2019年家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀分子解析及分子育種基礎(chǔ)研究

1、項目名稱：家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀分子解析及分子育種基礎(chǔ)研究首席科學(xué)家：夏慶友西南大學(xué)起止年限：2012.1-2016.8依托部門：重慶市科委教育部一、關(guān)鍵科學(xué)問題及研究內(nèi)容1 .擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題根據(jù)國家蠶絲產(chǎn)業(yè)發(fā)展重大需求和蠶業(yè)科學(xué)發(fā)展長遠(yuǎn)需要，以“十一五”家蠶973”項目研究為基礎(chǔ)，“十二五”期間緊緊圍繞家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀，重點解決如下 兩個關(guān)鍵科學(xué)問題：第一：家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀形成的分子機理家蠶因食桑產(chǎn)絲，才可供人類利用，具關(guān)鍵品質(zhì)性狀主要有三：第一，絲蛋 白合成與分泌機制。絲蛋白的組成和結(jié)構(gòu)特征，決定了蠶絲關(guān)鍵品質(zhì)性狀。研究 表明，家蠶絲的各種工藝性狀，包括纖度（繭絲直徑）、繭絲長度、凈度（繭

2、絲 表面結(jié)構(gòu)）、強伸力、抱合力以及解舒性能（絲膠溶解性）等，均受絲腺合成與 分泌機制所調(diào)控；第二，發(fā)育變態(tài)與調(diào)控。家蠶是典型的完全變態(tài)昆蟲，現(xiàn)行蠶 桑生產(chǎn)體系，無不是根據(jù)家蠶生長與變態(tài)發(fā)育特征來安排。 特別重要的是，家蠶 生長與發(fā)育特征（例如個體大小、蛻皮和化蛹時期、成蟲孵化時期）決定了蠶絲 蛋白合成時期與合成量，整體上決定了家蠶的蠶絲生產(chǎn)特性； 第三，對疾病的抵 抗性。家蠶經(jīng)過數(shù)千年人工馴化，盡管獲得了適合群居飼養(yǎng)和發(fā)育整齊等有利于 生產(chǎn)的特性，同時也有大規(guī)模易受病原微生物感染的不利性狀。盡管蠶桑生產(chǎn)過 程中的疾病防控受到高度重視，但每年蠶農(nóng)因蠶感病造成的損失仍然高達(dá) 25% , 并且高居不

3、下。上述三個生理過程（或性狀），是家蠶諸多影響蠶絲產(chǎn)量和品質(zhì) 中最為關(guān)鍵且相互聯(lián)系的因素，決定了蠶絲生產(chǎn)的整體水平與效益， 是本項目將 要解決的第一關(guān)鍵科學(xué)問題。在前一個項目中，家蠶性別決定、絲蛋白合成、發(fā)育和免疫等四大性狀是作 為其中的一個課題來布局的，并打開了關(guān)鍵的突破口。本期項目把性別決定之外的三個性狀上升為三個課題，同時布局家蠶干細(xì)胞與不同組織器官變態(tài)發(fā)育過程中的分子基礎(chǔ)研究，因為干細(xì)胞與組織器官再生與家蠶絲腺發(fā)育、變態(tài)發(fā)育和免疫防御有著重要的密切關(guān)系。根據(jù)已有基礎(chǔ)，家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀形成分子機理研 究的具體科學(xué)問題分別如下：蠶絲蛋白合成機理研究將著重解決絲蛋白基因的分子調(diào)控問題。家蠶幼

4、蟲期共食下鮮桑葉約22g,絲腺合成并分泌約0.5g絲蛋白。研究表明，家蠶絲蛋白合 成調(diào)控有三大主要特點，一是蠶絲合成高效性：家蠶絲腺功能高度特異化，類似 果蠅唾液腺，而絲蛋白質(zhì)的合成主要由數(shù)目極其有限（140余個）的分泌細(xì)胞完 成，這些細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)染色體高度多倍化，可達(dá)到 50100萬單倍基因組。二 是部位特異性：蠶絲由家蠶體腔內(nèi)左右對稱分布的一對絲腺所合成，每條絲腺分前部、中部和后部三個功能區(qū)域，后部和中部分別特異合成家蠶絲素蛋白和絲膠 蛋白等繭絲纖維的主要結(jié)構(gòu)成分； 這種部位特異性決定了蠶絲各組分，尤其是有 效組分絲纖維的所占比例和加工特性。 三是時間特異性：家蠶絲腺細(xì)胞分化于胚 胎發(fā)育

5、時期，盡管早期幼蟲的蛻皮期能夠合成少量蠶絲蛋白，但大量合成絲蛋白并形成絲纖維卻是在末齡幼蟲第 3天開始，具有嚴(yán)格的時間調(diào)控。因此，闡明蠶 絲品質(zhì)性狀機理，主要的科學(xué)內(nèi)涵是回答上述三個特性的分子調(diào)控機制。前期研 究表明，絲蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制是決定絲蛋白合成機制的關(guān)鍵因素。 通過絲腺特異基因的大規(guī)模鑒定和功能研究，初步發(fā)現(xiàn)絲蛋白編碼基因受兩大信 號通路的調(diào)控。一是激素信號通路，主要調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的時間特異性； 二是受發(fā) 育主控基因，即高度保守的同源異型盒（Homeobox）類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子所調(diào)控， 主要決定絲蛋白基因表達(dá)的空間特異性。為此，本期項目將重點研究fib-Hfib-L P25和Se

6、ri3等主要絲蛋白編碼基因受激素信號和發(fā)育主控基因的調(diào)節(jié)機制，以期系統(tǒng)闡明絲蛋白合成分子機理及其與蠶絲品質(zhì)之間的相互關(guān)系激素和營養(yǎng)信號傳導(dǎo)與變態(tài)發(fā)育調(diào)控研究著重解決信號傳導(dǎo)機制。與其它全變態(tài)昆蟲一樣，家蠶的變態(tài)發(fā)育主要受激素（神經(jīng)肽激素、蛻皮激素、保幼激素 和類胰島素等）和營養(yǎng)（氨基酸、糖和脂肪酸等）的協(xié)同調(diào)控。目前知道，當(dāng)家 蠶從一個齡期幼蟲向下一個齡期幼蟲轉(zhuǎn)變時，往往同時有高水平的蛻皮激素（20E）和保幼激素（JH）分泌，使得昆蟲不會發(fā)育成蛹或成蟲（蛾）。而在幼 蟲向蛹期發(fā)育時，體內(nèi)有高水平的蛻皮激素，但保幼激素水平下降，使得幼蟲向 蛹期變態(tài)發(fā)育。因此認(rèn)為，蛻皮激素控制著昆蟲的蛻皮與變態(tài)發(fā)

7、育進(jìn)程；而保幼激素則調(diào)控著昆蟲發(fā)育的方向。所以，蛻皮激素和保幼激素信號傳導(dǎo)系統(tǒng)及其相 互作用是變態(tài)發(fā)育的核心問題。而家蠶生長與發(fā)育特征（例如個體大小、蛻皮和 化蛹時期、成蟲孵化時期）決定了蠶絲蛋白合成時期與合成量。因此，激素和營 養(yǎng)信號傳導(dǎo)對變態(tài)發(fā)育的調(diào)控將極大地影響著蠶絲產(chǎn)量和品質(zhì)。本項目前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠶共計有87種神經(jīng)肽激素、激素受體和激素調(diào)節(jié)相關(guān)基因；鑒定出 18 種對20E敏感的受體和受體型轉(zhuǎn)錄因子。此外，神經(jīng)肽激素基因，包括滯育激 素（DH）、信息素生物合成激活神經(jīng)肽（PBAN）、脂動激素（AKH）、羽化激素 和家蠶素（4K-PTTH）基因也被鑒定。在前一期項目重點開展了家蠶 JH

8、和20E 合成代謝途徑及信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因的鑒定和功能初探的基礎(chǔ)上，本期項目將以絲腺、脂肪體、中腸和表皮等組織器官為主要研究材料，重點研究昆蟲變態(tài)發(fā) 育的激素信號傳導(dǎo)主要途徑和關(guān)鍵調(diào)控分子的作用，揭示激素與營養(yǎng)信號與組織 器官退化和再生的關(guān)系，建立比較完整的家蠶變態(tài)發(fā)育激素與營養(yǎng)調(diào)控的理論體 系和機理模型，以期闡釋昆蟲變態(tài)發(fā)育這一重大的科學(xué)問題。干細(xì)胞與家蠶變態(tài)發(fā)育的組織器官再生機理研究著重解決成蟲組織器官形成中的干細(xì)胞生物學(xué)行為變化及調(diào)控機制。 家蠶變態(tài)發(fā)育期一般指5齡末期幼蟲 至成蟲羽化階段，包括幼蟲-蛹和蛹-成蟲（蛾）的變化過程。在變態(tài)過程中，幼 蟲專性組織如前胸腺、絲腺等迅速退化消亡

9、，中腸、神經(jīng)和脂肪體發(fā)生結(jié)構(gòu)和功 能的轉(zhuǎn)變，翅原基、胸足原基和生殖腺細(xì)胞組織快速分化生長，并發(fā)育為成蟲的器官組織。有關(guān)果蠅的研究表明，干細(xì)胞在變態(tài)發(fā)育期多種成蟲組織器官分化形 成過程中扮演著至關(guān)重要的角色，受到復(fù)雜的各種信號分子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。 干細(xì)胞 與組織器官再生不僅與變態(tài)發(fā)育有密切的關(guān)系，與絲腺發(fā)育和免疫防御也有著重 要的關(guān)系。前期研究我們首先關(guān)注了家蠶中腸干細(xì)胞的鑒定與分化調(diào)節(jié)，在篩查家蠶中腸干細(xì)胞分子標(biāo)記和鑒定變態(tài)發(fā)育過程中的家蠶中腸干細(xì)胞等方面取得 突破進(jìn)展。本期項目將以中腸、血液、神經(jīng)、脂肪體、翅原基等組織器官為主要 材料，系統(tǒng)研究這些組織器官在家蠶變態(tài)發(fā)育中分化形成與再生重建的干細(xì)

10、胞分 子基礎(chǔ)，鑒定目標(biāo)組織器官的干細(xì)胞，揭示干細(xì)胞在相關(guān)組織器官形成或重建過 程中的自我維持與分化行為，闡釋干細(xì)胞分化為相關(guān)組織器官的分子調(diào)控機制， 這是在分子細(xì)胞生物學(xué)水平闡明昆蟲變態(tài)發(fā)育這個重大科學(xué)問題的關(guān)鍵。家蠶免疫調(diào)節(jié)與抗性機理研究將著重解決宿主對病原微生物的模式識別問題。昆蟲體液免疫在抵抗病原微生物侵染中發(fā)揮著最重要的作用。昆蟲體液分子免疫系統(tǒng)主要由模式識別、信號傳導(dǎo)和效應(yīng)因子表達(dá)三個部分組成。 前期項目主 要通過基因組分析和微生物誘導(dǎo)實驗，基本查明了家蠶體液免疫信號傳導(dǎo)過程的 關(guān)鍵基因，系統(tǒng)鑒定了家蠶抗菌肽效應(yīng)因子的組成和功能。研究發(fā)現(xiàn)，家蠶的免疫相關(guān)基因和信號傳導(dǎo)途徑比較保守，與

11、模式生物果蠅的Toll和Imd兩種先天免疫信號途徑應(yīng)答基本一致，但家蠶效應(yīng)因子體系與果蠅相比又具有一定的特殊 性。前期項目還對Toll信號途徑中的Toll受體、SpZzle、MyD88和Tube等，Imd 途徑中的Imd、FADD、IKK和relish等關(guān)鍵基因進(jìn)行了深入研究。作為免疫應(yīng) 答的前哨，昆蟲病原模式識別受體是激發(fā)免疫信號傳導(dǎo)通路和效應(yīng)因子產(chǎn)生的關(guān) 鍵。昆蟲對不同的病原物具有高度特異的模式識別， 剖析昆蟲病原物的模式識別， 也是闡明和提高家蠶抗病性的重要靶標(biāo)。 在前期項目系統(tǒng)鑒定信號傳導(dǎo)和免疫應(yīng) 答體系的基礎(chǔ)上，本期項目將重點研究家蠶對不同專有性病原微生物的模式識別 分子，以及它們在

12、啟動免疫信號通路中的具體功能， 以期闡明家蠶重要病害形成 的機制，尋求新的防御措施。絲蛋白合成的分子調(diào)控作為昆蟲特異基因調(diào)控的研究模式，對昆蟲發(fā)育和分 子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究將提供重要補充作用；激素信號與變態(tài)發(fā)育調(diào)控、干細(xì)胞與 變態(tài)發(fā)育的組織器官再生機理，以及免疫分子機制，更是昆蟲基礎(chǔ)科學(xué)研究的前 沿和熱點。因此，這幾個方面的科學(xué)問題相互聯(lián)系， 不但作為家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀 對蠶絲業(yè)生產(chǎn)舉足輕重，而且也作為昆蟲基礎(chǔ)科學(xué)的重要領(lǐng)域， 對整個昆蟲學(xué)研 究發(fā)展和害蟲防治新策略的產(chǎn)生都具有十分重要的意義。第二：家蠶分子育種理論基礎(chǔ)與技術(shù)體系在“十一五”家蠶973”項目的支持下，許多與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因得

13、 到鑒定，遺傳素材創(chuàng)新基礎(chǔ)平臺建設(shè)也已經(jīng)初具規(guī)模。系統(tǒng)研究家蠶分子育種的 理論體系，并建立相應(yīng)的技術(shù)平臺，培育高產(chǎn)優(yōu)化的家蠶品系，成為下一個五年 計劃必需解決的重點問題。家蠶分子育種理論體系亟需著重解決分子改良靶標(biāo)和實現(xiàn)思路。 家蠶自野蠶 經(jīng)人工選擇和馴化而來，與野蠶祖先相比，家蠶的產(chǎn)絲性能提高近 10倍。1930 年代開始利用一代雜種優(yōu)勢，蠶絲產(chǎn)量比飼養(yǎng)純種又提高了近 20%。自此，家蠶生產(chǎn)能力達(dá)到了一個難以逾越的高峰，使得其后近80年間未見革命性突破。與其它植物或動物生產(chǎn)一樣，家蠶品種也正處于分子改良甚至系統(tǒng)分子育種的前夜，新的突破機遇需要堅實的理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)有遺傳資源中本身就存在著大量發(fā)育

14、、 變態(tài)和抗性突變系。如前所述的三個關(guān)鍵性狀中，家蠶激素調(diào)節(jié)與免疫性狀實現(xiàn) 分子育種的靶標(biāo)位點相對較多，而蠶絲蛋白合成調(diào)節(jié)的靶標(biāo)位點相對較少。初步研究成果表明，通過調(diào)節(jié)絲腺發(fā)育和絲蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄，可能是實現(xiàn)絲產(chǎn)量和 品質(zhì)改良的有效途經(jīng)。本期項目將以前述家蠶幾個關(guān)鍵品質(zhì)性狀的分子解析為基 礎(chǔ)，建立家蠶分子育種的基本思路和策略， 為家蠶品種的分子改良奠定堅實的理 論基礎(chǔ)。家蠶分子育種技術(shù)體系著重解決遺傳互作和基因敲除技術(shù)的建立。從基因?qū)用嬷v，分子育種無外乎有兩個技術(shù)途經(jīng)：一是已有基因功能的加強甚至新功能的 導(dǎo)入；二是已有基因功能的減弱甚至徹底喪失。通過前期項目研究，建立了比較穩(wěn)定和有效的家蠶轉(zhuǎn)基

15、因技術(shù)體系，以及系統(tǒng) RNAi、GAL4/UAS轉(zhuǎn)基因等分子 遺傳操作方法。但是，從家蠶分子育種的技術(shù)儲備和現(xiàn)實要求而言，還丞需建立和完善遺傳互作和基因敲除等關(guān)鍵技術(shù)。為此，本期項目將著重解決：克隆不同發(fā)育時期和組織器官的特異啟動子或順式作用元件，建立多個GAL4轉(zhuǎn)基因系，以實現(xiàn)目的基因的時空特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控；利用 UAS使目的基因功能加強或獲得新 功能，并整合RNAi使目的基因功能消弱或喪失；研究建立 2個UAS元件控制 2個基因的遺傳操控及其互作：2個基因同時獲得功能、2個基因同時喪失功能、 1個基因獲得功能而另1個基因喪失功能；結(jié)合 GAL4/UAS轉(zhuǎn)基因和FRT-FLP mosaic技術(shù)，

16、建立Flp-out mosaic方法，分析在任一組織、任一發(fā)育時期基因獲 得功能或喪失功能的細(xì)胞與外周野生型細(xì)胞的差異。家蠶中至今尚未實現(xiàn)基因的有效定向敲除(knock out)和敲入(knock in),本期項目將通過鋅指核酸酶等方法建立家蠶基因定向敲除和敲入技術(shù)，通過對分子靶標(biāo)的操控實現(xiàn)家蠶基因組的 有效和定向編輯，為家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀基因功能研究和分子改良與素材創(chuàng)新搭建 關(guān)鍵技術(shù)平臺。2 .主要研究內(nèi)容圍繞以上兩個關(guān)鍵科學(xué)問題，計劃從三個方面開展研究：3 1）家蠶重要功能基因的定位克隆前期項目已經(jīng)建立了家蠶突變基因定位克隆平臺技術(shù)，以此為基礎(chǔ)，本期將重點圍繞家蠶絲品質(zhì)、變態(tài)發(fā)育和抗性性狀，

17、定位克隆研究重要的突變基因，在 布局上將分解到三個品質(zhì)性狀相關(guān)的課題開展研究。開展此研究的主要目的在于 保持前沿探索，不斷推動家蠶功能基因組研究的長期和可持續(xù)發(fā)展。4 2）家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀的分子解析從基因?qū)用娼馕黾倚Q絲蛋白合成、激素調(diào)控與變態(tài)發(fā)育、干細(xì)胞分化與組織 器官形成以及分子免疫的分子機制，是本項目的核心和重點之一。因此在布局上， 三個關(guān)鍵性狀以及干細(xì)胞分化與組織器官形成均單獨列為課題開展研究。絲蛋白合成研究將圍繞家蠶絲素重鏈基因（巾b-H）、輕鏈基因（巾b-L）、絲膠基因（Ser1 和P25等蠶絲主要結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理展開，重點研究包括絲腺細(xì)胞發(fā)育與功能分化，絲蛋白編碼基因

18、表達(dá)與激素信號的相互關(guān)系，絲纖維主要組成蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析，各組成蛋白數(shù)量和結(jié)構(gòu)與絲纖維加工工藝性狀之間的關(guān)系 等內(nèi)容。家蠶發(fā)育激素調(diào)控研究將圍繞激素信號傳導(dǎo)體系展開，重點包括激素結(jié)合蛋白或受體及信號傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能研究，蛻皮激素和保幼激素信號傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵調(diào)控因子的相互作用，昆蟲激素與營養(yǎng)調(diào)節(jié)的關(guān)系，以及激素調(diào)節(jié)與家蠶舊組織退化和新組織形成之間的關(guān)系等內(nèi)容。干細(xì)胞與家蠶變態(tài)發(fā)育的組織器官再生機理重點圍繞家蠶變態(tài)發(fā)育中成蟲組織器官形成的干細(xì)胞 基礎(chǔ)展開，重點包括家蠶變態(tài)發(fā)育中特定組織干細(xì)胞的鑒定，組織器官發(fā)生或重建中干細(xì)胞的自我維持與分化行為，干細(xì)胞分化發(fā)育與相關(guān)組織器官的分子調(diào)控

19、 機制等內(nèi)容。家蠶分子免疫研究將圍繞家蠶對專有病原微生物的分子識別展開， 包括家蠶對主要病原微生物侵染的反應(yīng)及病原識別因子的鑒定，免疫應(yīng)答及抗微生物肽表達(dá)調(diào)控，主要病原微生物與宿主的互作，以及抗病和抗逆的分子基礎(chǔ)等 內(nèi)容。5 3)家蠶分子育種理論基礎(chǔ)與技術(shù)體系研究家蠶分子育種理論基礎(chǔ)與技術(shù)體系建立是整個項目的終極目標(biāo)和指引方向， 在布局上列為兩個課題開展研究。理論基礎(chǔ)圍繞家蠶分子改良的分子靶標(biāo)和實現(xiàn) 途徑開展研究，重點包括絲蛋白編碼基因上調(diào)表達(dá)研究， 絲腺組織發(fā)育分子調(diào)控 以及與對產(chǎn)絲量的影響，家蠶激素信號傳導(dǎo)對絲蛋白合成的影響， 家蠶分子免疫 信號調(diào)控與疾病抵抗性的調(diào)節(jié)等主要內(nèi)容，整體上要求

20、明確關(guān)鍵品質(zhì)性狀人為調(diào) 節(jié)的可能環(huán)節(jié)和關(guān)鍵因子，形成家蠶分子育種的理論體系。分子育種技術(shù)體系圍 繞家蠶分子遺傳操 作體系和基因定向敲除技術(shù)開展工作，重點包括利用 GAL4/UAS雙開關(guān)實現(xiàn)目的基因的時空特異調(diào)控，研究2個基因的同步調(diào)控及其 遺傳互作，建立Flp-out mosaic技術(shù)并分析突變體細(xì)胞和野生型細(xì)胞的差異，利 用鋅指核酸酶等技術(shù)實現(xiàn)家蠶基因的定向敲除和基因替換，家蠶基因敲除與轉(zhuǎn)基因技術(shù)的整合和遺傳調(diào)控等內(nèi)容。整體上要求實現(xiàn)可人為干預(yù)任何一個靶標(biāo)基因 功能的分子育種平臺。該兩個課題還將利用整個項目產(chǎn)出的基礎(chǔ)研究成果，創(chuàng)新家蠶遺傳素材，培育新型高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和滿足特殊需求的新品種，推動蠶絲

21、產(chǎn)業(yè)整體 技術(shù)水平和綜合效益的大幅度提升，為國民經(jīng)濟(jì)建設(shè)和蠶農(nóng)增收服務(wù)二、預(yù)期目標(biāo)1 .總體目標(biāo)根據(jù)國家蠶絲產(chǎn)業(yè)發(fā)展重大需求和蠶業(yè)科學(xué)發(fā)展長遠(yuǎn)需要，以十一五”家蠶一”97頷目研究為基礎(chǔ)， 十二 五”期間總體目標(biāo)是：1)充分挖掘利用家蠶 全基因組生物信息學(xué)資源和突變資源，圍繞關(guān)鍵品質(zhì)性狀，尤其是絲蛋白產(chǎn)量和 質(zhì)量性狀，克隆或鑒定重要關(guān)鍵基因，解析其調(diào)控途徑，闡明關(guān)鍵品質(zhì)性狀形成 的分子機理；2)建立和完善家蠶基因調(diào)控和定向敲除等關(guān)鍵平臺技術(shù)，實現(xiàn)完 整的功能喪失和功能獲得等遺傳分析及素材創(chuàng)新必需手段，建立分子育種的理論 基礎(chǔ)和技術(shù)體系，創(chuàng)制新型素材，培育新型品種?？傮w上要求圍繞解決提高蠶絲 產(chǎn)量

22、和質(zhì)量這個具體的科學(xué)和生產(chǎn)問題，取得系統(tǒng)性和標(biāo)志性的重大理論突破， 以推進(jìn)我國蠶絲產(chǎn)業(yè)技術(shù)革命，并進(jìn)一步夯實我國家蠶基礎(chǔ)研究的國際領(lǐng)先優(yōu) 勢，培養(yǎng)造就一批具有國際影響的中青年學(xué)術(shù)帶頭人和技術(shù)骨干。2 .五年預(yù)期目標(biāo)(1)闡明四個機制，形成一個理論基礎(chǔ)，建立一個技術(shù)體系： 以家蠶基因組 和功能基因組學(xué)研究成果為基礎(chǔ)， 通過分子、細(xì)胞和個體水平的系統(tǒng)研究，闡明 家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀形成的分子機制，即家蠶高效特異合成絲蛋白的分子調(diào)控機 制，家蠶激素信號傳導(dǎo)途徑與變態(tài)發(fā)育調(diào)節(jié)機制， 家蠶干細(xì)胞分化形成成蟲組織 器官的分子機制，家蠶分子免疫系統(tǒng)中病原模式識別與抗性形成的分子機制；通過研究，明確家蠶分子改良關(guān)

23、鍵靶標(biāo)和策略模型， 建立完善的家蠶分子育種理論 基礎(chǔ)；建立包括基因敲除等在內(nèi)的家蠶基因遺傳操控和基因組定向編輯技術(shù)，以形成分子育種的完整技術(shù)體系。整體上將家蠶功能基因組研究深化和拓展到系統(tǒng)的性狀分子解析與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用新階段0(2)定位克隆至少25個以上的重要突變基因，通過功能驗證和機理解析揭示新的信號通路或調(diào)控途經(jīng)。(3)深入研究至少25個與絲產(chǎn)量品質(zhì)、變態(tài)發(fā)育激素調(diào)節(jié)、成蟲組織干細(xì)胞發(fā)育分化和抗病性密切相關(guān)的調(diào)控基因，獲取15個左右的關(guān)鍵順式作用元件， 取得基因?qū)＠?0項。(4)創(chuàng)制15個以上的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、強健新型遺傳素材，培育2個標(biāo)志性新蠶品種。(5)出版學(xué)術(shù)專著3部，在國內(nèi)外核心刊物發(fā)表論文

24、300篇，其中有重要影響的論文50篇以上，并發(fā)表35篇有重要理論突破的高水平研究論文； 培養(yǎng)和造就一批中青年學(xué)術(shù)帶頭人和不同層次的科技新人，其中包括碩士研究生200名、博士研究生100名和博士后15名。三、研究方案1 .學(xué)術(shù)思路利用家蠶全基因組序列和高精度遺傳變異圖譜，通過家蠶基因定位克隆、基因敲除和敲入，轉(zhuǎn)基因及RNA干擾等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，以家蠶絲蛋白合成、 變態(tài)發(fā)育激素調(diào)節(jié)、組織器官形成的干細(xì)胞基礎(chǔ)以及分子免疫為目標(biāo)，系統(tǒng)深入 研究關(guān)鍵基因的調(diào)控方式和信號傳導(dǎo)，解析關(guān)鍵品質(zhì)性狀的分子機理；利用 GAL4/UAS系統(tǒng)在特定組織特定時間解析特定基因的功能和調(diào)控；利用鋅指核酸 酶等技術(shù)實現(xiàn)家

25、蠶基因組的定向編輯， 研究建立家蠶分子育種理論和技術(shù)； 通過 對關(guān)鍵分子靶標(biāo)的遺傳操作實現(xiàn)品質(zhì)性狀的分子改造、素材創(chuàng)新和品種育成，奠 定產(chǎn)業(yè)實際應(yīng)用的基礎(chǔ)。同時，使家蠶作為鱗翅目模式昆蟲的研究提升到一個新 的臺階。2 .技術(shù)途徑項目總體采用三條主要技術(shù)路線：一是精細(xì)圖譜一變異圖譜一基因定位，二 是基因功能一調(diào)控機理一性狀形成，三是關(guān)鍵基因一素材創(chuàng)新一產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。具體 如下：(1)精細(xì)圖譜一變異圖譜一基因定位基于家蠶重測序建立的高精度變異圖譜，篩選有效的 SNPs定位標(biāo)記；制作 突變材料作圖群體(BF1或F2),利用經(jīng)典連鎖信息和精細(xì)圖譜，確定多態(tài)型標(biāo) 記；對群體進(jìn)行分子標(biāo)記和性狀之間的連鎖分析，

26、 逐步縮短性狀連鎖區(qū)間至最小 范圍；利用精細(xì)圖譜確定所在區(qū)間候選基因， 通過表達(dá)分析、突變位點分析基因 功能確定突變基因(2)基因功能一調(diào)控機理一性狀形成針對不同基因，設(shè)計不同技術(shù)路線研究基因調(diào)控機理： 絲蛋白編碼基因主要 通過生物信息分析篩選候選順式作用元件，利用DNA 一蛋白質(zhì)結(jié)合技術(shù)鑒定順式作用元件和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，進(jìn)而探索轉(zhuǎn)錄調(diào)控與激素信號等通路之間的聯(lián)系； 激素與發(fā)育相關(guān)基因?qū)⒅饕ㄟ^轉(zhuǎn)基因和 RNAi等技術(shù)，對目標(biāo)基因進(jìn)行功能研 究和調(diào)控分析，以及通過組織和細(xì)胞分離與離體轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)技術(shù)對基因表達(dá)調(diào)節(jié) 和功能在分子、細(xì)胞、器官和個體水平上進(jìn)行研究；干細(xì)胞發(fā)育分化相關(guān)基因主 要通過熒光示

27、蹤鑒定特定組織的干細(xì)胞和尋找干細(xì)胞發(fā)育和分化的關(guān)鍵節(jié)點，結(jié)合基因芯片、基因誘捕、生物信息學(xué)等技術(shù)手段，建立成蟲組織干細(xì)胞的分化調(diào) 控網(wǎng)絡(luò)；免疫相關(guān)基因主要通過 Pull-down等鑒定與病原物結(jié)合的蛋白，通過基 因在細(xì)胞或者個體表達(dá)調(diào)控研究對下游信號通路、抗菌效應(yīng)因子和病原誘導(dǎo)存活 率的影響。(3)關(guān)鍵基因一素材創(chuàng)新一產(chǎn)業(yè)應(yīng)用根據(jù)家蠶分子育種理論和設(shè)計，以 piggyBac為載體，實現(xiàn)有用基因的正向 改良(新功能獲得或加強)，利用轉(zhuǎn)基因RNAi或者鋅指核酸酶技術(shù)，實現(xiàn)基因 功能的反向改良(削弱或者徹底喪失功能)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和GAL4/UAS遺傳 開關(guān)，實現(xiàn)對多個基因同時操作，實現(xiàn)優(yōu)良性狀整

28、合，創(chuàng)制新型素材；通過經(jīng)典 育種程序，選擇穩(wěn)定的品系，育成高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種?？傮w技術(shù)路線如下：3 .創(chuàng)新點與特色(1)重要品質(zhì)性狀關(guān)鍵基因作用機理及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)性解析重點抓住蠶產(chǎn)量和品質(zhì)關(guān)鍵，通過絲編碼基因調(diào)控機理、變態(tài)發(fā)育激素調(diào)控、成蟲組織干細(xì)胞發(fā)育分化和免疫與抗性四個密切相關(guān)的課題，系統(tǒng)并深入解析家蠶重要品質(zhì)形成的關(guān)鍵基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 因此，從整體上講，本項目是在完整基 因組生物信息學(xué)基礎(chǔ)上，將首次實現(xiàn)生物信息學(xué)、基因組學(xué)和功能基因組學(xué)等大 規(guī)模分析平臺與分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)等分析方法的有機結(jié)合，高起點、高通量、高效率地解剖決定重要品質(zhì)性狀的關(guān)鍵途徑的機理，將系統(tǒng)地揭示家蠶特有的

29、和區(qū)別于其它昆蟲、動物和植物的基因作用方式。(2)突破分子育種理論和技術(shù)關(guān)鍵其它昆蟲(主要是害蟲)的基礎(chǔ)研究主要以控制和防治為目的， 而本項目的 主要目標(biāo)集中于有效利用，具有特殊性。項目將率先建立家蠶分子育種理論和技 術(shù)體系，實現(xiàn)素材創(chuàng)新和育種。與蠶絲產(chǎn)業(yè)技術(shù)傳統(tǒng)研究相比， 具有理論上的先 進(jìn)性、技術(shù)方法的現(xiàn)代性和研究方案的高效性，將突破傳統(tǒng)育種無法逾越的障礙， 推動蠶絲業(yè)技術(shù)革命并奠定長遠(yuǎn)可持續(xù)發(fā)展基礎(chǔ)。(3)推動家蠶作為昆蟲研究模式的發(fā)展項目所重點涉及的家蠶絲蛋白合成、發(fā)育變態(tài)激素調(diào)節(jié)、成蟲組織干細(xì)胞發(fā) 育分化和免疫抗性的分子機理研究等內(nèi)容，在理論上屬于昆蟲科學(xué)前沿性重大科 學(xué)問題。另一方

30、面，與小鼠、線蟲、果蠅、斑馬魚、擬南芥等其它模式生物相比， 現(xiàn)代昆蟲學(xué)研究還缺乏一種重要的模式昆蟲， 其主要障礙之一是缺乏有效的、專 一的、定向的和可控的基因敲除與敲進(jìn)等遺傳操控技術(shù)體系。通過本項目將回答昆蟲學(xué)前沿科學(xué)問題的同時，建立家蠶有效的遺傳操控技術(shù)體系， 突破家蠶昆蟲 模式化道路中的關(guān)鍵瓶頸，有力推動家蠶這一中國果蠅”基礎(chǔ)研究的快速發(fā)展。4 .可行性分析項目承擔(dān)單位近年來共完成家蠶相關(guān)研究項目 70余項，包括1項“ 97頌?zāi)俊?10項“86頌?zāi)俊?5項 九五”和 十五”重大科技攻關(guān)項目、4項國家自然科學(xué)基 金重點項目和40余個面上項目，完成了項目的基礎(chǔ)積累。特別是 十一五”期間 認(rèn)真執(zhí)

31、行“97琛蠶項目，至少在三個方面奠定了本項目的重要基礎(chǔ)：一是集中 了全國優(yōu)勢力量，形成緊密的分工協(xié)作研究框架，通過引進(jìn)和培養(yǎng)形成了一支強 有力的研究隊伍；二是各個承擔(dān)單位建設(shè)了高水平的研究平臺， 并形成了各自的 特色和優(yōu)勢；三是完成了前一期項目各項研究任務(wù)，建立了較為完善的平臺技術(shù)， 關(guān)鍵性狀研究取得了突破。特別是，本期項目及時吸納了從國外回國的華南師范 大學(xué)馮啟理教授和中科院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所李勝研究員 兩個優(yōu)秀團(tuán)隊以及多名學(xué)術(shù)骨干，進(jìn)一步加強了傳統(tǒng)家蠶研究力量與模式昆蟲（果蠅）和害蟲防治研究力量的交叉整合，研究力量得到大幅度提升。在工作保障方面，先后召開了多次全國性家蠶基

32、礎(chǔ)研究討論會， 統(tǒng)一了學(xué)術(shù) 認(rèn)識和研究思路，確立了有機的整體方案，形成了有效的協(xié)作機制。各成員單位 均開展了具體的前期研究。通過國際學(xué)術(shù)交流和國際合作項目，與世界高水平研 究機構(gòu)建立了穩(wěn)定的合作關(guān)系，為本項目的開展提供了良好的國際合作空間。 此 外，通過農(nóng)業(yè)部行業(yè)技術(shù)體系，建立了國家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心和技術(shù)研發(fā)服 務(wù)網(wǎng)絡(luò)，將有力支撐本項目成果的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用。 我們相信，通過立項，集成優(yōu)勢， 緊密合作，完全可以在家蠶基礎(chǔ)研究上做出更大更出色的標(biāo)志性成果，為絲綢之路增添異彩，為中華民族產(chǎn)業(yè)的發(fā)展做出歷史性貢獻(xiàn)。5 .課題設(shè)置按總體研究目標(biāo)和思路，將本項目分解為6個課題進(jìn)行，具體目標(biāo)和主要研 究內(nèi)容

33、如下：課題1:蠶絲蛋白合成分子調(diào)控與蠶絲品質(zhì)形成機理解析研究目的：定位克隆與產(chǎn)絲量和絲品質(zhì)相關(guān)的重要突變基因，探明家蠶發(fā)育主控信號對家蠶前部、中部和后部絲腺發(fā)育與細(xì)胞功能的異化關(guān)系，剖析蠶絲蛋 白編碼基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控機制，闡釋決定家蠶產(chǎn)絲量和蠶絲主要工藝性狀 形成的分子機理。該課題為項目的核心。研究內(nèi)容:（1）家蠶產(chǎn)絲量和絲品質(zhì)相關(guān)突變基因克隆與功能研究一個新突變基因的獲得，往往會導(dǎo)致一條控制重要生物性狀的新機制的發(fā) 現(xiàn)。在長期自然和人為選擇過程中，積累了大量的家蠶突變品系，有關(guān)突變基因 遺傳研究基礎(chǔ)相當(dāng)扎實。在這些家蠶突變資源中，報道與蠶絲合成相關(guān)的近30個品系，其中相當(dāng)一部分都保存至

34、今，彌足珍貴。其中，與蠶絲產(chǎn)量相關(guān)的有 5 個，包括薄紙繭（flc, 3連鎖群-49.0座位（下同），后部絲腺分泌能力低下）、裸 蛹（Nd, 25-0.0,不分泌絲素）、絲膠繭（Nd-s, 14-19.2,絲素輕鏈不能合成） 和裸蛹b （Nd-b,遺傳座位未知，絲腺退化）等；與蠶絲品質(zhì)相關(guān)的有5個，綿繭（Fl, 7-32.1,繭層浮松）和軟繭（Sc,遺傳座位未知，繭層柔軟似綿）等； 與蠶繭顏色相關(guān)的有12個，包括黃色、綠色、銹色等系列；與蠶營繭行為相關(guān) 的有4個，包括破風(fēng)繭和吐平板絲等。上述突變除裸蛹（ Nds）基因已被定位克 ?。ň幋a基因外顯子）外，其余突變基因和機制都不清楚。如能分離克隆這

35、些突 變基因，極有可能為家蠶絲蛋白合成研究和分子機制研究打開突破口。前期項目重點建立了基于SNP標(biāo)記的圖位法克隆體系，并已經(jīng)克隆或者精細(xì)定位了5個突變基因，其中包括與繭絲產(chǎn)量相關(guān)的裸蛹基因（Nd）和品質(zhì)相關(guān)突變綿繭基因（Fl）,均已被鎖定到數(shù)百K距離，候選基因不超過10個。這兩個突變具 有重要的研究價值：首先，這兩個突變基因座位都與具體的編碼基因相去甚遠(yuǎn)， 因此不可能是編碼基因突變；其次，從候選基因的情況看，推測與激素和絲腺細(xì) 胞發(fā)育信號相關(guān)。因此，本期項目將選一些與產(chǎn)量和質(zhì)量相關(guān)重要突變，配制定位材料，通過高密度 SNP標(biāo)記，精細(xì)定位并分離克隆突變基因，重點通過對突 變性狀產(chǎn)生的分子機理研究

36、，尋找家蠶絲蛋白合成調(diào)控中的信號通路， 探索其與蠶絲產(chǎn)量和品質(zhì)形成的關(guān)系(2)家蠶絲腺發(fā)育調(diào)控與絲蛋白編碼基因表達(dá)的空間特異性家蠶絲腺是起源于外胚層的器官，發(fā)生在胚子最長期和反轉(zhuǎn)期。絲腺細(xì)胞僅 在胚胎期發(fā)生10次細(xì)胞分裂。幼蟲期，絲腺細(xì)胞不再發(fā)生分裂，至5齡后期，一個絲腺細(xì)胞核內(nèi)DNA的復(fù)制次數(shù)達(dá)到2930次，細(xì)胞核內(nèi)的DNA量增加至 107仙g和214仙g分別相當(dāng)于原來的54萬倍或108萬倍。以滿足后期絲蛋白大量 合成的需要。絲腺細(xì)胞分化不但形成了功能特異的前、中和后部三個部分，而且決定了絲 蛋白編碼基因表達(dá)的空間特異性。 項目將研究胚胎期絲腺細(xì)胞形成和分化， 研究 不同絲腺部位分子結(jié)構(gòu)特征

37、與功能的關(guān)系。絲蛋白編碼基因存在著一些關(guān)鍵的順 式作用元件，我們將重點研究絲蛋白編碼基因順勢作用元件Pax4、Pax6、FOX類的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的功能。挖掘未知轉(zhuǎn)錄因子對絲蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 關(guān)系，鑒定家蠶絲蛋白編碼基因與轉(zhuǎn)錄空間特異性相關(guān)的順式作用元件，以闡明家蠶絲蛋白合成空間特異性的分子機制，并探索通過轉(zhuǎn)錄因子或者順式作用元件 的改造，提高絲產(chǎn)量或者改變蠶絲組分的可能性。(3)家蠶絲腺發(fā)育調(diào)控與絲蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄的時期特異性形成機理家蠶在孵化之后，就具有合成少量絲蛋白的能力。幼蟲各個生長齡期后部絲 腺都能檢測到絲素mRNA的轉(zhuǎn)錄；但是在眠期卻沒有絲素 mRNA表達(dá)，表現(xiàn)為 反復(fù)的 開

38、與關(guān)”特征。當(dāng)幼蟲發(fā)育到末齡第3天，絲腺開始大量合成絲蛋白，直 至幼蟲期結(jié)束，絲蛋白充滿整個絲腺腔體，以后則進(jìn)入吐絲營繭期，表明家蠶絲 蛋白合成具有嚴(yán)格的時期特異性。 絲纖維三個組要組分，即絲素重鏈 H、絲素輕 鏈L和P25具有嚴(yán)格的比例(H:L:P25=6:6:1),這是形成絲素蛋白小體并最終形成絲纖維的決定性因素，表明不同絲蛋白編碼基因的表達(dá)量調(diào)控具有協(xié)調(diào)性。目前為止，已發(fā)現(xiàn)了幾個絲腺特異因子，如SGF-1和SGF-3,它們參與了絲膠基因 及絲素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。但其它幾個重要的轉(zhuǎn)錄因子，如SGF-2、SGF-4及PSGF 等卻還未鑒定，它們很可能與絲素基因調(diào)控相關(guān)。 前期項目在絲蛋白編碼基

39、因上 游鑒定了兩個與轉(zhuǎn)錄因子 BR-C Z4和BR-C Z1結(jié)合的重要位點。BR-C是一個含 有BTB蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域及1-4個鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，具有4種蛋白異構(gòu)體， 它是蛻皮激素的重要初級反應(yīng)基因，并對家蠶的蛻皮和變態(tài)期基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起 著重要的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，BR-C的表達(dá)時期與絲蛋白的表達(dá)時期是相反的， 很可能與絲蛋白基因的上游結(jié)合位點序列結(jié)合，抑制絲素基因在眠期的表達(dá)。以 此為基礎(chǔ)，本期項目將重點研究家蠶絲蛋白主要編碼基因上游順式作用元件與激 素信號系統(tǒng)之間的相互作用關(guān)系，結(jié)合本項目課題3,研究激素受體及各下游應(yīng)答因子對絲蛋白合成的調(diào)控作用機制，闡明家蠶絲蛋白合成的時期特異性和不同

40、絲纖維蛋白組分協(xié)同調(diào)控性對產(chǎn)絲量的影響。(4)家蠶絲產(chǎn)量和絲品質(zhì)形成機理一般認(rèn)為，家蠶產(chǎn)絲能力受多個基因調(diào)控并具有伴性遺傳特征，而部分繭絲品質(zhì)具有較高的遺傳力。本部分研究將產(chǎn)絲量和品質(zhì)形成機制的闡明作為重點， 主要包括三個研究內(nèi)容：首先是定位和克隆產(chǎn)量主性狀候選基因。家蠶的產(chǎn)絲性狀主要包括繭重、繭層量和繭層率等指標(biāo)，是長期以來育種工作的主要選擇對 象，雖然有不少提高但機制形成不明。前期項目中，我們利用高產(chǎn)品種菁松”和低產(chǎn)品系 蘭10”為材料，通過自交，分別得到這兩個品系20代以上的自交系。 然后利用近19萬個SNP位點，對該材料進(jìn)行了全面掃描，初步獲得了全繭重、 繭層量和絲長等性狀顯著密切相關(guān)

41、的 QTL位點，而繭層率也具有潛在的QTL位點。本期項目將在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步加大樣本數(shù)量和標(biāo)記密度， 對主要產(chǎn)量性狀 主效QTL進(jìn)行精細(xì)定位，并克隆分離主要基因或者調(diào)控區(qū)域，通過分子生物學(xué) 手段，研究這些基因或者調(diào)控序列對家蠶產(chǎn)絲量的影響和作用機制。其次是解析蠶絲主要成分蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。 盡管我們知道蠶絲纖維由絲素重鏈 H、絲素輕 鏈L和P25蛋白所組成，但是對有關(guān)蛋白空間結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)相互作用卻 毫不知情。日本提出了這三種蛋白的初步構(gòu)象關(guān)系(絲蛋白小體結(jié)構(gòu)模式)，但 缺乏結(jié)構(gòu)生物學(xué)證據(jù)。絲纖維結(jié)構(gòu)成為了懸而未決的世界難題。 前期項目我們克 隆了絲素重鏈N段序列，并獲得了其編碼蛋白的高

42、分辨率晶體結(jié)構(gòu)，首次發(fā)現(xiàn) 了其立體結(jié)構(gòu)以B片層為主，并初步提出了絲纖維空間構(gòu)象。 以此為基礎(chǔ)，本期 項目將解析主要成分蛋白，包括絲素重鏈 H、絲素輕鏈L和P25的晶體結(jié)構(gòu)， 不但破解這一世界難題，而且將探索絲蛋白空間結(jié)構(gòu)與物理、 化學(xué)特性之間的關(guān) 系，探索絲蛋白結(jié)構(gòu)與蠶絲加工工藝性狀之間的關(guān)系。以結(jié)構(gòu)生物學(xué)為指導(dǎo)，還將探索改變蠶絲蛋白編碼基因或者蛋白質(zhì)組分，以改進(jìn)蠶絲工藝缺陷，開發(fā)新功能的可能途經(jīng)。第三是分析影響產(chǎn)絲產(chǎn)量和質(zhì)量的其它重要因素。 前期項目中，通過構(gòu)建不 同家蠶品系和野蠶全基因組高精度遺傳變異圖譜，共計鑒定了 354個與產(chǎn)絲性狀 相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因作為馴化的候選基因。特別重要的是

43、，分析發(fā)現(xiàn)了若干與產(chǎn)絲性狀相關(guān)的人工選擇印記，其中有 4、32和54個基因分別在絲腺、中腸和 精巢中高量表達(dá)。在絲腺表達(dá)基因中，絲腺特異因子-1 (Sgf-1)是與果蠅Fkh同源的一個基因，Sgf-1調(diào)控家蠶絲膠-1基因編碼的絲膠蛋白和三個分別編碼絲 素重鏈、輕鏈和fhx/P25絲素基因的轉(zhuǎn)錄。另一個家蠶絲腺高量表達(dá)的基因是 BG舊MGA005127 ,與果蠅sage基因同源。它在高絲量品種中的含量是常規(guī)品系大造”的4倍。在果蠅中，F(xiàn)kh和sage分別協(xié)調(diào)控制絲膠基因SG1和SG2的轉(zhuǎn) 錄，它們在絲膠蛋白的合成和分泌中起著重要的作用。 本期項目將重點探討這些 候選基因在蠶絲產(chǎn)量和品質(zhì)形成中的重

44、要作用， 綜合上述各方面的研究成果，探 索家蠶較之野蠶產(chǎn)絲能力和絲品質(zhì)差異的主要分子機制。五年預(yù)期目標(biāo)：(1)絲腺突變基因的定位克隆。定位克隆至少 9個與絲腺突變相關(guān)基因， 完成包括這些基因在內(nèi)的 9個與絲產(chǎn)量和絲品質(zhì)密切相關(guān)的調(diào)控基因的功能研 究，解析突變性狀產(chǎn)生的分子機理，揭示家蠶絲蛋白合成調(diào)控中的信號通路及其 與蠶絲產(chǎn)量和品質(zhì)形成的關(guān)系。(2)闡明家蠶絲蛋白合成時空特異性的分子機制。包括家蠶絲蛋白合成空 間特異性和時期特異性的分子機制，以及不同絲纖維蛋白組分協(xié)同調(diào)控性對產(chǎn)絲 量的影響；獲取5個左右的關(guān)鍵順式作用元件，并探索通過轉(zhuǎn)錄因子或順式作用 元件的改造，提高絲產(chǎn)量或改變蠶絲組分。(3

45、)闡明家蠶絲產(chǎn)量和絲品質(zhì)形成機理。對主要產(chǎn)量性狀主效QTL進(jìn)行精 細(xì)定位，克隆獲得主要基因或者調(diào)控區(qū)域，探明這些基因或調(diào)控序列對家蠶產(chǎn)絲 量的影響和作用機制；解析絲素重鏈 H、絲素輕鏈L和P25的晶體結(jié)構(gòu)，探明 絲蛋白空間結(jié)構(gòu)與物理、化學(xué)特性以及與蠶絲加工工藝性狀之間的關(guān)系；分析與產(chǎn)絲性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因在蠶絲產(chǎn)量和品質(zhì)形成中的重要作用，探明家蠶較之野蠶產(chǎn)絲能力和絲品質(zhì)差異的主要分子機制?？傮w上闡明決定家蠶產(chǎn)絲量和 蠶絲主要工藝性狀形成的分子機理，探索通過改變蠶絲蛋白編碼基因或蛋白質(zhì)組 分，改進(jìn)蠶絲工藝缺陷，開發(fā)新功能的可能途經(jīng)，為進(jìn)一步的分子育種奠定理論 基礎(chǔ)。(4)取得基因?qū)＠?項；出

46、版專著1部，在國內(nèi)外核心刊物發(fā)表論文 55篇，其中有重要影響的論文10篇以上，發(fā)表1篇有重要理論突破的高水平研究 論文。(5)培養(yǎng)和造就一批中青年學(xué)術(shù)帶頭人和不同層次的科技新人，其中包括碩士研究生35名、博士研究生15名和博士后2名。經(jīng)費比例：17.32%承擔(dān)單位：浙江大學(xué)、西南大學(xué)、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：鐘伯雄學(xué)術(shù)骨干：繆云根、劉春、孟艷、李衛(wèi)芳課題2:家蠶激素和營養(yǎng)信號傳導(dǎo)與變態(tài)發(fā)育調(diào)控研究研究目的：重點研究家蠶變態(tài)發(fā)育的昆蟲激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要途徑和關(guān)鍵調(diào)控分子的作用，揭示激素調(diào)控與營養(yǎng)代謝及其與器官退化和再生的關(guān)系，比較完整地建立關(guān)于家蠶變態(tài)發(fā)育的理論體系和機理模型以解

47、釋昆蟲變態(tài)發(fā)育這個重大 的科學(xué)問題，促進(jìn)通過控制變態(tài)發(fā)育以提高家蠶蠶絲產(chǎn)量和質(zhì)量的技術(shù)和策略的 發(fā)展及應(yīng)用，并為以變態(tài)發(fā)育相關(guān)基因和蛋白為分子靶點進(jìn)行鱗翅目害蟲的生物 防治和研制新型殺蟲劑的發(fā)展策略提供理論依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)。研究內(nèi)容：(1)蛻皮激素和保幼激素協(xié)同調(diào)控家蠶變態(tài)發(fā)育的分子機制幼蟲蛻皮時，血淋巴中同時有高水平的蛻皮激素(20E)和保幼激素(JH); 而在幼蟲-蛹變態(tài)時，血淋巴中只有高水平的蛻皮激素，而保幼激素水平較低?？傮w而言，蛻皮激素控制著昆蟲的蛻皮與變態(tài)發(fā)育進(jìn)程，而保幼激素控制著昆蟲發(fā)育的方向。所以，蛻皮激素和保幼激素信號傳導(dǎo)途徑及其分子互作是變態(tài)發(fā)育 的核心問題。前期項目已經(jīng)完成

48、了家蠶變態(tài)發(fā)育期基因表達(dá)譜的全基因組芯片分 析，并著重分析了家蠶20E和JH合成代謝途徑相關(guān)的基因，以及20E和JH信號傳 導(dǎo)途徑相關(guān)基因的功能。已克隆獲得激素受體 EcR-A、EcR-B和USP-1、USP-牙口 轉(zhuǎn)錄因子 HR3、HR39、BR-C-Z4、B FT-F1、E75A E75B、E75C等基因，并分 析了這些基因在不同時期和組織中的表達(dá)情況，初步明確了這些基因表達(dá)的時空 特征與20E的滴度變化以及與變態(tài)發(fā)育調(diào)控的關(guān)系。本期項目將以家蠶絲腺、脂肪體、中腸和表皮為主要研究材料，闡明20E和JH的信號傳導(dǎo)途徑及其分子互作，這兩種激素如何協(xié)同決定家蠶的變態(tài)發(fā)育。 主要內(nèi)容包括：1）比較

49、家蠶蛻皮與變態(tài)過程的基因表達(dá)特征，鑒定差異表達(dá)基 因并探究其與20E或JH應(yīng)答關(guān)鍵因子作用的關(guān)系，闡釋其在兩種不同蛻皮與變 態(tài)形式中的分子作用；2）基于家蠶眠性突變基因品系和家蠶分子標(biāo)記（SNP或 SSR）連鎖圖譜，通過定位克隆技術(shù)，對家蠶眠性突變材料與正常品種的回交群 體及親本進(jìn)行分子標(biāo)記連鎖分析，鎖定眠性突變區(qū)域，分離克隆眠性突變基因， 詳細(xì)分析其在眠性形成（幼蟲蛻皮）中的功能；闡明咪唾類激素誘導(dǎo)家蠶眠性變 化機制，明晰家蠶眠性變化過程中和二眠化后，20E和JH合成及作用相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)譜變化規(guī)律；3）基于家蠶化性突變基因品系，分離克隆家蠶化性 決定基因，探討其與20E的作用關(guān)系及其在

50、化性調(diào)節(jié)中的分子作用機理；4）對家蠶中眠性和化性突變體基因、JH和20E合成途徑（如JHAMT ）和信號傳導(dǎo)途 徑（如MET）中的一些關(guān)鍵基因進(jìn)行 RNAi、基因敲除和轉(zhuǎn)基因研究；5）家蠶 JH和20E的信號傳導(dǎo)和分子互作。發(fā)現(xiàn) MET與20E受體形成超級受體復(fù)合體， 探究MET與EcR-USP的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，闡釋MET如何參與JH和20E 信號、如何橋接JH和20E信號傳導(dǎo)的分子互作；6） JH和20E信號傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)倚Q絲腺發(fā)育和蠶絲產(chǎn)量的調(diào)控；7）研究調(diào)控蛹期專一表達(dá)的表皮蛋白基因的調(diào)控，如JH和20E兩個激素信號系統(tǒng)對蛹期專一轉(zhuǎn)錄因子 BR-C和其上游調(diào)控基因

51、 met gce和Kr-h1等的調(diào)控；研究BR-C轉(zhuǎn)錄因子對其 下游轉(zhuǎn)錄因子POUM2和 FTZ-F1的調(diào)控作用的分子機理；分離和鑒定與轉(zhuǎn)錄 因子POUM2結(jié)合的核蛋白，研究其在表皮蛋白基因?qū)Ｒ槐磉_(dá)調(diào)控中的作用。（2）類胰島素和營養(yǎng)信號傳導(dǎo)途徑與家蠶個體大小和產(chǎn)絲量關(guān)系的分子機 理昆蟲個體大小主要由生長持續(xù)時間和生長速度兩個因素所決定。蛻皮激素和保幼激素協(xié)同調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育，并決定昆蟲生長持續(xù)時間。而胰島素和營養(yǎng)（氨 基酸和葡萄糖）信號及其傳導(dǎo)途徑控制細(xì)胞分裂、長大、分化、死亡，并最終決 定生長速度。這些激素和營養(yǎng)信號相互作用，最終共同決定個體大小。胰島素激 活Ras-MAPK和PI3K-Ak

52、t兩條信號傳導(dǎo)途徑，激活 TOR信號；同時，葡萄糖 和氨基酸等營養(yǎng)信號提高 ATP/AMP的比例，解除LKB-AMPK信號對TOR活性 的抑制作用，最終促進(jìn)細(xì)胞的生長和分裂。這樣，在激素和營養(yǎng)兩方面的共同作 用下，影響了家蠶個體大小及產(chǎn)絲量。我們的研究發(fā)現(xiàn)，家蠶的類胰島素和營養(yǎng)信號對脂肪體器官重建的重要調(diào)控作用。類胰島素信號傳導(dǎo)途徑中InR和IRS 等大多數(shù)基因的表達(dá)水平在蛻皮和化蛹等非攝食時期顯著上升。在蛻皮和化蛹時期，20E降低攝食而誘導(dǎo)饑餓產(chǎn)生，并誘導(dǎo)脂肪體中脂酶Brummer表達(dá)和促進(jìn)脂肪降解。另外，在蛻皮和化蛹時期，20E和饑餓抑制類胰島素信號（Akt磷酸 化水平）和TOR活性（4E

53、BP和S6K磷酸化水平），導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子FOXO定位在 細(xì)胞核內(nèi)，并誘導(dǎo)InR、IRS和Brummer的表達(dá)。本期項目將重點研究家蠶的絲腺、 脂肪體、中腸和表皮等重要器官在蛻皮和 變態(tài)發(fā)育過程中營養(yǎng)和能量分配過程及昆蟲激素通過關(guān)鍵分子對這些過程的調(diào) 控作用。主要內(nèi)容包括：1） FOXO對InR和Brummer的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；2） 20E和 JH與PI3K-TOR信號之間的分子互作，以及 PI3K-TOR信號對家蠶變態(tài)發(fā)育和 蠶絲產(chǎn)量的分子調(diào)控；3）激素和營養(yǎng)信號對脂肪體 PCD的調(diào)控；4）轉(zhuǎn)基因和 基因敲除營養(yǎng)途徑中關(guān)鍵因子以改變家蠶的變態(tài)發(fā)育和提高蠶絲的產(chǎn)量和質(zhì)量， 并闡明其分子機理。通過研究，整

54、體上解決昆蟲激素如何通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)和能量分 配來影響變態(tài)發(fā)育的問題。（3）家蠶變態(tài)發(fā)育中幼蟲組織退化與成蟲器官形成的激素調(diào)控機制變態(tài)時舊器官（如幼蟲器官）消亡和新器官（如成蟲器官）生成都是在昆蟲激素的調(diào)控下發(fā)生和完成的。當(dāng)昆蟲發(fā)生變態(tài)時，因為缺少了JH對20E的抑制作用，20E水平增加后觸發(fā)細(xì)胞程序性死亡（PCD）相關(guān)的基因表達(dá)，從而導(dǎo)致相 應(yīng)的幼蟲器官如神經(jīng)、中腸、絲腺、脂肪體等死亡和解體。對于舊器官的消亡， 目前認(rèn)為主要通過PCD如細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬作用得以實現(xiàn)。對于新器官的形 成，目前認(rèn)為一些新的成蟲器官原基（例如翅膀原基）在幼蟲期已經(jīng)存在，但其 發(fā)育被JH所抑制。在變態(tài)時，蟲激素信號解除

55、 JH抑制作用，誘導(dǎo)干細(xì)胞的分 裂分化最終導(dǎo)致新器官的形成（如成蟲的翅膀）。前期項目對家蠶變態(tài)過程中的 組織退化與新器官形成開展了初步研究，取得了較大進(jìn)展。發(fā)現(xiàn)在家蠶變態(tài)發(fā)育 過程中，20E對脂肪體器官重建起了至關(guān)重要的調(diào)控作用，而 JH則拮抗20E信號。20E信號通過誘導(dǎo)半胱天冬酶 dronc和drice的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,同時阻礙 insulin-Akt-TOR途徑而促進(jìn)細(xì)胞自噬。20E信號還可增大脂肪體細(xì)胞膜通透性而 誘導(dǎo)PCD,初步認(rèn)為這是20E誘導(dǎo)表達(dá)的組織蛋白酶cathepsi致。脂肪體器官 重建過程中，細(xì)胞先解離，之后又重新聚合，這是 20E誘導(dǎo)表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶mm所致。止

56、匕外，20E還參與調(diào)控成蟲盤細(xì)胞的分裂與分化。對家蠶蛹期專一 表達(dá)的翅原基表皮蛋白BmWCP視因的表達(dá)和調(diào)才5的研究發(fā)現(xiàn)，BmWCP4啟動子 區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄因子POU和FTZ-F1的順式調(diào)控元件。20E首先啟動了 BR-C Z4的表 達(dá)，后者再激活轉(zhuǎn)錄因子POUM2的表達(dá)，然后POUM2結(jié)合至ij BmWCP4勺啟動子 調(diào)控元件上，啟動了 BmWCP4因的表達(dá)，從而導(dǎo)致蛹期和表皮專一的翅原基表 皮蛋白BmWCP4的表達(dá)，使翅原基發(fā)育成翅膀，幼蟲實現(xiàn)向蛹和蛾的變態(tài)發(fā)育。 前期項目還研究了細(xì)胞自噬相關(guān)的 Atg1、Atg5、Atg6、Atg8、Atg10和Atg12等基 因在家蠶變態(tài)和組織器官形成中

57、的功能。本期項目將重點研究家蠶絲腺、脂肪體、中腸和表皮等重要器官在蛻皮和變 態(tài)發(fā)育過程中的退化和重建過程（包括細(xì)胞程序性死亡，如細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬 等，以及細(xì)胞再生和分化過程）及昆蟲激素對這些過程的分子調(diào)控作用。這方面研究主要解決幼蟲組織器官是如何退化和成蟲組織器官是如何受激素和營養(yǎng)信 號所調(diào)控的。主要內(nèi)容包括：1） 20E和JH對絲腺、脂肪體、中腸和表皮在變態(tài) 期前后細(xì)胞自噬和凋亡關(guān)鍵基因 （BmAtg3、BmAtg5、BmAtg6、BmAtg8、BmAtg9、 BmAtg10、BmAtg12、BmE74A 和 Bm-caspase IAP）的表達(dá)變化及定位，探討 20E和JH信號傳導(dǎo)途徑中

58、關(guān)鍵基因的應(yīng)答與制約關(guān)系；2）研究激素信號和饑餓 信號引發(fā)家蠶中腸、絲腺和脂肪體組織發(fā)生自噬和凋亡的基本特征，并揭示激素信號和饑餓信號途徑的關(guān)系；3）通過RNAi、轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)與在活體和離體 細(xì)胞knock out或knock down等方法，解析20E和JH信號傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵靶基 因在控制家蠶器官退化時細(xì)胞自噬和凋亡的調(diào)控功能；探討細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡途徑的激素調(diào)才$相互關(guān)系；4）以昆蟲激素調(diào)控家蠶翅原基表皮蛋白基因的蛹期 專一表達(dá)為研究對象，深入研究20E和JH信號傳導(dǎo)途徑對翅原基在蛹變態(tài)發(fā)育 時再生長與分化的調(diào)控分子機理，建立較完整的昆蟲激素調(diào)控變態(tài)發(fā)育的理論模 型；5)解析家蠶早期胚胎發(fā)育中控制成蟲分節(jié)發(fā)育的關(guān)鍵基因?qū)に氐膽?yīng)答關(guān) 系和在中腸、脂肪體和成蟲盤中促進(jìn)細(xì)胞再生的功能。五年預(yù)期目標(biāo)：(1)家蠶變態(tài)發(fā)育相關(guān)突變基因的定位克隆。定位克隆10個以上的化性