRNA的靶基因?yàn)槔┲饕譃椋嘿|(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞一雙報(bào)告基因檢測(cè)一統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1 .需要的病毒或者質(zhì)粒：miRNA-Ctrl/miRNA-OE（miRNA的ctrl和OE可以提前包好病毒）pMIR-REPORT（不插入任何片段，作為control）pMIR-REPORT-WT（將GeneA的3'UT麗入pMIR-REPORT）pMIR-REPORT-MT（將GeneA的3'UTRS變后插入pMIR-RE

10、PORT）pMIR-REPORT-miRNApos（將miRNA的反向互補(bǔ)序列插入，作為陽(yáng)性對(duì)照）pRL-CMV（作為內(nèi)參）（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可以再設(shè)置siRNA組）2 .實(shí)驗(yàn)步驟（以24孔板為例） Day1種細(xì)胞于24孔板 Day2病毒感染（根據(jù)實(shí)驗(yàn)加入一定量的miRNA-Ctrl/miRNA-OE） Day3Report質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（以24孔板一個(gè)孔為例，實(shí)驗(yàn)時(shí)可配置成Mix逐孔加入以減少誤差）：25ulopti-MEM+300ngplasmid+10ngpRL-CMV25ulopti-MEM+0.45ullip20006h后血液（實(shí)驗(yàn)分組可參考下圖，每個(gè)組可以設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔）miRNA-Clr

11、lmiRNA-OE Day4雙報(bào)告基因檢測(cè)（1）1XcoldPBS清洗一遍，力口入80-100ullysisbuffer（buffer用量可以根據(jù)細(xì)胞量進(jìn)行調(diào)整）；（2）在搖床上冰上被動(dòng)裂解30min；（3） 4C,12000rpm離心10min；（4）吸取上清10ul于luciferase專用96孔板;（5）依次加入50ulFireflyLuciferaseBuffer（FB）或50ulRenillaLuciferaseBuffer（RB）（RB中加入腔腸素，現(xiàn)用現(xiàn)加,FB和RB可在441室再加入）；（6）酶標(biāo)儀檢測(cè)發(fā)光。四、數(shù)據(jù)分析（以miRNA調(diào)控靶基因的實(shí)驗(yàn)為例）1 .先計(jì)算出每孔的F

12、ireflyLuciferase/RenillaLuciferase的比值（F/R,第4列和第10列）；2 .求出miRNA-Ctrl三個(gè)重復(fù)孔的平均值（下圖第5列average。；3 .再以miRNA-Ctrl組的average1為標(biāo)準(zhǔn)1,用miRNA-OE組的F/R三個(gè)重復(fù)值（第10歹U）分別除以average1得到三個(gè)ratio（相當(dāng)于進(jìn)行了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化）;4 .求出ratio的平均值作為average25 .分別用average1和average2的值作柱狀圖。mlbiNA-CTnFRF/Raverape1SOFRFRmoaerage2SD2/zee036919Q_26S666。.諛CW

13、11<74502O.2547760.94477-11076101Q152083control174KW0.2351&4contrcH124737211.2J3T31117fl701科?？?1407S0130?«0fi7104079636466球口.522412060C1S10066951220765070.338173056510605523650393102w34425512WT2229sai?03B31B706珈的341552240G53H42230619202T221/045354S96224使U.旬七州0<17166J.UJ2&S1牌，3H971.

14、3000/21.362/fSb也1181g33MI8/32200o.aesoaaMTaarr3&irC.G29&271.M61108S5迎0444724簽94454110505175124D7O314035900JD2377970.240743,0044734326«090.C653650.2715150313157339631miRNAp:,13465474024589iriRNA產(chǎn)S14P6093O.O&435913695TM023BM35437103007447H317M4五、常見問題分析正是由于報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果受多種因素影響，如載體狀態(tài)、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染

15、量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率、加樣精度、檢測(cè)過程等，一旦某個(gè)細(xì)節(jié)處理不好，都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或結(jié)果的不準(zhǔn)確。（一）熒光值過高熒光值過高可通過以下方式嘗試解決:1 .減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量；2 .細(xì)胞樣品裂解后，離心取上清后可適當(dāng)稀釋后檢測(cè)。注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實(shí)的表達(dá)水平，否則會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。(二)熒光值過低若檢測(cè)到的熒光值比較低或無熒光值，可從樣品裂解效率、轉(zhuǎn)染效率、檢測(cè)過程等這幾方面進(jìn)行考慮：1.轉(zhuǎn)染效率低(1)優(yōu)化轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)條件；(2)確保轉(zhuǎn)染DNA的質(zhì)量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行鑒定；(3)選擇活性較高，處于指數(shù)分

16、裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。2 .檢測(cè)過程操作不規(guī)范(1)需加入足量底物，保證底物的飽和，否則會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)很大偏差；(2)室溫反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)各個(gè)組分(細(xì)胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等)都需要調(diào)整到室溫；(3)熒光素酶的半衰期一般約30min,加完底物后可立即檢測(cè)，盡量在30min內(nèi)完成。3 .底物氧化失效(1)底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20C保存；海腎熒光素酶底物推薦-80C保存；(2)反應(yīng)工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。(三)復(fù)孔重復(fù)性差報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)受多種因素影響，因此同批次樣品檢測(cè)值也可能出現(xiàn)浮動(dòng)。除了引入另一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)參照避免實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾之外，一般還需設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。想要得到一個(gè)準(zhǔn)確

17、的結(jié)果，應(yīng)盡可能減小復(fù)孔之間的差異性：1 .細(xì)胞裂解后建議離心取上清，保證樣本的均一性；2 .保證加樣的準(zhǔn)確性，移液器需定期校準(zhǔn)，確保移液精準(zhǔn)；注：熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的檢測(cè)結(jié)果非常靈敏，復(fù)孔之間的數(shù)值有一定差異是正常的，一般認(rèn)為在同一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異是可以接受的。六、熒光素酶報(bào)告基因還有哪些其他用法？熒光素酶基因還可以用來標(biāo)記細(xì)胞和活體動(dòng)物，步驟如下： 將熒光素酶基因插到預(yù)期分析的細(xì)胞染色體內(nèi)； 通過單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí)，熒光素酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)； 將標(biāo)記好的細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)后，當(dāng)外源(腹腔或靜脈注射)給予其底物熒光素(l

18、uciferin),即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP,氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。熒光素酶報(bào)告基因標(biāo)記活體動(dòng)物的應(yīng)用領(lǐng)域：(1)月中瘤學(xué)：熒光素酶報(bào)告基因活體成像能夠讓研究人員能夠直接快速的測(cè)量各種癌癥模型中月中瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及對(duì)藥物的反應(yīng)。非常適合于月中瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的定量分析，避免宰殺老鼠。(2)干細(xì)胞與免疫學(xué)：螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因做示蹤標(biāo)記干細(xì)胞，將目的基因與螢火蟲熒光素酶基因融合融合表達(dá)，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)行干細(xì)胞移植，可以用活體生物發(fā)光成像技術(shù)示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、分化及遷徙的過程?？梢酝ㄟ^標(biāo)記免疫細(xì)胞，觀察免疫細(xì)胞對(duì)月中瘤細(xì)胞等的識(shí)別和殺死功能，評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞的免疫特異性、增殖、遷移及功能等。(3)蛋白質(zhì)相互作用：可利用動(dòng)物體內(nèi)生物發(fā)光成像技術(shù)研究活體動(dòng)物體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用。其原理是將分開時(shí)都不單獨(dú)發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個(gè)不同的