神經(jīng)信號與電生理學(xué)方法(li)

1、神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞與電生理學(xué)神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞與電生理學(xué)研究方法研究方法 一、神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞一、神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞 二、電生理學(xué)方法介紹二、電生理學(xué)方法介紹醫(yī)學(xué)院生理學(xué)研究所醫(yī)學(xué)院生理學(xué)研究所 李景新 88383902一、神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞一、神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞1. 1. 神經(jīng)元軸突內(nèi)神經(jīng)活動的電變化神經(jīng)元軸突內(nèi)神經(jīng)活動的電變化Measuring the resting membrane potential1) 1) 電信號電信號Methods of Recording Action Potentials1)1)電信號電信號神經(jīng)纖維靜息電位與動作神經(jīng)纖維靜息電位與動作電位波形與產(chǎn)生機制電位

2、波形與產(chǎn)生機制The voltage-gated channelStructure of the voltage-gated sodium channel2. 2. 神經(jīng)元神經(jīng)元- -神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞Synaptic arrangements in the CNSVarious sizes of CNS synapses2. 2. 神經(jīng)元神經(jīng)元- -神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞2. 神經(jīng)元神經(jīng)元-神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞神經(jīng)元間化學(xué)性突觸傳遞A membrane ion channelThe properties: ion selectivity an

3、d gating.A membrane ion channelThe properties: ion selectivity and gating.Transmitter actions at G-protein-coupled receptors. The binding of neurotransmitter to the receptor leads to the activation of G-proteins. Activated G-proteins activate effector proteins, which may be (a) ion channels or (b) e

4、nzymes that generate intracellular second messengers.二、電生理學(xué)方法二、電生理學(xué)方法n細胞外紀錄細胞外紀錄 (extracellular recording): n細胞內(nèi)紀錄細胞內(nèi)紀錄 (intracellular single unit recording)：n電壓鉗（電壓鉗（voltage clamp）n膜片鉗（膜片鉗（patch clamp） n腦電圖腦電圖 (EEG)n誘發(fā)電位（誘發(fā)電位（evoked potential） n微電泳（微電泳（microelectrophoresis） n抗體微量注射抗體微量注射 n正電子發(fā)射斷層掃描

5、術(shù)正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)n磁共振成像術(shù)磁共振成像術(shù) （1) 陰極射線示波器（陰極射線示波器（oscillograph）：）： （2）生物電放大器）生物電放大器(amplifier): 頻率相應(yīng)范圍大（通頻帶從頻率相應(yīng)范圍大（通頻帶從0100kHz)，有足夠高的放大能力，低噪聲，高輸入阻抗，高的辨差比。有足夠高的放大能力，低噪聲，高輸入阻抗，高的辨差比。（3）電子刺激器（）電子刺激器（electronic stimulator）: 矩形脈沖：刺激強度（幅度矩形脈沖：刺激強度（幅度: 最大瞬時值，最大瞬時值，0.001200V之間，連續(xù)可調(diào)）、時間（波寬：之間，連續(xù)可調(diào)）、時間（波寬：10 s1s）

6、、頻率）、頻率(波寬和延遲時間之和小于頻率的倒數(shù)波寬和延遲時間之和小于頻率的倒數(shù))、延遲、延遲 ；刺激；刺激方式：單，連續(xù)，雙脈沖刺激；同步輸出：觸發(fā)其他需要與刺激同步的儀方式：單，連續(xù)，雙脈沖刺激；同步輸出：觸發(fā)其他需要與刺激同步的儀器（示波器，微電泳，照相等）一起工作。刺激隔離器（器（示波器，微電泳，照相等）一起工作。刺激隔離器（insulator）。）。（4） 儲存和分析電生理實驗結(jié)果的儀器：儲存和分析電生理實驗結(jié)果的儀器： 常用的主要儀器常用的主要儀器 電記錄的技術(shù)電記錄的技術(shù)(A) 細胞外記錄法記錄法記錄單個細胞或一群細胞的電活動。細胞外記錄法記錄法記錄單個細胞或一群細胞的電活動。(

7、B) 微電極細胞內(nèi)記錄法記錄膜內(nèi)外的電位差：靜息電位和動作電位。微電極細胞內(nèi)記錄法記錄膜內(nèi)外的電位差：靜息電位和動作電位。(C) 膜片鉗記錄法記錄當膜上單個通道開啟或關(guān)閉時的電流。膜片鉗記錄法記錄當膜上單個通道開啟或關(guān)閉時的電流。工作原理：工作原理：把引導(dǎo)電極安放在神經(jīng)組織的表面或附近引導(dǎo)神經(jīng)組織的把引導(dǎo)電極安放在神經(jīng)組織的表面或附近引導(dǎo)神經(jīng)組織的電活動?；顒硬课坏纳窠?jīng)元去極化，未活動部位極化狀態(tài)，在容積導(dǎo)電活動?；顒硬课坏纳窠?jīng)元去極化，未活動部位極化狀態(tài)，在容積導(dǎo)體中兩部位電位不同，電流流動，放置在細胞表面的電極會紀錄出兩體中兩部位電位不同，電流流動，放置在細胞表面的電極會紀錄出兩者間的電位

8、差。者間的電位差。優(yōu)點：優(yōu)點：方便，電極不插入細胞。方便，電極不插入細胞。特點：特點：細胞外電位的波形因記錄細胞的不同部位而異細胞外電位的波形因記錄細胞的不同部位而異 細胞外紀錄細胞外紀錄 (Extracellular(Extracellular Recording) Recording)Wang et al., J Comp Neurol, 2001膈神經(jīng)及呼吸相關(guān)神經(jīng)元放電記錄細胞內(nèi)紀錄細胞內(nèi)紀錄 I Intracellular Single Unit Recording細胞內(nèi)紀錄細胞內(nèi)紀錄 Intracellular Single Unit Recording 由于插入神經(jīng)元內(nèi)胞體并記錄

9、細由于插入神經(jīng)元內(nèi)胞體并記錄細胞內(nèi)電位的微電極技術(shù)的發(fā)展，胞內(nèi)電位的微電極技術(shù)的發(fā)展，Eccles等首先將微電極插入脊髓運動等首先將微電極插入脊髓運動神經(jīng)元的胞體，記錄哺乳類動物脊髓神經(jīng)元的胞體，記錄哺乳類動物脊髓的大運動神經(jīng)元胞內(nèi)電位。的大運動神經(jīng)元胞內(nèi)電位。運動神經(jīng)元的胞體直徑運動神經(jīng)元的胞體直徑70 m;微電極尖端直徑微電極尖端直徑0.5 m；跨膜電位差跨膜電位差6080mV。圖圖 用微電極在貓脊髓運動神經(jīng)元內(nèi)記錄的突觸后電位用微電極在貓脊髓運動神經(jīng)元內(nèi)記錄的突觸后電位A.B.C:三種不同的閾下刺激；三種不同的閾下刺激； D:10次刺激引起的峰電位。次刺激引起的峰電位。圖圖 刺激神經(jīng)在單

10、根肌纖維的終刺激神經(jīng)在單根肌纖維的終板上所誘發(fā)的電位板上所誘發(fā)的電位a. 正常終板電位和相繼發(fā)生的正常終板電位和相繼發(fā)生的肌肉峰電位；肌肉峰電位；b,c,d,e: 箭毒進行箭毒進行性地阻滯肌反應(yīng)性地阻滯肌反應(yīng); e只留下終板只留下終板電位，神經(jīng)肌肉傳遞被箭毒阻滯電位，神經(jīng)肌肉傳遞被箭毒阻滯了。了。圖圖 槍烏賊星狀神經(jīng)節(jié)的突觸前纖維表現(xiàn)槍烏賊星狀神經(jīng)節(jié)的突觸前纖維表現(xiàn)的動作電位和在突觸后神經(jīng)元誘發(fā)的局的動作電位和在突觸后神經(jīng)元誘發(fā)的局部電位。部電位。 20世紀世紀50年代，年代，Hodgkin and Huxley 首次應(yīng)用電壓鉗技術(shù)對槍烏賊的標本首次應(yīng)用電壓鉗技術(shù)對槍烏賊的標本進行膜電流的測定

11、。進行膜電流的測定。工作原理：工作原理：離子流過通道所形成的離子流是形成動作電位的基礎(chǔ)。電生理實驗以離子流過通道所形成的離子流是形成動作電位的基礎(chǔ)。電生理實驗以電流作為刺激源，使可興奮細胞產(chǎn)生興奮，然后測定其膜電壓以確定離子通道的電流作為刺激源，使可興奮細胞產(chǎn)生興奮，然后測定其膜電壓以確定離子通道的狀態(tài)。但在形成動作電位時所產(chǎn)生的離子流可影響膜電位，而膜電位的變化又會狀態(tài)。但在形成動作電位時所產(chǎn)生的離子流可影響膜電位，而膜電位的變化又會影響該離子的通透性的變化。因而，影響該離子的通透性的變化。因而，須人為地使膜電位在一定時間內(nèi)維持在一個須人為地使膜電位在一定時間內(nèi)維持在一個固定水平。電壓鉗技術(shù)

12、是通過插入細胞內(nèi)的一根微電極人為向胞內(nèi)補充電流，補固定水平。電壓鉗技術(shù)是通過插入細胞內(nèi)的一根微電極人為向胞內(nèi)補充電流，補充的電流正好等于跨膜流出的反相離子電流（大小相等方向相反）。充的電流正好等于跨膜流出的反相離子電流（大小相等方向相反）。意義意義 ：1）確保膜通透性發(fā)生改變時，控制膜電位始終維持在指令電位的水平；）確保膜通透性發(fā)生改變時，控制膜電位始終維持在指令電位的水平；2）通過電流檢測裝置，記錄到補充入胞內(nèi)的注入電流，它相當于離子電流的反相電通過電流檢測裝置，記錄到補充入胞內(nèi)的注入電流，它相當于離子電流的反相電流。這樣可流。這樣可測定在不同膜電位水平的離子電流，了解膜通道的電導(dǎo)及功能活動

13、。測定在不同膜電位水平的離子電流，了解膜通道的電導(dǎo)及功能活動。電壓鉗電壓鉗 voltage clampvoltage clamp應(yīng)用：應(yīng)用：定量分析刺激與細胞后膜電導(dǎo)的變化。反映定量分析刺激與細胞后膜電導(dǎo)的變化。反映整個細胞膜上所有通道活動的綜合結(jié)果。整個細胞膜上所有通道活動的綜合結(jié)果。不足：不足：此項技術(shù)不能了解單個離子通道的功能活動此項技術(shù)不能了解單個離子通道的功能活動狀態(tài)。另外，牽制的面積大，包含大量的隨機開放狀態(tài)。另外，牽制的面積大，包含大量的隨機開放和關(guān)閉的通道，形成的背景噪音也大，掩蓋單一通和關(guān)閉的通道，形成的背景噪音也大，掩蓋單一通道的微弱電流，另外，小神經(jīng)元插入兩個電極不容道的

14、微弱電流，另外，小神經(jīng)元插入兩個電極不容易。易。電壓鉗裝置圖和電壓鉗實驗記錄的膜電流電壓鉗裝置圖和電壓鉗實驗記錄的膜電流 1976年由德國年由德國Neher 和和Sakmann 發(fā)明（發(fā)明（1991 Nobel Prize）。）。工作原理：工作原理：同電壓鉗，即在人為設(shè)置電壓并固定的情況下記錄分析離子通道。同電壓鉗，即在人為設(shè)置電壓并固定的情況下記錄分析離子通道。膜片鉗技術(shù)使用玻璃微電極吸管把只含膜片鉗技術(shù)使用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個個離子通道、面積為幾個mm2的細的細胞膜通過負壓吸引封接起來。由于電極尖端與細胞膜的高阻封接，在電極尖端胞膜通過負壓吸引封接起來。由于電極

15、尖端與細胞膜的高阻封接，在電極尖端下的那片膜與膜的其他部分從電學(xué)上隔離。因此，片膜內(nèi)通道開放所產(chǎn)生的電下的那片膜與膜的其他部分從電學(xué)上隔離。因此，片膜內(nèi)通道開放所產(chǎn)生的電流流進玻璃吸管，用一個極為敏感的膜片鉗放大器測量此電流強度，即代表單流流進玻璃吸管，用一個極為敏感的膜片鉗放大器測量此電流強度，即代表單一離子通道電流。一離子通道電流。性能：性能：電極尖端電極尖端(15 m)與膜之間電阻與膜之間電阻 10 9 （ G , 10G100G ）的高封）的高封接（接（giga-seals）, 大大提高了膜片鉗的可靠性和靈敏性，可測量大大提高了膜片鉗的可靠性和靈敏性，可測量0.06pA的電的電流，流，

16、1 m的空間分辨力和的空間分辨力和10 s時間的分辨力。時間的分辨力。意義：意義：膜上電壓依賴型離子通道有開與關(guān)兩種電導(dǎo)狀態(tài)。通道膜片鉗技術(shù)可直膜上電壓依賴型離子通道有開與關(guān)兩種電導(dǎo)狀態(tài)。通道膜片鉗技術(shù)可直接觀察離子通道接觀察離子通道“開啟開啟”和和“關(guān)閉關(guān)閉”。膜片鉗膜片鉗 P Patch ClampPatch clamping record ionic currents through single channels The patch contains a voltage-gated Na+ channel, Changing the membrane potential from 65

17、 mV to 40 mV, Cause the channel to open,and current (I) will flow through it (e).The amplitude of the measured current at a constant membrane voltage reflects the channel conductance, and the duration of the current reflects the time the channel is open. b. Applying suction through the electrode tip

18、.c. Withdraw the electrode from the cell, the membrane patch was torn away.d. Ionic currents was measured as steady voltages across the membrane.a. A glass electrode onto the membrane of the neuron.The opening and closing of Na+ channels upon membrane depolarization(a) The electrical potential acros

19、s a patch of membrane. When the membrane potential is changed from 65-40mV, the Na+ channels pop open.(b) Three different channels respond to the voltage step.(c): A model for how changes in the conformation of the Na+ channel protein might yield its functional properies.The shortcut pathwaya) G-pro

20、teins in heart muscle are activated by ACh binding to muscanrinic receptors.b) The activated G subunit directly gates a K+ channel.A patch-clamp recording from a transmitter-gated ion channel.Ionic current passes through the channels when the channels are open in the presence of neurotransmitter.Ibu

21、profen Inhibits Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatormediated Cl Secretion原理原理:應(yīng)用光學(xué)記錄技術(shù)，把特別研制的熒光染料與細應(yīng)用光學(xué)記錄技術(shù)，把特別研制的熒光染料與細胞膜結(jié)合，在有動作電位發(fā)生時，這種燃料的光吸收特胞膜結(jié)合，在有動作電位發(fā)生時，這種燃料的光吸收特性發(fā)生改變。性發(fā)生改變。種類：種類： 正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)（正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)（positron emission tomography, PET） 磁共振成像術(shù)（磁共振成像術(shù)（magnetic resonace imaging）作

22、用：作用：顯示顯示清醒人的大腦中受刺激區(qū)域，或發(fā)動運動時清醒人的大腦中受刺激區(qū)域，或發(fā)動運動時的活動狀態(tài)。的活動狀態(tài)。神經(jīng)元活動的無創(chuàng)傷技術(shù)神經(jīng)元活動的無創(chuàng)傷技術(shù)正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)Positron Emission Tomography, PET腦功能性磁共振成像術(shù)腦功能性磁共振成像術(shù) Magnetic Resonace Imaging功能性磁共振成像技術(shù)檢測視皮層的功能活動功能性磁共振成像技術(shù)檢測視皮層的功能活動A 未刺激時組織的去氧血紅蛋白比例高；未刺激時組織的去氧血紅蛋白比例高；B. 刺激后組織氧合血紅蛋白增高；刺激后組織氧合血紅蛋白增高；C. 視覺刺激后腦影像視皮層活動區(qū)。視覺刺激后

23、腦影像視皮層活動區(qū)。Onimaru and Homma, J Neurosci, 2003Respiratory Pacemaking Neurons in Parafacial Area突觸前神經(jīng)末梢的遞質(zhì)以量子式釋放，量很微少。突觸前神經(jīng)末梢的遞質(zhì)以量子式釋放，量很微少。因此在進行因此在進行神經(jīng)遞質(zhì)功能測定時，只能用最小而有效神經(jīng)遞質(zhì)功能測定時，只能用最小而有效的劑量模擬神經(jīng)遞質(zhì)的生理功能。的劑量模擬神經(jīng)遞質(zhì)的生理功能。這是與藥理學(xué)方法這是與藥理學(xué)方法明顯的區(qū)別。藥理學(xué)研究可能用很大的劑量，所引起明顯的區(qū)別。藥理學(xué)研究可能用很大的劑量，所引起的效應(yīng)可能與生理效應(yīng)不同甚至相反。的效應(yīng)可能與生

24、理效應(yīng)不同甚至相反。 微電泳（微電泳（microelectrophoresis） 抗體微量注射抗體微量注射 神經(jīng)遞質(zhì)功能測定的生理學(xué)方法神經(jīng)遞質(zhì)功能測定的生理學(xué)方法 定義：定義：借助微電極通過一定的電流將解離物質(zhì)電泳到神經(jīng)元附近，觀察神經(jīng)遞質(zhì)借助微電極通過一定的電流將解離物質(zhì)電泳到神經(jīng)元附近，觀察神經(jīng)遞質(zhì)或其他藥物對該神經(jīng)元的作用?；蚱渌幬飳υ撋窠?jīng)元的作用。 基本原理：基本原理：外加電流通過含解離物質(zhì)溶液的微電極時，將微電極內(nèi)的解離物質(zhì)從外加電流通過含解離物質(zhì)溶液的微電極時，將微電極內(nèi)的解離物質(zhì)從管尖釋放出來。例如微電極接正極，動物頭皮接負極時，帶陽離子的物質(zhì)從微電極管尖釋放出來。例如微電極接正極，動物頭皮接負極時，帶陽離子的物質(zhì)從微電極中釋出。相反，微電極接負極，頭皮接正極時，帶負離子的物質(zhì)從微電極釋出。微中釋出。相反，微電極接負極，頭皮接正極時，帶負離子的物質(zhì)從微電極釋出。微電泳時解離物質(zhì)從微電極釋出量，與它通過的電荷量成正比。因此，通常用微電極電泳時解離物質(zhì)從微電極釋出量，與它通過的電荷量成正比。因此，通常用微電極的電流強度表示解離物質(zhì)的釋放量。的電流強度表示解離物質(zhì)的釋放量。 方法：方法：1）拉制微電極：五管：每管尖端直徑）拉制微電極：五管：每管尖端直徑1-3 m, 五管總直徑五管總直徑510 m.其中，其中，一管為記錄，一管為對照，三管為藥物。一管