瘧原蟲鏡檢技術 (2)

1、江蘇省寄生蟲病防治研究所江蘇省寄生蟲病防治研究所 顧亞萍顧亞萍瘧原蟲鏡檢技術瘧原蟲鏡檢技術l瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧原蟲的基本形態(tài)特征l血片制作與染色血片制作與染色l瘧原蟲計數(shù)瘧原蟲計數(shù)l顯微鏡的維護與保養(yǎng)顯微鏡的維護與保養(yǎng) 瘧疾是由蚊子傳播的寄生蟲病，它的病瘧疾是由蚊子傳播的寄生蟲病，它的病原體是瘧原蟲。原體是瘧原蟲。 寄生于人體的瘧原蟲有寄生于人體的瘧原蟲有4 4 種種瘧原蟲基本結構瘧原蟲基本結構n瘧原蟲基本構造為瘧原蟲基本構造為核、細胞質（胞漿）和瘧核、細胞質（胞漿）和瘧色素。色素。n原蟲經(jīng)原蟲經(jīng)姬氏姬氏GiemsaGiemsa或瑞氏或瑞氏WrightWright染色：染色： 核核呈呈紅色

2、紅色, ,胞質胞質呈呈蘭色蘭色，瘧色素瘧色素為本色為本色胞漿胞漿瘧色素瘧色素核核瘧原蟲基本結構瘧原蟲基本結構2.2.細胞漿細胞漿 藍色或深藍色，隨著蟲體發(fā)育長大，藍色或深藍色，隨著蟲體發(fā)育長大，細胞漿逐漸增多。細胞漿逐漸增多。瘧原蟲基本結構瘧原蟲基本結構胞胞漿漿瘧原蟲基本結構瘧原蟲基本結構n不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在蟲體內散在分布或聚集成團塊。異，瘧色素在蟲體內散在分布或聚集成團塊。n間日瘧原蟲呈短棒狀，黃褐色；間日瘧原蟲呈短棒狀，黃褐色；n惡性瘧原蟲呈細砂狀，黑褐色；惡性瘧原蟲呈細砂狀，黑褐色；n三日瘧原蟲呈砂粒狀，深褐色；三

3、日瘧原蟲呈砂粒狀，深褐色；n卵形瘧原蟲與間日瘧原蟲相似。卵形瘧原蟲與間日瘧原蟲相似。3.3.瘧色素瘧色素瘧色素瘧色素滋養(yǎng)體期：滋養(yǎng)體期：早期、晚期滋養(yǎng)體早期、晚期滋養(yǎng)體裂殖體期：裂殖體期：未成熟、成熟裂殖體未成熟、成熟裂殖體配子體期：配子體期：雌、雄配子體雌、雄配子體瘧原蟲在瘧原蟲在RBCRBC內內各期形態(tài)各期形態(tài)各不相同各不相同瘧原蟲在紅細胞內按照生長發(fā)育繁殖的階段不同瘧原蟲在紅細胞內按照生長發(fā)育繁殖的階段不同瘧原蟲基本結構瘧原蟲基本結構1.1. 紅細胞不漲大紅細胞不漲大2.2. 1 1個個RBCRBC內內2 2個以上原蟲個以上原蟲常見，環(huán)狀體內可有常見，環(huán)狀體內可有2 2個核個核 3.3.

4、 環(huán)狀體可貼在紅細胞環(huán)狀體可貼在紅細胞邊緣邊緣 4.4. 血片中除血片中除R R、G G外沒有外沒有其他發(fā)育期其他發(fā)育期5.5. 配子體呈新月形或臘配子體呈新月形或臘腸形腸形6.6. 成熟裂殖體約含成熟裂殖體約含16-3216-32個裂殖子，排列不規(guī)個裂殖子，排列不規(guī)則則7.7. 可出現(xiàn)茂氏點可出現(xiàn)茂氏點惡性瘧（惡性瘧（P.falciparumP.falciparum） 鑒定要點鑒定要點1.1. 紅細胞通常漲大紅細胞通常漲大 2.2. 薛氏點明顯薛氏點明顯 3.3. 環(huán)狀體較粗大環(huán)狀體較粗大4.4. 滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足偽足5.5. 血片中可見各期的原蟲血片中可見各期的

5、原蟲形態(tài)形態(tài)6.6. 成熟裂殖體約含成熟裂殖體約含12-2412-24個裂殖子，排列不規(guī)則個裂殖子，排列不規(guī)則 間日瘧（間日瘧（P. P. vivaxvivax ） 鑒定要點鑒定要點1.1. 紅細胞不漲大或略紅細胞不漲大或略小小2.2. 環(huán)狀體環(huán)狀體中等大小，中等大小，核較大，胞漿粗厚核較大，胞漿粗厚3.3. 胞漿不活躍呈帶狀胞漿不活躍呈帶狀形形 4.4. 成熟裂殖體呈菊花成熟裂殖體呈菊花狀狀, ,內含內含6-126-12個裂殖個裂殖子子 5. 雌雄配子體小于雌雄配子體小于 正正 常常 紅細胞，瘧色紅細胞，瘧色 素呈深褐色素呈深褐色 6. ?？刹橐姼麟A段常可查見各階段 的瘧原蟲的瘧原蟲三日瘧（

6、三日瘧（P.malariaeP.malariae） 診斷要點診斷要點卵形瘧（卵形瘧（P. P. ovaleovale） 診斷要點診斷要點1.1. 紅細胞略漲大或正紅細胞略漲大或正常，卵圓形或邊緣常，卵圓形或邊緣呈鋸齒狀呈鋸齒狀2.2. 環(huán)狀體中等大小，環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚核較大，胞漿粗厚3.3. 薛氏點出現(xiàn)較早粗薛氏點出現(xiàn)較早粗大，量多大，量多4.4. 成熟裂殖體約含成熟裂殖體約含6-6-1212個裂殖子個裂殖子 5. 5. ?？刹橐姼麟A段的?？刹橐姼麟A段的 瘧原蟲瘧原蟲 被寄生的紅細胞被寄生的紅細胞 間日瘧原蟲間日瘧原蟲 大小大小 斑點斑點脹大脹大 滋養(yǎng)體期開始滋養(yǎng)體期開始出現(xiàn)薛

7、氏點出現(xiàn)薛氏點( (Schuffners dots )，出現(xiàn)，出現(xiàn)稍晚，鮮紅色，稍晚，鮮紅色，細小數(shù)多細小數(shù)多 惡性瘧原蟲惡性瘧原蟲正常或略縮小正?；蚵钥s小 常見有茂氏點常見有茂氏點(Maurers dots) ，紫褐，紫褐色，粗大數(shù)少色，粗大數(shù)少 三日瘧原蟲三日瘧原蟲正常或縮小正?；蚩s小 常見有齊氏點常見有齊氏點(Ziemanns dots )，淡紅，淡紅色，微細色，微細卵形瘧原蟲卵形瘧原蟲略大或正常略大或正常感染紅細胞感染紅細胞邊緣呈距齒邊緣呈距齒狀狀常見有薛氏常見有薛氏點點,出現(xiàn)較早，出現(xiàn)較早，環(huán)狀體階段環(huán)狀體階段可見，可見，紅色，微粗紅色，微粗瘧原蟲基本結構瘧原蟲基本結構 寄生的紅細胞

8、寄生的紅細胞: : 經(jīng)染色后，因細胞內血紅蛋經(jīng)染色后，因細胞內血紅蛋白溶解，輪廓消失，但有時尚留下殘骸的白溶解，輪廓消失，但有時尚留下殘骸的“影影子子”或點彩。或點彩。 厚血膜由于用血量多，血膜小，細胞重迭，厚血膜由于用血量多，血膜小，細胞重迭，干燥緩慢，各期瘧原蟲的體積都略為縮小，其干燥緩慢，各期瘧原蟲的體積都略為縮小，其中大、小滋養(yǎng)體的形態(tài)有較大改變，裂殖體和中大、小滋養(yǎng)體的形態(tài)有較大改變，裂殖體和配子體的形態(tài)則變化不大。配子體的形態(tài)則變化不大。厚血膜中瘧原蟲的形態(tài)厚血膜中瘧原蟲的形態(tài)：厚血膜惡性瘧原蟲惡性瘧原蟲厚血膜RingsGametocytes間日瘧原蟲間日瘧原蟲 厚血膜厚血膜環(huán)狀體

9、環(huán)狀體配子體配子體滋養(yǎng)體滋養(yǎng)體裂殖體裂殖體 由于在血膜制備過程中由于在血膜制備過程中紅細胞溶解，紅細胞溶解，因而其因而其原形態(tài)消失原形態(tài)消失，且染液和玻片上可能存在，且染液和玻片上可能存在雜質雜質等，等，要根據(jù)瘧原蟲的三個基本要素仔細要根據(jù)瘧原蟲的三個基本要素仔細加以鑒別。加以鑒別。n（1)1)疑似瘧色素疑似瘧色素n（2 2）疑似瘧原蟲核）疑似瘧原蟲核n（3）疑似瘧原蟲胞漿）疑似瘧原蟲胞漿瘧原蟲與其他異物的鑒別瘧原蟲與其他異物的鑒別（4）血液成份與分析）血液成份與分析（5）雜質）雜質-類似瘧原蟲的物質類似瘧原蟲的物質（6） 形態(tài)失常形態(tài)失常 瘧原蟲成份丟失。瘧原蟲成份丟失。 成份增加。成份增加

10、。 形態(tài)改變。形態(tài)改變。 藥物影響。藥物影響。 血片的制作與染色血片的制作與染色 n載玻片的清洗：載玻片的清洗：n新玻片的清洗方法新玻片的清洗方法 用加有洗潔精或洗用加有洗潔精或洗衣粉的熱水洗滌，浸于衣粉的熱水洗滌，浸于95% 95% 的乙醇中的乙醇中1 1小時以上小時以上n已用過的玻片：已用過的玻片：用加有洗衣粉的熱水洗用加有洗衣粉的熱水洗滌，浸于滌，浸于95% 95% 的乙醇中的乙醇中1 1小時以上小時以上 載玻片載玻片 每張載玻片上分別做每張載玻片上分別做1 1個薄血膜，個薄血膜，1 1個厚血個厚血膜。標準血膜的位置如下圖所示。膜。標準血膜的位置如下圖所示。血片制作血片制作 取血液取血液

11、4-5l4-5l 血滴置于載片的中央偏血滴置于載片的中央偏右右1/31/3， 由里向外劃圈涂成直徑為由里向外劃圈涂成直徑為0.8-10.8-1厘米厘米 厚薄均勻、圓形厚血膜厚薄均勻、圓形厚血膜. .血片制作血片制作厚血膜的涂制：厚血膜的涂制：標準的推片姿勢標準的推片姿勢薄血膜的涂制：薄血膜的涂制：取血液取血液1-1.5l1-1.5l血滴置于載玻片的血滴置于載玻片的中央中央，將推片的一端置于血滴之前，當血液在載玻將推片的一端置于血滴之前，當血液在載玻片與推片之間向兩側擴展至片與推片之間向兩側擴展至約約2cm2cm寬寬時，兩時，兩玻片保持玻片保持20-3020-30角，角，推成舌狀薄血膜，推成舌狀

12、薄血膜，長約長約2-2.5CM2-2.5CM。血片制作血片制作血片染色血片染色兩種染色方法兩種染色方法: :n吉氏染色法吉氏染色法n瑞氏染色法瑞氏染色法n常用吉氏染色法常用吉氏染色法血片的染色血片的染色n待血片待血片完全干燥完全干燥后才可染色后才可染色n1 1血膜的固定血膜的固定-甲醇甲醇 吉氏染液：染色方法吉氏染液：染色方法薄血膜經(jīng)甲醇固定干燥后，用薄血膜經(jīng)甲醇固定干燥后，用PH7.0-PH7.0-7.27.2的磷酸緩沖液或蒸餾水將吉氏原液的磷酸緩沖液或蒸餾水將吉氏原液稀釋，稀釋，原液與緩沖液為原液與緩沖液為1:201:20。混勻混勻染色染色20-3020-30分鐘分鐘，晾干鏡檢。晾干鏡檢。

13、厚血膜溶血染色厚血膜溶血染色 放置多時未染色的血片（放置多時未染色的血片（2 2天以上，薄天以上，薄片已用甲醇固定），在染色之前，須在片已用甲醇固定），在染色之前，須在厚血膜上用清水進行溶血，待血膜全部厚血膜上用清水進行溶血，待血膜全部溶解后倒掉，用吉氏染液染色溶解后倒掉，用吉氏染液染色, ,清水漂清水漂洗干凈洗干凈, ,晾干。晾干。n 染色用水和沖洗用水染色用水和沖洗用水npH7.0pH7.0pH7.2pH7.2緩沖蒸餾水效果最佳緩沖蒸餾水效果最佳。n先制備好兩種貯備液先制備好兩種貯備液n貯備液貯備液I 1/15MI 1/15M磷酸氫二鈉（磷酸氫二鈉（NaNa2 2HPOHPO4 4）溶液溶

14、液 n NaNa2 2HPOHPO4 4 9.5 g9.5 gn 蒸餾水蒸餾水 1000 ml1000 mln貯備液貯備液 1/15M 1/15M磷酸二氫鉀磷酸二氫鉀 （KHKH2 2POPO4 4 ）溶液溶液 n KHKH2 2POPO4 4 9.07 g 9.07 gn 蒸餾水蒸餾水 1000 ml1000 mln緩沖蒸餾水配制緩沖蒸餾水配制nPH M/15 NaPH M/15 Na2 2HPOHPO4 4 M/15 KH M/15 KH2 2POPO4 4 DW DW n (ml) ( ml) (ml)n7.0 63 37 900n7.1 68 32 900n7.2 73 27 900n

15、緩沖蒸餾水宜用時緩沖蒸餾水宜用時新鮮配制新鮮配制為好。為好。血片制作注意事項血片制作注意事項（1 1）在制作血片前，首先要核對患者的）在制作血片前，首先要核對患者的 姓名、年齡和住址姓名、年齡和住址（2 2）載玻片必須清潔無油污，理想的薄）載玻片必須清潔無油污，理想的薄 血膜是一層血細胞均勻分布不重血膜是一層血細胞均勻分布不重 疊和空泡，血膜末端呈舌狀。疊和空泡，血膜末端呈舌狀。（3 3）厚血膜厚度以一個油鏡視野內可見厚血膜厚度以一個油鏡視野內可見5-5-1010個白細胞為宜。個白細胞為宜。（4 4）制成的血片在未干前不能傾斜放置，制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要加熱，加熱會

16、使原蟲待其自然干燥，不要加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結果變形，影響鏡檢結果血片制作注意事項血片制作注意事項（1 1）染料溶劑的質量）染料溶劑的質量 （2）染液的新舊）染液的新舊（3）染液稀釋后使用時間）染液稀釋后使用時間原液必須臨用時稀釋，隨配隨用。原液必須臨用時稀釋，隨配隨用。（4）染液的稀釋濃度）染液的稀釋濃度（5）染色時間）染色時間 (6) 染色稀釋用水染色稀釋用水:Ph7.0-7.2 染色質量影響因素染色質量影響因素n（7 7）血膜在制備后應盡量能在當天）血膜在制備后應盡量能在當天染色，染色，一般夏天不超過一般夏天不超過4848小時，冬天小時，冬天也不能超過也不能超過7272小時小

17、時。n新制新制血片染色時厚血膜血片染色時厚血膜無需溶血無需溶血n放置多時的血片放置多時的血片，在染色之前先用清，在染色之前先用清水滴加在水滴加在厚血膜上進行溶血厚血膜上進行溶血. .瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算 計算瘧原蟲密度的三種方法：計算瘧原蟲密度的三種方法： 白細胞原蟲密度計數(shù)法白細胞原蟲密度計數(shù)法 ( (厚血膜厚血膜 WHO)WHO) 半定量計數(shù)法半定量計數(shù)法 ( (厚血膜厚血膜) ) 紅細胞感染密度計算法紅細胞感染密度計算法( (薄血膜薄血膜) )白細胞原蟲密度計數(shù)法白細胞原蟲密度計數(shù)法n鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200200

18、個白細胞中的個白細胞中的瘧原蟲數(shù)，如果原蟲密度較低，可增加白細胞，瘧原蟲數(shù)，如果原蟲密度較低，可增加白細胞，計數(shù)計數(shù)500-1000 500-1000 個。個。n密度單位密度單位: :原蟲數(shù)原蟲數(shù)/ /lln計算公式：瘧原蟲數(shù)計算公式：瘧原蟲數(shù) 計數(shù)的白細胞數(shù)計數(shù)的白細胞數(shù) 患患者每微升血白細胞數(shù)者每微升血白細胞數(shù) = = 瘧原蟲數(shù)瘧原蟲數(shù)/ /ll血。血。n如果不知患者的白細胞數(shù)，則每微升血以如果不知患者的白細胞數(shù)，則每微升血以80008000個個白細胞計數(shù)白細胞計數(shù)( (國際標準國際標準) ) 。瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算厚血膜的瘧原蟲計數(shù)厚血膜的瘧原蟲計數(shù)n從血膜的左上角開始，橫向。從

19、血膜的左上角開始，橫向。n計數(shù)計數(shù)1 1個視野后，每次間隔個視野后，每次間隔5 5個視野個視野, ,再計數(shù)再計數(shù)。厚血膜厚血膜瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地估計出瘧原蟲密度。這種方法簡便，缺點是計數(shù)的瘧估計出瘧原蟲密度。這種方法簡便，缺點是計數(shù)的瘧原蟲數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。原蟲數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。此方法將密度分為此方法將密度分為6 6級：級：1.1.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在1010個以內，記錄實際數(shù)字個以內，記錄實際數(shù)字2.2.全厚血膜查見

20、瘧原蟲數(shù)在全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在1010個以上，但平均每個視個以上，但平均每個視野不到野不到1 1個蟲，記錄個蟲，記錄“少少”3.3.平均每個視野平均每個視野1-51-5個蟲，記錄個蟲，記錄“”4.4.平均每個視野平均每個視野6-106-10個蟲，記錄個蟲，記錄“+”5. 5. 平均每個視野平均每個視野11-10011-100個蟲，記錄個蟲，記錄“+ + ”6. 6. 平均每個視野平均每個視野100100個蟲以上，記錄個蟲以上，記錄“+ + ”。如：如：PvPv R+T+G R+T+G少少半定量計數(shù)法半定量計數(shù)法瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算紅細胞瘧原蟲密度按以下公式計算：紅細胞瘧原蟲密度按以下

21、公式計算：1.1.紅細胞瘧原蟲感染率（紅細胞瘧原蟲感染率（% %）計算）計算 紅細胞原蟲感染率（紅細胞原蟲感染率（% %）= = 瘧原蟲數(shù)瘧原蟲數(shù) 計數(shù)計數(shù)的紅細胞數(shù)的紅細胞數(shù)X 100 X 100 2.2.紅細胞瘧原蟲感染密度計算紅細胞瘧原蟲感染密度計算 紅細胞瘧原蟲密度紅細胞瘧原蟲密度= =紅細胞原蟲感染率紅細胞原蟲感染率X X紅細胞紅細胞數(shù)數(shù)/ /每微升血每微升血 （男性（男性500500萬個萬個/ /ll；女性；女性450450萬個萬個/ /ll） 紅細胞瘧原蟲感染密度計算（薄血膜）紅細胞瘧原蟲感染密度計算（薄血膜）瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算顯微鏡的使用與維護顯微鏡的使用與維護1.1.學習鏡檢瘧原蟲之前，必須熟悉顯微鏡學習鏡檢瘧原蟲之前，必須熟悉顯微鏡的基本構造，使用方法和維修與保養(yǎng)。防的基本構造，使用方法和維修與保養(yǎng)。防止油鏡進灰、進油和發(fā)霉。止油鏡進灰、進油和發(fā)霉。2.2.瘧原蟲的厚薄血片都必須在瘧原蟲的厚薄血片都必須在油鏡油鏡下觀察下觀察，顯微鏡用光要充足。包括顯微鏡用光要充足。包括反光鏡、光圈、反光鏡、光圈、聚光器聚光器要達到油鏡使用的最佳限度。要達到油鏡使用的最佳限度。顯微鏡檢查注意事項顯微鏡檢查注意事項n3. 玻片未加油時觀察標本應按：玻片未加油時觀察標本應按：低低倍倍高倍高倍油鏡油鏡程序。如在加油區(qū)程序。如在加油區(qū)內