番茄黃花卷葉病的基因檢測

1、番茄黃花卷葉病的基因檢測番茄黃花卷葉病的基因檢測 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 番茄黃花卷葉病概況番茄黃花卷葉病概況 抗病檢測抗病檢測主要內(nèi)容與技術(shù)方案主要內(nèi)容與技術(shù)方案 原理（原理（Ty-1 、Ty-2、Ty-3 ）（每組選）（每組選1個(gè)）個(gè)） 數(shù)據(jù)分析實(shí)例數(shù)據(jù)分析實(shí)例 涉及實(shí)驗(yàn)技術(shù)涉及實(shí)驗(yàn)技術(shù)表型 DNA RNA Protein Phenotype實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù) 目標(biāo)基因的標(biāo)記篩選是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇（目標(biāo)基因的標(biāo)記篩選是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇（MASMAS）育）育種的基礎(chǔ)。種的基礎(chǔ)。 用于用于MASMAS育種的分子標(biāo)記須具備三個(gè)

2、條件：育種的分子標(biāo)記須具備三個(gè)條件： 分子標(biāo)記與目標(biāo)基因緊密連鎖，一般要求兩者間的遺傳距分子標(biāo)記與目標(biāo)基因緊密連鎖，一般要求兩者間的遺傳距離小于離小于5cM,5cM,最好最好1cM1cM或更??；或更小； 標(biāo)記實(shí)用性強(qiáng)，重復(fù)性好，而且能夠經(jīng)濟(jì)簡便地檢測大量標(biāo)記實(shí)用性強(qiáng)，重復(fù)性好，而且能夠經(jīng)濟(jì)簡便地檢測大量個(gè)體；個(gè)體； 不同遺傳背景選擇有效。不同遺傳背景選擇有效。MAS與與表型表型選擇的比較選擇的比較 可以進(jìn)行早期選擇，加快育種進(jìn)度；可以進(jìn)行早期選擇，加快育種進(jìn)度； 區(qū)別較細(xì)微的差異，如多位點(diǎn)控制的數(shù)量性區(qū)別較細(xì)微的差異，如多位點(diǎn)控制的數(shù)量性狀，直接選擇困難；狀，直接選擇困難； 可同時(shí)對幾個(gè)性狀進(jìn)

3、行選擇。可同時(shí)對幾個(gè)性狀進(jìn)行選擇。MAS存在的問題存在的問題 標(biāo)記信息的丟失。標(biāo)記并不是基因，由于重組使標(biāo)記與基標(biāo)記信息的丟失。標(biāo)記并不是基因，由于重組使標(biāo)記與基因分離，導(dǎo)致選擇偏離方向。因分離，導(dǎo)致選擇偏離方向。 QTL定位和效應(yīng)估算的不精確性。定位和效應(yīng)估算的不精確性。 上位性的存在。由于上位性的存在。由于QTL與環(huán)境、與環(huán)境、QTL與與QTL間存在互作，間存在互作，導(dǎo)致不同環(huán)境、不同背景下選擇效率發(fā)生偏差。導(dǎo)致不同環(huán)境、不同背景下選擇效率發(fā)生偏差。 QTL篩選與育種過程相脫離。篩選與育種過程相脫離。 發(fā)展飽和的遺傳圖譜，尋找與目的基因緊密連鎖的兩側(cè)標(biāo)記，提高基發(fā)展飽和的遺傳圖譜，尋找與目

4、的基因緊密連鎖的兩側(cè)標(biāo)記，提高基因型與表現(xiàn)型的一致性。因型與表現(xiàn)型的一致性。從全基因組水平上對從全基因組水平上對QTL展開研究，包括展開研究，包括QTL的數(shù)目、位置、效應(yīng)以及的數(shù)目、位置、效應(yīng)以及QTL與與QTL間、間、QTL與環(huán)境的互作、與環(huán)境的互作、QTL的一因多效性等，充分發(fā)掘的一因多效性等，充分發(fā)掘QTL的信息，選擇最佳組合進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇。的信息，選擇最佳組合進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇。QTL篩選與品種選育過程相結(jié)合，如選擇商業(yè)品種作為作圖親本之一，篩選與品種選育過程相結(jié)合，如選擇商業(yè)品種作為作圖親本之一，或利用回交高代或利用回交高代QTL方法將篩選與育種同步進(jìn)行。方法將篩選與育種同步進(jìn)行。將

5、常規(guī)選擇與標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合，針對不同性狀的特點(diǎn)，研究高效將常規(guī)選擇與標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合，針對不同性狀的特點(diǎn)，研究高效的選擇方法。的選擇方法。各研究機(jī)構(gòu)的良好合作也是各研究機(jī)構(gòu)的良好合作也是MAS成功應(yīng)用成功應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。的重要基礎(chǔ)。MAS成功應(yīng)用？成功應(yīng)用？Zamir D, et al. Mapping and introgression of a tomato yellow leaf curl virus tolerance gene, Ty-1J. Theoretical and Applied Genetics, 1994, 88: 141-146圖圖 利用利用21號染色體上號染色體

6、上STR位點(diǎn)位點(diǎn)D21S1446進(jìn)行唐氏綜合征基因診斷進(jìn)行唐氏綜合征基因診斷注注:1、2 為患者為患者1：1：1 帶型；帶型；3、4 為正常人；為正常人；5、6 為對照組；為對照組；7 為為2：1 帶型。帶型。（鄔晉芳等，利用21 號染色體上STR 位點(diǎn)進(jìn)行唐氏綜合征基因診斷的研究，中國兒童保健雜志，2009，17 （5）：520-522）概況概況 番茄（番茄（Lycopersicon esculentumLycopersicon esculentum Mill. Mill.），），茄科茄屬草本植物，為常見蔬菜之一，廣茄科茄屬草本植物，為常見蔬菜之一，廣泛分布于中國各地，成為主要的溫室產(chǎn)品泛分

7、布于中國各地，成為主要的溫室產(chǎn)品之一。之一。 茄果類蔬菜作為重要的蔬菜品類，果實(shí)品茄果類蔬菜作為重要的蔬菜品類，果實(shí)品質(zhì)一直是果菜類育種研究的重點(diǎn)。質(zhì)一直是果菜類育種研究的重點(diǎn)。 黃化曲葉病黃化曲葉病 番茄黃化曲葉病番茄黃化曲葉病毒病發(fā)病初期主要表現(xiàn)為生長遲緩，節(jié)間縮短，植株矮化，上部葉片變小、變厚、有褶皺、向上卷曲、變形、葉片邊緣至葉脈區(qū)域黃化，下部葉片癥狀不明顯。發(fā)病后期表現(xiàn)為坐果困難，果實(shí)僵化不膨大，或膨大速度極慢，果實(shí)變小，成熟期果實(shí)不能正常轉(zhuǎn)色、失去商品價(jià)值，導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收黃化曲葉病毒病黃化曲葉病毒病 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前我國番茄據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前我國番茄黃化曲葉病毒病的年發(fā)生面積超過

8、黃化曲葉病毒病的年發(fā)生面積超過6.7 6.7 萬萬hmhm2 2，年經(jīng)濟(jì)損失至少，年經(jīng)濟(jì)損失至少20 20 億億人民幣，且將嚴(yán)重威脅我國番茄產(chǎn)人民幣，且將嚴(yán)重威脅我國番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。苗期抗感對比感病 田間驗(yàn)證結(jié)果田間驗(yàn)證結(jié)果番茄對TYLCV的抗病性鑒定分級標(biāo)準(zhǔn)抗病檢測：抗病檢測：重要育種手段之一。即利用已知的的基因標(biāo)記對番茄樣品的抗病基因進(jìn)行檢測。根據(jù)PCR產(chǎn)物以電泳的方式做檢測。根據(jù)檢測結(jié)果選育抗病品種。 番茄中至少有15個(gè)抗病基因已被分離鑒定，其中抗黃化曲葉病毒病基因主要有TY-1、TY-2、TY-3 、TY-4抗病檢測抗病檢測主要內(nèi)容與技術(shù)方案主要內(nèi)容與技術(shù)方案選取

9、以目的基因設(shè)計(jì)的引物選取以目的基因設(shè)計(jì)的引物針對性的對所需檢針對性的對所需檢測的植株的測的植株的DNA進(jìn)進(jìn)行行擴(kuò)增檢測擴(kuò)增檢測根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果對植物的根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果對植物的抗病性做鑒定抗病性做鑒定所所需需檢測植株檢測植株的的DNA提取、提取、檢測檢測PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增、檢測檢測Ty-1 基因 大部分的 TYLCV 抗性商品品種都含有 Ty-1, 最早鑒定出的抗性位點(diǎn) Ty-1 是源于智利番茄的， 將 1 個(gè)主效基因 Ty-1 定位在番茄第 6 號染色體上。 該基因被定位在 RFLP 標(biāo)記 TG297和 TG97附近, 與標(biāo)記 TG97 緊密連鎖； 目前以 PCR 為基礎(chǔ)的TG97標(biāo)記已被各研究機(jī)構(gòu)和商

10、業(yè)公司用于MAS(Molecular assistant selection)。Zamir D, et al. Mapping and introgression of a tomato yellow leaf curl virus tolerance gene, Ty-1J. Theoretical and Applied Genetics, 1994, 88: 141-146Ty-2 基因 抗病基因抗病基因 Ty-2 來來源于野生種多毛源于野生種多毛番茄材料番茄材料 多毛番茄多毛番茄 Ih902 是危地馬拉和其是危地馬拉和其它中東國家很重它中東國家很重要的育種系抗性要的育種系抗性材料材料

11、Garcia B E, et al. Co-dominant SCAR marker for detection of the begomovirusresistance Ty-2 locus derived from Solanum habrochaites in tomato germplasm，,2007許爽等，多重PCR技術(shù)鑒定番茄Ty-2和Ty-3基因及田間驗(yàn)證，2009Ty-3 基因Ty-3 基因定位于第 6 染色體長臂上cLEG2312P16和 T1079之間Jensen K S, et al. Co-dominant SCAR Marker, P6-25, for Detect

12、ion of the ty-3, Ty-3, and Ty-3a alleles at 25 cM of Chromosome 6 of TomatoJ. /GeminivirusResistantTomatoes/Markers/MAS-Protocols/Ty3a-allele.pdf.2007Ty-1抗性基因檢測結(jié)果Ty-1基因的CAPS引物擴(kuò)增結(jié)果Ty-1 基因的基因的 398 bp特異片段經(jīng)特異片段經(jīng) Taq酶切酶切 Ty-1 基因的基因的 398 bp特異片段經(jīng)特異片段經(jīng) Taq酶切后為酶切后為 303 bp 和和 98 bp

13、 的特異片段，的特異片段，ty-1 基因的基因的 398 bp 的特異片段的特異片段不能被不能被 Taq酶切酶切。材料材料 1，2，3，5，9，10 的基因型為的基因型為 Ty-1/ty-1；材料材料 4，7，8 的基因型為的基因型為 Ty-1/Ty-1；材料材料 6，7，8 的基因型為的基因型為 ty-1/ty-1。 Ty-1基因的CAPS1引物擴(kuò)增后經(jīng)TAQI酶切結(jié)果表表 Ty-1酶切反應(yīng)體系（酶切反應(yīng)體系（10L）成分成分Composition含量含量ContentTaq(Taq酶酶)0.5L100BSA0.1L10Buffer1LPCR產(chǎn)物產(chǎn)物8.4LTy-2 Ty-2 抗性抗性基因檢

14、測基因檢測結(jié)果（結(jié)果（ SCAR1 ）Ty-2基因的SCAR1引物擴(kuò)增結(jié)果所有材料均沒有出現(xiàn)所有材料均沒有出現(xiàn) Ty-2 基因基因 900 bp 的特異片段，的特異片段，僅擴(kuò)增出僅擴(kuò)增出 ty-2 基因的基因的 800 bp 的特異片段，表明本所的特異片段，表明本所有鑒定材料均不含有鑒定材料均不含 Ty-2 抗性基因。抗性基因。Ty-2 Ty-2 抗性抗性基因檢測基因檢測結(jié)果（結(jié)果（ SCAR2 ）Ty-2基因的SCAR2引物擴(kuò)增結(jié)果Ty-2/Ty-2基因型的植株均擴(kuò)增出基因型的植株均擴(kuò)增出 600 bp 的特異片段，的特異片段，ty-2/ty-2基因型的株系均擴(kuò)增出約基因型的株系均擴(kuò)增出約

15、480 bp 的特異片段，的特異片段，Ty-2/ty-2基因型的株系擴(kuò)增出基因型的株系擴(kuò)增出 600 bp 和和480 bp的特異片段，的特異片段，與與 SCAR1 對這對這 22 份材料鑒定結(jié)果完全一致份材料鑒定結(jié)果完全一致。Ty-3Ty-3抗性基因檢測結(jié)果抗性基因檢測結(jié)果Ty-3基因的SCAR3引物擴(kuò)增結(jié)果材料材料 1，2，4，7，8 的基因型為的基因型為 Ty-3/Ty-3，材料材料 3，5，9，10 的基因型為的基因型為 Ty-3/ty-3，材料材料 6，11，12 的基因型為的基因型為 ty-3/ty-3。涉及實(shí)驗(yàn)技術(shù)涉及實(shí)驗(yàn)技術(shù) 番茄DNA提取 瓊脂糖凝膠電泳 PCR反應(yīng)反應(yīng)1.

16、獲取細(xì)胞： 研磨、勻漿2. 裂解細(xì)胞： 凍融、SDS3. 分離DNA： CTAB 、苯酚4. 純化DNA 乙醇、RNA酶 真核細(xì)胞的核基因組存在于細(xì)胞核內(nèi)，所以提取真核基因組DNA需要先破碎細(xì)胞膜和核膜，然后分離和純化DNA。提取過程中要防止酸、堿和DNA酶對DNA的降解番茄番茄DNA提取提取瓊脂糖凝膠電泳 制膠制膠：稱取1.2g瓊脂糖，溶于100mL 1TAE溶液中（微波加熱至完全融化）；加入10L的核酸染料；將混合均勻的液態(tài)膠倒入膠板，插好梳子待其凝固（約40分鐘） 上樣上樣：一般第一個(gè)點(diǎn)樣孔加入5L的2000bp的Marker，往其它點(diǎn)樣孔中滴入5L的PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物 電泳：電泳：調(diào)節(jié)電泳儀電壓為180V，電泳30-40min 保存：保存：利用凝膠成相系統(tǒng)對膠板進(jìn)行拍照并保存。PCR番茄番茄PCR反應(yīng)體系（反應(yīng)體系（10L）成分成分Composition含量含量ContentF