應(yīng)用伊文思蘭灌注技術(shù)觀察冰片

1、應(yīng)用伊文思蘭灌注技術(shù)觀察冰片應(yīng)用伊文思蘭灌注技術(shù)觀察冰片 對(duì)小鼠血腦屏障通透性的影響對(duì)小鼠血腦屏障通透性的影響實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)名稱 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 目目 的的 冰片冰片屬芳香開(kāi)竅之品，氣味芳香善于走屬芳香開(kāi)竅之品，氣味芳香善于走竄竄，有有開(kāi)竅醒神之效，常用于治療閉證神昏。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)開(kāi)竅醒神之效，常用于治療閉證神昏。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用伊文思藍(lán)用伊文思藍(lán)(EB)灌注法并結(jié)合腦組織灌注法并結(jié)合腦組織EB含量測(cè)含量測(cè)定定,檢測(cè)冰片對(duì)正常小檢測(cè)冰片對(duì)正常小鼠及腦缺血小鼠血腦屏障鼠及腦缺血小鼠血腦屏障通透性的通透性的影響。影響。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 血腦屏障血腦屏障由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和膠質(zhì)細(xì)胞足由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜

2、和膠質(zhì)細(xì)胞足突組成突組成, ,是一個(gè)介于血液、腦及脊髓之間的通透性較低是一個(gè)介于血液、腦及脊髓之間的通透性較低的有選擇性通過(guò)能力的動(dòng)態(tài)界面。生理?xiàng)l件下的有選擇性通過(guò)能力的動(dòng)態(tài)界面。生理?xiàng)l件下, ,血腦屏血腦屏障在障在維持腦的內(nèi)環(huán)境維持腦的內(nèi)環(huán)境及腦及腦與外周信息和與外周信息和物質(zhì)傳遞中發(fā)物質(zhì)傳遞中發(fā)揮揮重要重要作用。現(xiàn)代作用?，F(xiàn)代藥理研究表明藥理研究表明，以冰片為代表的開(kāi)，以冰片為代表的開(kāi)竅竅藥藥能在一定程度上改能在一定程度上改變血腦屏障通透性，從變血腦屏障通透性，從而迅速進(jìn)入中樞神經(jīng)系而迅速進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮治療作用統(tǒng)發(fā)揮治療作用。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 伊文思伊文思藍(lán)是一種經(jīng)典的血腦屏障通透

3、性示蹤藍(lán)是一種經(jīng)典的血腦屏障通透性示蹤劑，它與血清蛋白結(jié)合形成伊文思藍(lán)白蛋白，劑，它與血清蛋白結(jié)合形成伊文思藍(lán)白蛋白，不能透過(guò)完整的血腦屏障。當(dāng)血腦屏障通透性不能透過(guò)完整的血腦屏障。當(dāng)血腦屏障通透性增加時(shí)伊文思藍(lán)可隨血管內(nèi)的蛋白成分進(jìn)入增加時(shí)伊文思藍(lán)可隨血管內(nèi)的蛋白成分進(jìn)入組織間隙。其滲出量與血腦屏障開(kāi)放程度呈正組織間隙。其滲出量與血腦屏障開(kāi)放程度呈正相關(guān)。伊文思藍(lán)灌注后，通過(guò)對(duì)腦組織中滲入相關(guān)。伊文思藍(lán)灌注后，通過(guò)對(duì)腦組織中滲入的伊文思藍(lán)含量進(jìn)行定量分析的伊文思藍(lán)含量進(jìn)行定量分析,則可計(jì)算蛋白的則可計(jì)算蛋白的滲出量，可作為判斷血腦屏障通透性改變的一滲出量，可作為判斷血腦屏障通透性改變的一種定

4、量指標(biāo)。種定量指標(biāo)。 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物動(dòng)物 雄性ICR小鼠，清潔級(jí)，體重18g-20g。試劑試劑 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、TWEEN-20、冰 片、0.9%生理鹽水、2.5%伊文思藍(lán)（EB）溶液、3%水合氯醛、50%三氯醋酸、甲酰胺、無(wú)水乙醇、蒸餾水。 儀器儀器 電子天平、藥匙、量筒、燒杯、磁力攪拌器、移液器、玻璃棒、研缽、灌胃針、注射器、眼科鑷、剪刀、止血鉗、輸液器、平皿、醫(yī)用托盤、大頭針、海綿板、玻璃瓶、1.5mLEP管、水浴箱、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、勻漿機(jī)。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 冰片對(duì)正常小鼠腦組織伊文思藍(lán)含量的影響冰片對(duì)正常小鼠腦組織伊文思藍(lán)含量的影響 冰片對(duì)腦缺血小冰片對(duì)腦缺血小

5、鼠腦組織鼠腦組織伊文思藍(lán)含量的影響伊文思藍(lán)含量的影響38只38只38只114只只 冰片組（4只）正常組（4只）腦缺血組（15只）腦缺血+冰片組（15只） 冰片對(duì)正常小鼠腦組織伊文思藍(lán)含量的影響冰片對(duì)正常小鼠腦組織伊文思藍(lán)含量的影響 1. 2%冰片冰片溶液溶液 2.生理鹽水生理鹽水灌胃給藥灌胃給藥 2.5%伊文思伊文思藍(lán)藍(lán)溶液溶液0.1ml/10g眶靜脈注射眶靜脈注射 生理鹽水生理鹽水心內(nèi)灌注心內(nèi)灌注 左腦左腦 右腦右腦取腦、稱重取腦、稱重 甲酰胺浸泡法甲酰胺浸泡法 三氯醋酸抽提三氯醋酸抽提法法組織處理組織處理 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀EB檢測(cè)檢測(cè) 1.冰片冰片組組（4只只） 2.正常組正常組（4只只）30

6、min 1h后后 3%水合氯醛水合氯醛 （0.15ml/10g） 灌胃給藥灌胃給藥注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 小鼠捉持小鼠捉持 以右手提鼠尾，將小鼠放于粗糙面上以右手提鼠尾，將小鼠放于粗糙面上（如鼠籠蓋網(wǎng)），向后輕拉其尾，可使小鼠抓緊在（如鼠籠蓋網(wǎng)），向后輕拉其尾，可使小鼠抓緊在 粗糙面上。以右手的拇指、食指和中指捏住小鼠兩粗糙面上。以右手的拇指、食指和中指捏住小鼠兩 耳及頭部皮膚，無(wú)名指、小指和掌心夾住其背部和耳及頭部皮膚，無(wú)名指、小指和掌心夾住其背部和 尾部，使小鼠腹部向上，頸部拉直但不能過(guò)緊以免尾部，使小鼠腹部向上，頸部拉直但不能過(guò)緊以免 窒息。窒息。 小鼠灌胃小鼠灌胃 捉持后使小鼠頭部朝上，

7、右手持配有捉持后使小鼠頭部朝上，右手持配有 灌胃針頭的注射器，自口角插入口腔，針頭緊沿著灌胃針頭的注射器，自口角插入口腔，針頭緊沿著 上腭進(jìn)入食道，如插入正確推注藥物時(shí)容易進(jìn)入，上腭進(jìn)入食道，如插入正確推注藥物時(shí)容易進(jìn)入， 若小鼠掙扎，并且推注藥物有阻力，可能插入氣管，若小鼠掙扎，并且推注藥物有阻力，可能插入氣管， 應(yīng)退出再插。應(yīng)退出再插。 眶靜脈注射眶靜脈注射注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1、抓緊小鼠，左手拇指和食指抓住鼠兩耳、抓緊小鼠，左手拇指和食指抓住鼠兩耳之間的皮膚使鼠固定，并用中指配合，輕輕之間的皮膚使鼠固定，并用中指配合，輕輕壓迫頸部?jī)蓚?cè)，阻礙靜脈回流，使眼球充分壓迫頸部?jī)蓚?cè)，阻礙靜脈回流，

8、使眼球充分外突，提示眼眶后靜脈叢充血。右手持注射外突，提示眼眶后靜脈叢充血。右手持注射器，將其尖端插入內(nèi)器，將其尖端插入內(nèi)/外眼角與眼球之間，外眼角與眼球之間，輕輕向眼底方向刺入，深度約輕輕向眼底方向刺入，深度約23mm 。2、速度不宜太快，否則一方面趕不上小鼠的、速度不宜太快，否則一方面趕不上小鼠的吸收速度容易溢出，另一方面速度太快小鼠吸收速度容易溢出，另一方面速度太快小鼠適應(yīng)不及?；旧显诓灰绯龅那疤嵯拢瑒蛩龠m應(yīng)不及?；旧显诓灰绯龅那疤嵯?，勻速給藥即可。給藥即可。 心內(nèi)灌注心內(nèi)灌注步驟：步驟： 眶靜脈注射伊文思藍(lán)眶靜脈注射伊文思藍(lán)1h后，經(jīng)腹腔注射后，經(jīng)腹腔注射3%水合氯醛，注射量水合氯

9、醛，注射量為為0.15mL/10g，待小鼠充分麻醉后用大頭針將其固定于海綿板，待小鼠充分麻醉后用大頭針將其固定于海綿板，置于醫(yī)用托盤上，而后行常規(guī)胸腹聯(lián)合切口，開(kāi)胸，暴露心臟，將置于醫(yī)用托盤上，而后行常規(guī)胸腹聯(lián)合切口，開(kāi)胸，暴露心臟，將平頭針從心尖處插入左心室，用血管鉗將心室和平頭針一起鉗夾固平頭針從心尖處插入左心室，用血管鉗將心室和平頭針一起鉗夾固定，用生理鹽水進(jìn)行灌注（低流速），同時(shí)迅速在充盈的右心耳處定，用生理鹽水進(jìn)行灌注（低流速），同時(shí)迅速在充盈的右心耳處剪開(kāi)缺口，待流出液由血液變?yōu)榍辶烈后w，小剪開(kāi)缺口，待流出液由血液變?yōu)榍辶烈后w，小鼠鼠肺肺臟臟變變白或肝臟白或肝臟表表面出現(xiàn)較多白色條

10、紋，提示灌注完全。面出現(xiàn)較多白色條紋，提示灌注完全。 取腦取腦 用剪刀于頭頸聯(lián)合處剪掉小鼠頭部，后用鑷子層層剝離腦周組用剪刀于頭頸聯(lián)合處剪掉小鼠頭部，后用鑷子層層剝離腦周組織，逐步掰開(kāi)顱骨取腦（盡量保持鼠腦完整性），將取下的鼠腦置織，逐步掰開(kāi)顱骨取腦（盡量保持鼠腦完整性），將取下的鼠腦置于干燥平皿中，用剪刀迅速去除小腦，分離左右腦，于電子天平上于干燥平皿中，用剪刀迅速去除小腦，分離左右腦，于電子天平上稱量。分別記錄各小鼠左右腦重量。稱量。分別記錄各小鼠左右腦重量。 組織處理組織處理右腦右腦500ul甲酰胺中甲酰胺中浸泡浸泡離心離心15000r/min取上清液取上清液200ul用酶標(biāo)儀測(cè)吸光用酶

11、標(biāo)儀測(cè)吸光度值度值甲酰胺浸泡法甲酰胺浸泡法45水浴孵育水浴孵育24h 10min三氯醋酸抽提法三氯醋酸抽提法左腦左腦1ml50%三氯醋三氯醋酸酸離心離心10000r/min取上清液取上清液100ul混于混于300ul無(wú)水無(wú)水乙醇乙醇離心離心10000r/min 取上清液取上清液200ul用酶標(biāo)儀測(cè)吸光用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值度值 勻漿勻漿10min20min EB檢測(cè)檢測(cè)1.取取EB4mg溶于溶于25ml生理鹽水中，取生理鹽水中，取0.3ml加入加入5.7ml生理鹽水中，混勻?yàn)榈谏睇}水中，混勻?yàn)榈?管；從第管；從第1管取管取3ml,加入加入3ml生理鹽水混勻?yàn)榈谏睇}水混勻?yàn)榈?管；以此類推共做管

12、；以此類推共做7管，其濃度管，其濃度分別為分別為8 8、4 4、2 2、1 1、0.500.50、0.250.25、0.125ug/ml0.125ug/ml，各管取，各管取200ul至酶標(biāo)板中，于酶至酶標(biāo)板中，于酶標(biāo)儀上標(biāo)儀上540nm處比色，記錄處比色，記錄OD值，根據(jù)值，根據(jù)OD值及濃度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。值及濃度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。2.取取上清液上清液200uL用酶標(biāo)用酶標(biāo)儀儀（波長(zhǎng)（波長(zhǎng)540 nm ）測(cè)測(cè)吸光度吸光度值值，生理鹽水生理鹽水為空白對(duì)照為空白對(duì)照。將將所得的所得的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算EB量，再除以對(duì)應(yīng)腦濕重，求得伊量，再除以對(duì)應(yīng)

13、腦濕重，求得伊文思藍(lán)含量（文思藍(lán)含量（ug/g腦濕腦濕重）。重）。 例例y = 8420.x3 - 1793.x2 + 278.4x - 7.5640.005.0010.0015.0020.0025.000.000.020.040.060.080.100.120.140.16每5mL溶液伊文思藍(lán)含量標(biāo)準(zhǔn)OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線系列1 冰片對(duì)腦缺血小鼠組織伊文思藍(lán)含量的影響冰片對(duì)腦缺血小鼠組織伊文思藍(lán)含量的影響 1. 正常組正常組（4只只） 2.腦缺血組（腦缺血組（15只）只） 3.腦缺血腦缺血+冰片組（冰片組（15只）只） 1/2.生理鹽生理鹽 水水 3. 2%冰片溶冰片溶液液灌胃給藥灌胃給藥 2.5%

14、伊文思伊文思藍(lán)溶液藍(lán)溶液眶靜脈注射眶靜脈注射 生理鹽水生理鹽水心內(nèi)灌注心內(nèi)灌注 左腦左腦 右腦右腦取腦、稱重取腦、稱重 甲酰胺浸泡法甲酰胺浸泡法 三氯醋酸抽提三氯醋酸抽提法法組織處理組織處理 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀EB檢測(cè)檢測(cè) 分離并結(jié)分離并結(jié)扎雙側(cè)頸扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈總動(dòng)脈構(gòu)建腦缺血構(gòu)建腦缺血模型模型30min1h后后 3%水合氯醛水合氯醛 （0.15ml/10g） 構(gòu)建腦缺血模型構(gòu)建腦缺血模型麻醉分離結(jié)扎縫合 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)麻醉麻醉腹腔注射，腹腔注射，3%水合氯水合氯醛醛(0.15ml/10g),小鼠的頭小鼠的頭部部向下向下,腹中線與腹股溝之間進(jìn)針，動(dòng)作輕柔腹中線與腹股溝之間進(jìn)針，動(dòng)作輕柔，防止刺傷，防止刺傷腹部器官。腹部器官。分離分離頸總動(dòng)脈位于氣管兩側(cè)，其腹面被胸骨舌骨肌和頸總動(dòng)脈位于氣管兩側(cè)，其腹面被胸骨舌骨肌和胸骨甲狀肌所覆蓋。分離時(shí)用止血鉗沿胸骨乳突肌前緣分胸骨甲狀肌所覆蓋。分離時(shí)用止血鉗沿胸骨乳突肌前