PCR技術在食品微生物中的檢測

1、報告人：報告人： 馮馮 姣姣PCR技術簡介PCR技術在食品微生物檢測中的應用PCR技術在食品微生物檢測中的優(yōu)勢PCR技術在食品微生物檢測中的存在問題目錄Khorana(1971)等提出在體外經等提出在體外經DNA變性變性,與適當與適當引物雜交引物雜交,再用再用DNA聚合酶延伸聚合酶延伸,克隆克隆DNA的設想。的設想。 1983年年,Mullis發(fā)明了發(fā)明了PCR技術技術,使使Khorana的設的設想得到實現。想得到實現。 1988年年Saiki等將耐熱等將耐熱DNA聚合酶（聚合酶（Taq）引入）引入了了PCR技術。技術。 1989年美國年美國Science雜志列雜志列PCR 為十余項重為十余項

2、重大科學發(fā)明之首大科學發(fā)明之首,比喻比喻1989年為年為PCR爆炸爆炸年年,Mullis榮獲榮獲1993年度諾貝爾化學獎。年度諾貝爾化學獎。PCRPCR技術的創(chuàng)建史技術的創(chuàng)建史PCRPCR技術的原理技術的原理無細胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液, 微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶, 一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數放大一倍,一般樣品是經過30次循環(huán),最終使基因放大了數百萬倍; 擴增了特異區(qū)段的DNA帶。PCRPCR技術分類技術分類熒光定量熒光定量PCRPCR常規(guī)常規(guī)檢測檢測 多重多重PCRP

3、CR檢測檢測 熒光定量熒光定量PCRPCR檢測檢測 IMS-PCRIMS-PCR檢測檢測 PCR-DGGEPCR-DGGE在熱穩(wěn)定在熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶的催化下，常規(guī)聚合酶的催化下，常規(guī)PCRPCR檢測原理是在存在檢測原理是在存在DNADNA模板、模板、dNTPdNTP、引物、適當緩沖液與引物、適當緩沖液與MgClMgCl溶溶液的反溶溶液的反應混合物中，對一對寡核苷酸引物所應混合物中，對一對寡核苷酸引物所界定的界定的DNADNA片段進行擴增。片段進行擴增。多重多重PCR(multiplex PCR)PCR(multiplex PCR)的檢測的檢測原理與傳統(tǒng)原理與傳統(tǒng)PCRPCR相同，如果存

4、在與相同，如果存在與各引物對特異性互補的模板，只不各引物對特異性互補的模板，只不過是在同一反應體系中加入過是在同一反應體系中加入1 1對以對以上的特異性引物上的特異性引物，那么就可以同時，那么就可以同時在同一個反應管中擴增出在同一個反應管中擴增出1 1條以上條以上的目的的目的DNADNA片段片段。使用這一方法可。使用這一方法可以以同時檢測同時檢測1 1個以上目的基因個以上目的基因或者或者借助其交叉限制進行確認。與常規(guī)借助其交叉限制進行確認。與常規(guī)的的PCRPCR相比，還具有相比，還具有擴增效率高、擴增效率高、產物特異性高和經濟簡便等特點產物特異性高和經濟簡便等特點，特別適合食品中多種致病菌的快

5、速特別適合食品中多種致病菌的快速檢測檢測. .實時熒光定量是將熒光能量傳遞技術應用于傳統(tǒng)多實時熒光定量是將熒光能量傳遞技術應用于傳統(tǒng)多聚酶鏈式反應儀中，通過聚酶鏈式反應儀中，通過受體發(fā)色團受體發(fā)色團之間之間偶極偶極偶偶極極相互作用。檢測相互作用。檢測PCRPCR過程的熒光訊號便可得知過程的熒光訊號便可得知靶序靶序列初始濃度列初始濃度，能量從供體發(fā)色團轉移到受體發(fā)色團，能量從供體發(fā)色團轉移到受體發(fā)色團，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強度與受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強度與DNADNA產量成正產量成正比，從而達到定量目的比，從而達到定量目的。該該技術實現了技術實現了 從定性到定量從定性到定量的飛躍，

6、除了具的飛躍，除了具有常規(guī)的快速、靈敏、操作方便等特點外，有常規(guī)的快速、靈敏、操作方便等特點外，還具有以下優(yōu)點：還具有以下優(yōu)點：全封閉反應全封閉反應，無需凝膠電泳等，無需凝膠電泳等后處理，減小對環(huán)境的污染；后處理，減小對環(huán)境的污染；不使用有毒試劑不使用有毒試劑，操作安全；定量準確；儀器在線實時監(jiān)測，結果直操作安全；定量準確；儀器在線實時監(jiān)測，結果直觀觀免疫磁珠技術（免疫磁珠技術（ ）其原理是磁珠經過一定的處理其原理是磁珠經過一定的處理后，可后，可結合某種微生物特異性抗體結合某種微生物特異性抗體，形形成成免疫磁珠免疫磁珠。將這種帶有特異性抗體的將這種帶有特異性抗體的免疫磁珠加到待測樣品中，相應的

7、抗原免疫磁珠加到待測樣品中，相應的抗原物質就會和免疫磁珠上的抗體發(fā)生特異物質就會和免疫磁珠上的抗體發(fā)生特異性結合，形成性結合，形成抗原抗體磁珠免疫復抗原抗體磁珠免疫復合物合物，此復合物在外加磁場的作用下發(fā)此復合物在外加磁場的作用下發(fā)生定向移動，使生定向移動，使復合物與其他物質分離復合物與其他物質分離，從而達到快速分離抗原物質的目的。該從而達到快速分離抗原物質的目的。該技術不僅具備了固相化試劑特有的優(yōu)點技術不僅具備了固相化試劑特有的優(yōu)點以及免疫學反應的高度特異性，還具有以及免疫學反應的高度特異性，還具有高效、快速、可重復性好、操作簡單和高效、快速、可重復性好、操作簡單和不需昂貴的儀器設備不需昂貴

8、的儀器設備等優(yōu)點。等優(yōu)點。PCR-DGGE的技術是將的技術是將PCR和變性梯度凝膠電泳和變性梯度凝膠電泳的的(DGGE)分析技術結合起來是一種可將長度相同而序列分析技術結合起來是一種可將長度相同而序列不同的不同的DNA片段混合物分離開的一項技術。片段混合物分離開的一項技術。DGGE的基的基本原理是：由于本原理是：由于DNA分子中分子中4種堿基種堿基的組成和的組成和排列排列存在存在差異，造成不同序列的差異，造成不同序列的DNA分子的分子的解鏈溫度不同解鏈溫度不同，解鏈，解鏈時所需的時所需的變性劑的濃度也不同變性劑的濃度也不同。當雙鏈。當雙鏈DNA分子在含梯分子在含梯度變性劑（尿素、甲酰胺）的聚丙

9、烯酰胺凝膠中進行電度變性劑（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，會致使序列不同的泳時，會致使序列不同的DNA片段會在各自相應的變性片段會在各自相應的變性劑濃度下變性，從而使劑濃度下變性，從而使DNA分子的遷移速度不斷下降，分子的遷移速度不斷下降，當產生的遷移阻力與電場力相對平衡時，不同序列的當產生的遷移阻力與電場力相對平衡時，不同序列的DNA 片段滯留于凝膠的不同位置，形成相互分開的帶片段滯留于凝膠的不同位置，形成相互分開的帶譜。理論上只要選擇的電泳條件足夠精細，有一個堿基譜。理論上只要選擇的電泳條件足夠精細，有一個堿基差異的差異的DNA長段都可以被分開。長段都可以被分開。PCR-DG

10、GE技術具有技術具有可檢測不可培養(yǎng)類細菌、檢測時間短、檢測率高、重復可檢測不可培養(yǎng)類細菌、檢測時間短、檢測率高、重復性好性好等優(yōu)點。等優(yōu)點。檢測樣品經預處理后獲得檢測樣品經預處理后獲得DNADNA模板；模板；DNADNA模板的變性模板的變性：模板：模板DNADNA經加熱至經加熱至9595左右一定時間后，左右一定時間后，使模板使模板DNADNA雙鏈或經雙鏈或經PCRPCR擴增形成的雙鏈擴增形成的雙鏈DNADNA解離后成為單解離后成為單鏈，以便它與引物結合，為其后階段反應做準備；鏈，以便它與引物結合，為其后階段反應做準備；模板模板DNADNA與引物的退火（復性）與引物的退火（復性）：模板：模板DN

11、ADNA經加熱變性成單經加熱變性成單鏈后，溫度降至鏈后，溫度降至5555左右，這時人工合成的引物與模板左右，這時人工合成的引物與模板DNADNA單鏈經互補序列配對結合；單鏈經互補序列配對結合；引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板引物結合物在耐熱引物結合物在耐熱DNADNA聚合酶的催聚合酶的催化作用下，以化作用下，以4 4種三磷酸脫氧核苷酸為反應原料，靶序列為模種三磷酸脫氧核苷酸為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原則，合成一條新的與模板，按堿基互補配對與半保留復制原則，合成一條新的與模板板DNA DNA 結構組成相同的新鏈。結構組成相同的新鏈。 重復循環(huán)重復循環(huán)變性變性

12、退火退火延伸延伸三過程，就可獲得更多的新鏈，三過程，就可獲得更多的新鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2 24 4分鐘，一般單一拷貝的基因循環(huán)分鐘，一般單一拷貝的基因循環(huán)25302530次次DNADNA便可擴增便可擴增l00l00萬萬200200萬倍。萬倍。PCRPCR反應產物再通過凝膠電脈和基因測序反應產物再通過凝膠電脈和基因測序等等DNADNA分析技術確定擴增分析技術確定擴增DNADNA序列的具體信息。序列的具體信息。PCRPCR操作過程操作過程PCRPCR技術在食品微生物檢測中的應用技術在食品微生物檢測中的應用常規(guī)

13、常規(guī)PCRPCR技術的使用技術的使用 劉勝貴等人利用劉勝貴等人利用PCRPCR技術檢測豬肉中沙門氏菌，技術檢測豬肉中沙門氏菌，對已知和未知被沙門氏菌污染的豬肉的培養(yǎng)物均對已知和未知被沙門氏菌污染的豬肉的培養(yǎng)物均能準確檢測。對不同稀釋度的樣品進行能準確檢測。對不同稀釋度的樣品進行PCRPCR擴增，擴增，當當DNADNA含量只有含量只有0.01pg0.01pg時，還能擴增出條帶，說明時，還能擴增出條帶，說明該方法檢測豬肉中沙門氏菌具有特異性高且靈敏、該方法檢測豬肉中沙門氏菌具有特異性高且靈敏、快速等特點。快速等特點。 巢國祥等人通過巢國祥等人通過PCRPCR法擴增法擴增hlyhly基因建立快速基因

14、建立快速檢測單核細胞增生性李斯特氏菌（檢測單核細胞增生性李斯特氏菌（LMLM）的方法。）的方法。并檢測模擬污染生豬肉、水和牛奶，檢測限達并檢測模擬污染生豬肉、水和牛奶，檢測限達10cfu/25g10cfu/25g（mlml）。）。改進改進PCRPCR技術的技術的使用使用多重多重技術技術熒光定量熒光定量技術技術And so And so on!on!IMS-PCRIMS-PCR技術技術PCR-PCR-DGGEDGGE技術技術梁會營等梁會營等根據阪崎腸桿菌外膜蛋白（根據阪崎腸桿菌外膜蛋白（omp）基因和金黃色葡萄球菌）基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶（耐熱核酸酶（nuc）基因序列，設計兩對特異性引物

15、，并優(yōu)化了）基因序列，設計兩對特異性引物，并優(yōu)化了的條件，建立了嬰幼兒奶粉中常見病原菌的多重的條件，建立了嬰幼兒奶粉中常見病原菌的多重PCR檢測方法。結果表檢測方法。結果表明，該方法具有很高的特異性，混菌檢測靈敏度達到明，該方法具有很高的特異性，混菌檢測靈敏度達到103cfuml，為快，為快速檢測奶粉中病原菌提供了有效手段。速檢測奶粉中病原菌提供了有效手段。陳偉等對金黃葡萄球菌的陳偉等對金黃葡萄球菌的nuc基因、單增李斯特菌的基因、單增李斯特菌的hlv基因和蠟樣芽孢基因和蠟樣芽孢桿菌的桿菌的hemolysin基因設計了引物，建立了種致病菌的多重檢測基因設計了引物，建立了種致病菌的多重檢測體系，

16、結果顯示該方法檢測結果與單基因體系，結果顯示該方法檢測結果與單基因PCR檢測的靈敏度相同，結果檢測的靈敏度相同，結果穩(wěn)定。整個檢測過程在穩(wěn)定。整個檢測過程在16h內完成，檢測靈敏度可達內完成，檢測靈敏度可達cfuml。KAWASAKLS等人利用多重等人利用多重PCR方法同時檢測肉類中的沙門菌、李斯特方法同時檢測肉類中的沙門菌、李斯特菌和大腸桿菌菌和大腸桿菌O157:H7，通過，通過UPB增菌培養(yǎng)基增菌后檢測敏感性可達到增菌培養(yǎng)基增菌后檢測敏感性可達到cfu25g.李敏等研究表明，將李敏等研究表明，將IMSIMS與多重與多重PCRPCR結合，結合，24h24h內即可檢出食品中的單增內即可檢出食品

17、中的單增李斯特菌，最低檢測限可達李斯特菌，最低檢測限可達cfucfu25g25g（）。（）。王曉聞等建立了沙門氏菌的磁捕獲王曉聞等建立了沙門氏菌的磁捕獲PCRPCR檢測方法，實驗包括前增菌、免檢測方法，實驗包括前增菌、免疫磁珠制備分離、疫磁珠制備分離、DNADNA提取及提取及PCRPCR擴擴增，即可完成檢測過程，且檢測增，即可完成檢測過程，且檢測靈敏度為靈敏度為cfucfumlml。結果表明該方。結果表明該方法操作簡便、用時短、檢出率高。法操作簡便、用時短、檢出率高。高虹等建立了奶粉中阪崎腸桿菌高虹等建立了奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法。其所建立的方法特檢測方法。其所建立的方法特異性強，靈敏度高，在

18、異性強，靈敏度高，在2.2-5.4cfu2.2-5.4cfu100100范圍內線性關系良好；與范圍內線性關系良好；與方法比對實驗表明，兩種方法的檢測結方法比對實驗表明，兩種方法的檢測結果完全一致。果完全一致。翁文川等人針對單增李斯特氏菌溶血素翁文川等人針對單增李斯特氏菌溶血素基因（基因（hlyhly），設計特異的引物），設計特異的引物TapManTapMan探針，優(yōu)化體系，建立了食品探針，優(yōu)化體系，建立了食品中單核細胞增生李斯特氏菌的熒光定量中單核細胞增生李斯特氏菌的熒光定量檢測方法，該方法檢測低限為檢測方法，該方法檢測低限為cfu/gcfu/g，整個流程只需，整個流程只需27h27h。與傳統(tǒng)

19、。與傳統(tǒng)方法進行對比，結果一致。方法進行對比，結果一致。COCOLINCOCOLIN等建立一種直接檢測食品等建立一種直接檢測食品中李斯特菌屬的分子生物學方法。中李斯特菌屬的分子生物學方法。通過通過PCRPCR擴增李斯特菌和標準菌株擴增李斯特菌和標準菌株的特異的特異iapiap基因，擴增產物再用基因，擴增產物再用DGGEDGGE進行分離，鑒定出五種李斯特進行分離，鑒定出五種李斯特菌。菌。李苗云等研究冷卻豬肉貯藏過程中李苗云等研究冷卻豬肉貯藏過程中的微生物變化，直接提取不同冷藏的微生物變化，直接提取不同冷藏天數肉樣天數肉樣DNADNA，對細菌，對細菌16SrDAN16SrDAN的的v6-v8v6-v8區(qū)段進行區(qū)段進行PCRPCR擴增，通過擴增，通過DGGEDGGE 及序列分析，結果表明，冷卻豬肉及序列分析，結果表明，冷卻豬肉耗氧貯藏過程中的微生物主要有：耗氧貯藏過