代謝調(diào)控 第一章 緒論

1、2022-5-11代謝控制Regulation of Metabolism主講教師：郭金玲主講教師：郭金玲2022-5-11第一章第一章 緒論緒論2、代謝控制發(fā)酵出現(xiàn)的必然性5、課程內(nèi)容和學(xué)習(xí)方法3、代謝工程的基本思想4、正向代謝工程面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展趨勢(shì)2022-5-11資源資源危機(jī)危機(jī)能源危機(jī)能源危機(jī)環(huán)境危機(jī)環(huán)境危機(jī) 尋求化石資源的替代已經(jīng)成為社會(huì)經(jīng)濟(jì)尋求化石資源的替代已經(jīng)成為社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)可持續(xù)發(fā)展發(fā)展的重大戰(zhàn)略的重大戰(zhàn)略2022-5-11可持續(xù)發(fā)展的兩個(gè)方面：可持續(xù)發(fā)展的兩個(gè)方面：以可再生生物資源取代化石資源，以可再生生物以可再生生物資源取代化石資源，以可再生生物能源取代不可再生化石能源

2、能源取代不可再生化石能源;以清潔高效的生物加工方式取代低效污染的傳統(tǒng)以清潔高效的生物加工方式取代低效污染的傳統(tǒng)物質(zhì)加工方式，以精細(xì)產(chǎn)品取代大量粗加工產(chǎn)品物質(zhì)加工方式，以精細(xì)產(chǎn)品取代大量粗加工產(chǎn)品;背景背景2022-5-11Renewable raw materialsBiofuelsBiomaterialsChemicalsFoodstaffsetc.微生物細(xì)胞工廠微生物細(xì)胞工廠環(huán)境、資源、能源環(huán)境、資源、能源2022-5-11 2001年大型跨國(guó)公司美國(guó)年大型跨國(guó)公司美國(guó)Cargill-Dow公司利用玉米為原料生產(chǎn)公司利用玉米為原料生產(chǎn)聚乳酸（聚乳酸（14萬噸萬噸/年），是工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)興

3、起的標(biāo)志。年），是工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)興起的標(biāo)志。淀粉糖化乳酸聚乳酸發(fā)酵生物材料2022-5-11 以淀粉、再生纖維素等原料，實(shí)現(xiàn)聚酯、聚乳酸、以淀粉、再生纖維素等原料，實(shí)現(xiàn)聚酯、聚乳酸、聚氨基酸等聚氨基酸等生物可降解材料生物可降解材料的低成本生產(chǎn)，逐步減少對(duì)的低成本生產(chǎn)，逐步減少對(duì)化石資源的依賴與環(huán)境污染?；Y源的依賴與環(huán)境污染。2022-5-11 “十一五”以來我國(guó)生物產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值以年均22.9%的速度增長(zhǎng)，2011年實(shí)現(xiàn)總產(chǎn)值約2萬億元萬億元。爭(zhēng)取到2020年，把生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展成為國(guó)民經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)。 2022-5-11問題：?jiǎn)栴}： 微生物微生物既不會(huì)既不會(huì)使代謝物大量積累而造成使代謝物大量積累而

4、造成浪費(fèi)浪費(fèi)，也不會(huì)也不會(huì)因代謝物的缺失而因代謝物的缺失而供不應(yīng)求供不應(yīng)求。微生物會(huì)保微生物會(huì)保持各種代謝物濃度的相對(duì)穩(wěn)定和動(dòng)態(tài)平衡，適應(yīng)持各種代謝物濃度的相對(duì)穩(wěn)定和動(dòng)態(tài)平衡，適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化。內(nèi)外環(huán)境的變化。如何使微生物過量積累某種代謝產(chǎn)物？如何使微生物過量積累某種代謝產(chǎn)物？2022-5-112022-5-11 研究方法研究方法：先研究目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成路徑、遺傳控制及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，然后定向選育大量積累目標(biāo)產(chǎn)物的微生物。2022-5-11代謝控制發(fā)酵出現(xiàn)和發(fā)展的現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ)生物化學(xué)酶的變構(gòu)動(dòng)力學(xué)各種操縱子調(diào)控機(jī)制誘變育種原生質(zhì)體融合等重組DNA技術(shù)發(fā)酵過程控制合成途徑合成途徑+ +調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)

5、機(jī)制菌株改造技術(shù)菌株改造技術(shù)菌株發(fā)酵環(huán)境菌株發(fā)酵環(huán)境2022-5-111991年年Bailey J E 在在Science上正式提出，基本思想是：上正式提出，基本思想是： 根據(jù)已有的遺傳和生化知識(shí)，找出限速步驟，根據(jù)已有的遺傳和生化知識(shí)，找出限速步驟，進(jìn)行遺傳操作進(jìn)行遺傳操作2022-5-112022-5-112022-5-11C3 烯酰CoAC3 羥酸C3 烯酸碳水化合物碳水化合物原料原料C2 酸C2 醇C2 CoAC3 酮酸C2 醛C2 PC3 酮酸PC3酸PC4 CoAC3 酮C4 醇C6 糖PC3 醛PC6 糖PC6 糖P酸PC3 二醇C3 羥酮PC4 酸C5 酮酸C4 CoAC6 酸

6、C3 烯酰CoAC3 羥酸C3 烯酸丙烯酸丙烯酸實(shí)現(xiàn)代謝實(shí)現(xiàn)代謝途徑重構(gòu)途徑重構(gòu)丙酮丙酮丁醇丁醇2022-5-11NAD+NADHPyruvatePDCAcetaldehydeEthanolADHHKGlucoseGAP1,3-DPGG-6-PF-6-PF-1,6- BPPFKGAPDHPKAcetaldehyde110%突變株突變株親株親株提高乙醇脫氫酶活性提高乙醇脫氫酶活性加速速度限制反應(yīng)加速速度限制反應(yīng)2022-5-11改變分支代謝途徑的流向改變分支代謝途徑的流向GlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA -KGAcCoAPyr

7、uvateOAAPDH(B1, NA)PDC (B1) PT (B6) PC (Bio) B1： 硫胺素硫胺素NA： 煙酸煙酸Bio：生物素：生物素B6： 吡哆醛吡哆醛光滑球擬酵母中丙酮酸代謝途徑光滑球擬酵母中丙酮酸代謝途徑XXXX2022-5-11 Nissen等在Azotobacter vinelandii 基因雙缺失型菌株中構(gòu)建了一個(gè)產(chǎn)生NAD+的新途徑，使甘油減少40%。 3-磷酸甘油醛脫氫酶磷酸甘油醛脫氫酶（ GDP1和和GDP2基因）基因）NAD+構(gòu)建代謝旁路構(gòu)建代謝旁路2022-5-11改變能量代謝途徑改變能量代謝途徑丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度提高度提高42.9%發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵時(shí)間

8、縮短縮短23%丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度提高度提高42.9%發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵時(shí)間縮短縮短23%2022-5-11 Okumagai等從巴斯德畢赤氏酵母中分離了一個(gè)不受乙醇阻遏的醇氧化酶基因(AOX1)啟動(dòng)子表達(dá)淀粉酶基因使淀粉酶分泌量大大提高，這個(gè)工程菌可以由淀粉直接發(fā)酵乙醇，以3淀粉至少產(chǎn)生2乙醇 。延伸代謝途徑延伸代謝途徑2022-5-11 P.stipitis中分離到木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶XYL2基因,將其克隆進(jìn)S.cerevisiae。木糖還原酶木糖還原酶木糖醇脫氫酶木糖醇脫氫酶構(gòu)構(gòu)建建新新的的生生物物合合成成途途徑徑木糖還原酶木糖還原酶木糖醇脫氫酶木糖醇脫氫酶2022-5-

9、11正向代謝工程問題的提出 天然存在的各種基因或經(jīng)改造的各種新基因足于應(yīng)付代謝工程的需要，但要使代謝工程的目標(biāo)真正實(shí)使代謝工程的目標(biāo)真正實(shí)現(xiàn)卻只有很少一部分基因有效現(xiàn)卻只有很少一部分基因有效，要找到這一小部分基因無益大海撈針大海撈針。 對(duì)于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，傳統(tǒng)的代謝工程思路遇到了難題。 4、正向、正向代謝工程面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展趨勢(shì)代謝工程面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展趨勢(shì)2022-5-11 1996年Bailey J E首次提出“反向代謝工程反向代謝工程”的概念反向代謝工程的興起反向代謝工程的興起2022-5-11反向代謝工程的反向代謝工程的是：是： 對(duì)實(shí)驗(yàn)室菌株（或野生型）的突變、定向進(jìn)化對(duì)實(shí)驗(yàn)室菌株（或野生型）

10、的突變、定向進(jìn)化和定向篩選，獲得預(yù)期的表型，并確定其基因型。和定向篩選，獲得預(yù)期的表型，并確定其基因型。 選擇工業(yè)菌株并對(duì)其選擇工業(yè)菌株并對(duì)其相應(yīng)相應(yīng)基因進(jìn)行遺傳操作，基因進(jìn)行遺傳操作，以期獲得同樣的表型。以期獲得同樣的表型。2022-5-11目前為止，反向代謝工程在很多方面的應(yīng)用都獲得成功。逆代謝工程逆代謝工程避免了對(duì)復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的充分認(rèn)避免了對(duì)復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的充分認(rèn)識(shí)過程識(shí)過程，解決了許多正向代謝工程思路解決，解決了許多正向代謝工程思路解決不了的問題。不了的問題。 2022-5-11 Khosla和Bailey：專性需氧透明顫菌在限氧條件下合成了大量的透明顫菌血紅蛋白VHb 合成血紅蛋白可能

11、是透明顫菌在氧限制條件下提高代謝和生長(zhǎng)的一種“基因策略基因策略” 表達(dá)VHb的大腸桿菌在限氧條件下可達(dá)到較高生長(zhǎng)密度 將該血紅蛋白的基因克隆到一系列需氧工業(yè)微生 物中。實(shí)例實(shí)例2022-5-11 在人們并不知道不知道VHb產(chǎn)生途徑及影響機(jī)制產(chǎn)生途徑及影響機(jī)制的前提下，上述方法成功解決了限氧的瓶頸。正是這些成功的實(shí)例推動(dòng)了對(duì)VHb的重新認(rèn)識(shí)。 2022-5-11 逆代謝工程的關(guān)鍵在于確定希望表型的遺傳基礎(chǔ)。 微生物和細(xì)胞培養(yǎng)積累的關(guān)于遺傳刺激表型反應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，以及標(biāo)準(zhǔn)微生物系統(tǒng)遺傳、生理和生物化學(xué)特性方面的研究成果，加上高度自動(dòng)化的現(xiàn)代分析工具，將使基因和表型之間相關(guān)性基因和表型之間相關(guān)性分析分

12、析變得越來越容易。代謝工程的前景代謝工程的前景 2022-5-11 蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程的興起，使代謝工程僅僅利用天然存在的基因克隆這一局限將被打破，從而解除原有細(xì)胞代謝的很多限制因素。 這種逆向思維已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了逆代謝工程創(chuàng)立之初的設(shè)想，并將成為代謝工程研究的主流方向。2022-5-115. 課程主要內(nèi)容 1、緒論、緒論 2、代謝控制發(fā)酵的基本思想、代謝控制發(fā)酵的基本思想 3、代謝控制發(fā)酵育種的基本技術(shù)、代謝控制發(fā)酵育種的基本技術(shù) 4、糖代謝與控制、糖代謝與控制 5、脂類代謝與控制、脂類代謝與控制 6、氨基酸代謝與控制、氨基酸代謝與控制 7、核酸類物質(zhì)的代謝控制與發(fā)酵、核酸類物質(zhì)的代謝控制與發(fā)

13、酵 8、抗生素發(fā)酵的代謝與控制、抗生素發(fā)酵的代謝與控制2022-5-111、抓住課程內(nèi)容的基本邏輯結(jié)構(gòu)2、認(rèn)真理解和體會(huì)理解和體會(huì)其中的原理和技術(shù)3、結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步鞏固所學(xué)的理論4、課后要及時(shí)復(fù)習(xí)和總結(jié)及時(shí)復(fù)習(xí)和總結(jié)所學(xué)習(xí)的知識(shí)學(xué)習(xí)方法2022-5-11參考書目使用教材：使用教材： 張克旭等編著張克旭等編著代謝控制發(fā)酵代謝控制發(fā)酵 中國(guó)輕工業(yè)出版社，中國(guó)輕工業(yè)出版社，2004年年參考書目：參考書目：l 陶文沂編著陶文沂編著工業(yè)微生物生理與遺傳育種學(xué)工業(yè)微生物生理與遺傳育種學(xué) 中國(guó)輕工業(yè)出版社，中國(guó)輕工業(yè)出版社，1997年年l 王鏡巖等編著王鏡巖等編著生物化學(xué)生物化學(xué)（第三版）（第三版） 高等教育出版社，高等教育出版社，2003年年l 儲(chǔ)炬等編著儲(chǔ)炬等編著現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵調(diào)控學(xué)現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵調(diào)控學(xué) 化學(xué)工業(yè)出版社，化學(xué)工業(yè)出版社，2002年年2022-5-11考核方