抗原或抗體的檢測

1、抗原或抗體的檢測一、檢測的原理借助抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。1 .抗原與抗體的親和力（affinity）抗原抗體的結(jié)合就像酶與底物的結(jié)合，激素與其受體的結(jié)合一樣不是化學(xué)的反應(yīng)，而是非共價鍵的可逆的結(jié)合?？乖瓫Q定簇和抗體分子可變區(qū)互補構(gòu)型，造成兩分子間有較強的親和力?？臻g構(gòu)型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結(jié)合力強弱也不同。互補程度高，則親和力強。此外，反應(yīng)溫度、酸堿度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結(jié)合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結(jié)合力強，即使抗原濃度很低

2、時也有較多的抗體結(jié)合抗原形成免疫復(fù)合物。2 .抗原或抗體外檢測原理根據(jù)抗原抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物的性狀與活性特點，對標(biāo)本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經(jīng)過一段時間，若有免疫復(fù)合物形成的現(xiàn)象發(fā)生，就說明待檢樣品中有相應(yīng)的抗原存在。若無預(yù)期的現(xiàn)象發(fā)生，則說明樣品中無相應(yīng)的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應(yīng)抗體。對抗原或抗體進行定量檢測時，以反應(yīng)中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復(fù)物的濃度呈函數(shù)關(guān)系。（1）根據(jù)免疫復(fù)合物產(chǎn)生的多少來推算樣品中抗原（或抗體）的含量：在一定的反應(yīng)條件下，加入的已知抗體（或抗原）的濃度一定，反

3、應(yīng)產(chǎn)生的免疫復(fù)合物多少與待檢樣品中含有相應(yīng)抗原（或抗體）量成正比。也就是抗體濃度一定時，免疫復(fù)合物越多則樣品中的抗原量也越多?？捎脤嶒炐詷?biāo)準(zhǔn)曲線推算出樣品中抗原（或抗體）的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯(lián)免疫檢測等都屬于這類方法。（2）抗原或抗體效價滴定的原理：當(dāng)抗原抗體復(fù)合物形成多少不能反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)強弱時，就不能以檢測反應(yīng)強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中，把濃度低的反應(yīng)成分（抗原或抗體）的濃度固定，把濃度高的另一種反應(yīng)成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比較3只家兔產(chǎn)生抗體的多少，即滴定3只兔血清抗體效價，可用雙向瓊脂擴散法來滴定，例如將抗體濃度固定，將

4、抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應(yīng)小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現(xiàn)明顯沉淀淺的抗原稀釋度（如甲兔的抗體效價為1/2000,而丙免的是1/8000則可比較出后者比前者產(chǎn)生抗體的效價要高）。也就是表示效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清（抗原）和抗體（免疫兔血清）相比，濃度高，故應(yīng)稀釋抗原。二、抗原或抗體檢測的實用意義1 .抗體檢測的意義檢測抗體可用于評價人和動物免疫功能的指標(biāo)?？贵w用于臨床治療或?qū)嶒炑芯繒r也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關(guān)疾病的診斷有重要意義。2

5、.抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質(zhì)可分為以下四類：（1）各種微生物及其大分子產(chǎn)物：用于傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。（2）生物體內(nèi)各種大分子物質(zhì)：包括各種血清蛋白（如各類免疫球蛋白、補體的各種成分）、可溶性血型物質(zhì)、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學(xué)作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。（3）人和動物細胞的表面分子：包括細胞表面各種分化抗原（如CD抗原）、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關(guān)抗原和腫瘤相關(guān)性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關(guān)的疾病的診斷及發(fā)病機制的研究，均

6、有重要意義。(4)各種半抗原物質(zhì)：某些藥物、激素和炎癥介質(zhì)等屬于小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯(lián)到大分子的載體上，組成人工結(jié)合的完全抗原。用其免疫動物，制備出各種半抗原的抗體，應(yīng)用于各種半抗原物質(zhì)的檢測，例如對某些病人在服用藥物后進行血中藥物濃度的監(jiān)測。對運動員進行服用違禁藥品的檢測，都是應(yīng)用半抗原檢測的方法。三、抗原或抗體檢測的方法由于各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現(xiàn)結(jié)果的現(xiàn)象也不同。最廣泛應(yīng)用方法有下述幾種：(一)沉淀反應(yīng)可溶性抗原與抗體結(jié)合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復(fù)合物。在反應(yīng)體系中出現(xiàn)不透明的沉淀物，這種抗原抗體反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)(precipitationne

7、action)。1 .環(huán)狀沉淀試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小于0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊于上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復(fù)合物沉淀環(huán)，故名為環(huán)狀沉淀試驗(ringprecipitationtest)，此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。2 .單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗(singleimmunodiffusion)是在凝膠中進行的沉淀反應(yīng)。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內(nèi)，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復(fù)合物。當(dāng)復(fù)合物體積增加到

8、一定程度時停止擴散，出現(xiàn)以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關(guān)。本方法簡便，易于觀察結(jié)果，可測定抗原的靈敏度(最低濃度)約為1020g/ml常用于定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需12天才能看結(jié)果(圖1)圖1單向免疫擴散試驗示意圖3 .免疫比濁法當(dāng)抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復(fù)合物，它可使通過液體的光束發(fā)生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復(fù)合物也增多，光散射現(xiàn)象也相應(yīng)加強。免疫比濁法(immunonephelomytry)就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經(jīng)過一段時間，用光散射濁度計(nephel

9、ometry)測量反應(yīng)液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。4,雙向免疫擴散試驗雙免疫擴散試驗(doubleimmunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現(xiàn)23條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析(圖2)。圖2雙向免疫擴散試驗示意圖5 .對流免疫電泳對流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，

10、使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，于負(fù)極側(cè)的孔內(nèi)加入抗原，于正極側(cè)的孔內(nèi)加入抗體，通電后，抗原帶負(fù)電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負(fù)電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負(fù)極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復(fù)合物的沉淀線。只需1小時左右即可觀察結(jié)果。6 .免疫電泳免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適當(dāng)?shù)奈恢蒙涎仉娪痉较蛲谝恢本€形槽，于槽內(nèi)加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應(yīng)抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉淀線

11、。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義(圖3)。原制小孔內(nèi)加入存杓肥清擅搐芹啥雙向丁比肉哈血清中取e-與抗I兇日虎玩圖3免疫電泳法基本步示決圖7 .免疫印跡法免疫印跡法（immunoblotting）又稱為Western印跡法，用于AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場中根據(jù)分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上（電印跡），然后將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕于病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應(yīng)的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復(fù)合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和

12、抗體后，在膜上加標(biāo)記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，最后加入顯色底物（如果抗人Ig是用酶標(biāo)記的）或做放射自顯影（抗人Ig用1251標(biāo)記）以顯示結(jié)果（圖4）。L組際公禺七電印跡阻毀病人曲清:勺小i-Il工加底地（或曝光）使斥記花體顯現(xiàn)圖4用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體第一步：經(jīng)電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離；第二步：將已分離的抗原經(jīng)電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上；第三步：將待檢病人血清加入覆蓋于硝酸纖維膜上；第四步：加入標(biāo)記的第二抗體使之覆蓋膜上；第五步：加入顯色底物（或放射自顯影）顯現(xiàn)第二抗體（二）凝集反應(yīng)細菌、紅細胞或表面帶有抗原

13、的乳膠顆粒等都是不溶性的顆?？乖?dāng)與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原與抗體結(jié)合形成凝集團塊，即稱為凝集反應(yīng)(agglutination)o1 .直接凝集直接凝集(directagglutination)是將細菌或紅細胞與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象?？捎糜趥魅静≡\斷如肥達氏反應(yīng)(Widalreaction)診斷傷寒病?；蚶醚毎F(xiàn)象檢查血型。2 .間接凝集間接凝集(indirectagglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆?；蚣t細胞表面，與相應(yīng)抗體混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。如用丫球蛋白包乳膠顆粒檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人血清中的類風(fēng)濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用于檢測甲狀腺球蛋的

14、抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標(biāo)本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應(yīng)抗原的腦脊液混合，便可發(fā)生凝集，可進行快速診斷。故凝集反應(yīng)即可測定抗原，也可測抗體，方法簡便、敏感。3 .抗球蛋白試驗抗球蛋白試驗(antiglobulintest,coombstest)的原理為間接凝集試驗。例如應(yīng)用于診斷自身免疫溶血性貧血癥時，Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應(yīng)。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結(jié)合價，分子較小(不如IgM結(jié)合價多，分子大)很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經(jīng)抗Ig的作用提高凝集反應(yīng)的靈敏度。

15、(三)補體參與抗原抗體反應(yīng)這一類反應(yīng)主要包括溶血反應(yīng)(hemolyticassay)、補體介導(dǎo)的細胞毒試驗(complementmediatedcytotoxicutytest)及補體結(jié)合試驗(complementfixationtest)。1 .溶血反應(yīng)抗體與紅細胞表面抗原相遇，形成紅細胞-抗體復(fù)合物即可使加入反應(yīng)中的補體活化，導(dǎo)致紅細胞溶解，此方法可用于紅細胞的各種抗原或相應(yīng)抗體的檢測，此法比凝集反應(yīng)敏感。溶血反應(yīng)也是用于抗體分泌細胞即空斑形成細胞(PFC)檢測的原理。2 .補體介導(dǎo)的細胞毒試驗各種有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復(fù)合物能活化反應(yīng)中的補體，引起細胞膜穿孔，在

16、一定時間內(nèi)，細胞仍能維持一定的形態(tài)不破碎，加入水溶性染如伊紅Y(eosinY)或臺盼藍(trypanblue)后，染料即可進入被活化補體穿孔的細胞，不帶相應(yīng)抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此方法可用于帶各種抗原的細胞的檢測，如進行細胞MHC抗原的鑒定，和進行淋巴細胞中T細胞總數(shù)或其亞類的計數(shù)。在一些免疫學(xué)實驗中也可用這種方法，根據(jù)需要特異地消除帶某種抗原的細胞。3 .補體結(jié)合試驗當(dāng)抗原(可溶性或顆粒性)與相應(yīng)抗體結(jié)合，由于濃度低不出現(xiàn)可見反應(yīng)時，應(yīng)用補體結(jié)合試驗可檢出此抗原抗體反應(yīng)，它比凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)靈敏度高。本法包括兩個抗原抗體系統(tǒng)。一為檢測系統(tǒng)由待檢樣品與已知抗原(或抗體)組成；另一

17、為指示系統(tǒng)，由綿羊紅細胞(SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗時試管中先加入檢測系統(tǒng)和補體，混合經(jīng)37c30分鐘使抗原、抗體、補體形成復(fù)合物，再加入指示系統(tǒng)，如出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，說明檢測系統(tǒng)中沒有相對應(yīng)的抗原抗體，補體是游離的指示系統(tǒng)的SRBC和抗體結(jié)合而出現(xiàn)溶血，即為反應(yīng)陰性。如不出現(xiàn)溶血，表明檢測系統(tǒng)中有抗原抗體復(fù)合物并結(jié)合補體，則指示系統(tǒng)無多余的補體作用而沒有溶血現(xiàn)象，即為陽性。在敏感的抗原、抗體檢測方法(如酶標(biāo)方法)出現(xiàn)之前補體結(jié)合試驗曾廣泛用于檢測各種細菌、病毒或螺旋體(如梅毒)的抗原或抗體，由于本試驗影響因素多，結(jié)果不穩(wěn)定現(xiàn)已被新檢測方法所代替。四、用標(biāo)記抗體

18、或抗原進行的抗原、抗體反應(yīng)用熒光素、同位素或酶標(biāo)記抗體或抗原，用于抗原或抗體檢測是目前廣泛應(yīng)用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標(biāo)記物與抗原或抗體化學(xué)連接之后不改變后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位檢測。1.免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechni)是用化學(xué)方法使熒光素標(biāo)記的抗體(或抗原)與組織或細胞中的相應(yīng)抗原(或抗體)結(jié)合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。（1）直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞涂片或組織切片上進行染色，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的熒光抗體，將待檢標(biāo)本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應(yīng)抗原存在，此法可用于病毒

19、感染細胞、帶某種特異抗原的細胞（如T細胞和B細胞）或病原菌的檢查，也可用于組織中沉著的免疫復(fù)合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原，就需分別制備相應(yīng)的多種標(biāo)記抗體。（2）間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復(fù)雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應(yīng)抗體（不標(biāo)記熒光）結(jié)合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒光標(biāo)記的第二抗體，觀察結(jié)果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用于檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體（圖5）。圖5免疫熒光直接法及間接法原理示意圖免疫熒光技術(shù)在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、

20、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標(biāo)志，所以使用熒光標(biāo)記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學(xué)方面的應(yīng)用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀（fluorescene-activatedcellsorting,FACS）,能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫鼠熒光素（FITC）發(fā)黃綠熒光，用羅丹明（TMRITC）發(fā)紅色熒光。由于熒光顏色不同標(biāo)記兩種不同的抗體，對同一細胞進行雙標(biāo)記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應(yīng)用間接熒光法也用于自身免疫病的抗核抗體檢查。2 .放射免疫分析法放射

21、免疫分析法（radioimmunoassayRIA）應(yīng)用競爭性結(jié)合的原理，應(yīng)作放射性同素標(biāo)記抗原（或抗體）與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，通過測定抗原抗體結(jié)合物的放射活性判斷結(jié)果，本方法可進行超微量分析，敏感性高，可用于測定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。本法常用的同位素有125I和131I。放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：（1）液相法：將待檢標(biāo)本（例如含胰島素抗原）與定時的同位素標(biāo)記的胰島素（抗原）和定時的抗胰島素抗體混合，經(jīng)一定作用時間后，分離收集抗原抗體復(fù)合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計算結(jié)合率。在反應(yīng)系統(tǒng)中，待檢標(biāo)本的胰島素抗原與同位素標(biāo)記的胰島素競爭奪戰(zhàn)性與胰島素抗體結(jié)合。

22、非標(biāo)記的抗原越多，標(biāo)記抗原與抗體形成的復(fù)合物越少。非標(biāo)記抗原含量與標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的量呈一定的函數(shù)關(guān)系。預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)的非標(biāo)記抗原作成標(biāo)準(zhǔn)曲線后，即可查出待檢標(biāo)本中胰島素的含量（圖6）。O不忙汜地鼎港C邛槍牙比襤隹充枕律折咽抗那緒含玩注悻抗原抗怖里合物OO*上錯怯中海挹抗原01北Im1甥巾未掠記的抗原港度（ngfitM）圖6液相放射免疫分析法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線（2）固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然后加待檢標(biāo)本，最后加標(biāo)記抗體。測定固相載體的放射活性，常用的固相載體有澳化氟（CNBr）海豹化的紙片或聚苯乙烯小管（圖7）。0工iclontj未稀吧的杭黑濯度(可卜川)圖7固相放射免疫分析法原理放

23、射免疫分析法應(yīng)用范圍廣泛，包括多種激素(胰島素、生長激素、甲狀腺素等)維生素、藥物、IgE等。3 .酶聯(lián)免疫分析法酶聯(lián)免疫分析法(enzymeimmunoassay,EIA)是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物高效催化作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷試驗結(jié)果，可經(jīng)酶標(biāo)測定儀作定量分析，敏感度可達ng水平。常用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase)堿性磷酶(alkalinephosphatase)等。它們與抗體結(jié)合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標(biāo)抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標(biāo)免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內(nèi)的抗原；后者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。Q陣出址就化也布計陽門圖8生物素-酶標(biāo)親合素系統(tǒng)反應(yīng)示意圖(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表