HPLC流動相的選擇

1、HPLC日常維護(hù)（三）日常維護(hù)（三）流動相流動相 一、一、 液相色譜流動相的性質(zhì)、要求液相色譜流動相的性質(zhì)、要求理想的液相色譜流動相應(yīng)具有：u低粘度u與檢測器兼容性好u易于得到純品u毒性低等特征。u1. k值是流動相組成的函數(shù) 溶劑強(qiáng)度增加 溶質(zhì)在填料表面的吸附減少 相應(yīng)的容量因子k降低u2. 塔板數(shù)n一般與流動相的粘度成反比。 注意注意: :二、流動相選擇原則二、流動相選擇原則 流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)u 低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料 有時遇到某些有機(jī)相會溶脹或收縮，從而改 變色譜柱填床的性質(zhì)。u堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。u酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附 劑的柱系統(tǒng)。

2、 純度色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。必須與檢測器匹配。u使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。u使用示差折光檢測器時，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。 粘度要低（應(yīng)2cp） 粘度太高時：l會影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效；l還會使柱壓降增加，使分離時間延長；l最好選擇沸點(diǎn)在100以下的流動相。 三、液相色譜流動相的三、液相色譜流動相的pH值值u 1.反相離子抑制技術(shù)： 采用反相色譜法分離弱酸（3pKa7）或弱 堿（7pKa8）樣品時，通過調(diào)節(jié)流動相的 pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在 固定相上的保

3、留，并改善峰形的技術(shù)。u對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大；分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；u分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。 u減尾劑（除尾劑）：流動相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。四、液相色譜流動相的選擇四、液相色譜流動相的選擇 在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。1.正相色譜u在正相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加；u正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。2. 反相色譜u

4、流動相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。u極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其所占比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。u一般情況下，甲醇-水系統(tǒng)是反相色譜最常用的流動相，具有粘度小、價格低的特點(diǎn)。uSnyder推薦采用乙腈-水系統(tǒng)。溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，并可滿足在紫外205nm處檢測的要求，但價格較貴。3.梯度洗脫技術(shù)在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術(shù)。梯度洗脫（梯度洗脫（Gradient Elution）Solvent polarity (composition) continuously

5、varied or stepped梯度洗脫是指在一個分析周期中，按一定的程序連續(xù)改變連續(xù)改變流動相中溶劑的組成組成（如溶劑的極性、離子強(qiáng)度、pH值等）和配比配比，使樣品中的各個組分都能在適宜的條件下得到分離。是分析復(fù)雜混合物特別是分離保留性能相差較大的混合物的極為重要的手段。優(yōu)點(diǎn)：改善峰形，提高柱效 縮短分析時間 強(qiáng)保留成分不易殘留在柱上缺點(diǎn)：會引起基線漂移 有時重現(xiàn)性差 故需嚴(yán)格控制梯度洗脫的實(shí)驗(yàn)條件。五、液相色譜流動相的過濾五、液相色譜流動相的過濾u所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45m（或0.22m）濾過，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標(biāo)簽上標(biāo)明“已濾過”）。u用濾膜過濾時，有機(jī)相

6、濾膜一般用于過濾有機(jī)溶劑，過濾水溶液時流速低或?yàn)V不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。u對于混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，首選有機(jī)相濾膜?，F(xiàn)在已有混合型濾膜出售。 六、液相色譜流動相的脫氣六、液相色譜流動相的脫氣 1.脫氣的必要性u所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。u氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。u溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。u溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結(jié)果帶來誤差。 2.溶解氧的危害

7、（1）對紫外檢測器溶解氧能與甲醇、四氫呋喃等形成有紫外吸收的絡(luò)合物。l此絡(luò)合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低；l會在梯度淋洗時造成基線漂移。（2）對熒光檢測器在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。（3）對電化學(xué)檢測器在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。（4）除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應(yīng)用中的靈敏度。3.脫氣方法u 氦氣脫氣法u 電磁脫氣法u 超聲波脫氣法超聲脫氣優(yōu)點(diǎn)：10-20分鐘已足夠； 不影響溶劑組成。注意：注意：超聲時應(yīng)避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。 七、液相色譜流動相的貯存七、液相色譜流動相的貯存u流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。（許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸