CRISPR基因編輯技術(shù)

1、CRISPR/Cas 9 系統(tǒng)介紹系統(tǒng)介紹 許許 汪汪 盛程程盛程程 于艷超于艷超周步丹周步丹 劉天昕劉天昕 郭歆巖郭歆巖CRISPR/Cas 9 背景背景 CRISPR是生命進(jìn)化歷史上，細(xì)菌和病毒進(jìn)行斗爭是生命進(jìn)化歷史上，細(xì)菌和病毒進(jìn)行斗爭產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細(xì)菌內(nèi)，利用細(xì)菌的細(xì)胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，到細(xì)菌內(nèi)，利用細(xì)菌的細(xì)胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，細(xì)菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進(jìn)化出很多成簇細(xì)菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進(jìn)化出很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列( (既既

2、CRISPR序列序列) )和和CRISPR相關(guān)基因，這一序列首先由日本學(xué)者于相關(guān)基因，這一序列首先由日本學(xué)者于1987年年首次發(fā)現(xiàn)首次發(fā)現(xiàn)(1)，于，于2002年被年被Jansen等將正式命名等將正式命名(2)。由這。由這些序列和基因組成的系統(tǒng)我們稱之為些序列和基因組成的系統(tǒng)我們稱之為CRISPR/Cas系統(tǒng)，系統(tǒng)，而在這個(gè)系統(tǒng)中常用到的核酸內(nèi)切酶為而在這個(gè)系統(tǒng)中常用到的核酸內(nèi)切酶為Cas9, ,所以通常所以通常稱該系統(tǒng)稱該系統(tǒng)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。利用這個(gè)系統(tǒng)，細(xì)菌可系統(tǒng)。利用這個(gè)系統(tǒng)，細(xì)菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的染色體上切除，這是以不動聲色地把病毒基因從自己的染色體上切除，

3、這是細(xì)菌特有的免疫系統(tǒng)。細(xì)菌特有的免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas 9概述概述CRISPR-Cas：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指指導(dǎo)導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。蛋白對靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)識別作用識別作用切割作用切割作用 CRISPR系統(tǒng)通常包括：由不連續(xù)的重復(fù)序列（系統(tǒng)通常包括：由不連續(xù)的重復(fù)序列（repeats，R）與長度相似的間區(qū)序列（與長度相似的間區(qū)序列（spacers，S）間隔排列而成的）間隔排列而成的CRISPRCRISPR簇，簇，前導(dǎo)序列前導(dǎo)序列( (leader，L)以及一系列的以及

4、一系列的CRISPR相關(guān)蛋白基因相關(guān)蛋白基因(cas)(cas)。 Cas（CRISPR associated）：存在于）：存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是位點(diǎn)附近，是一種雙鏈一種雙鏈DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對靶位點(diǎn)進(jìn)行切引導(dǎo)下對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。割。它不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。CRISPR的轉(zhuǎn)錄與加工的轉(zhuǎn)錄與加工CRISPR簇首先轉(zhuǎn)錄成長的轉(zhuǎn)錄體，即（簇首先轉(zhuǎn)錄成長的轉(zhuǎn)錄體，即（crRNA），然后），然后逐步被加工成小的逐步被加工成小的 crRNA。CRISPR/Cas 9作用機(jī)理作用機(jī)理CRISPR/Cas 9作用機(jī)理作用機(jī)理P

5、AM（NGG序列）序列）CRISPR/Cas 9系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。在人。在人類基因組中，平均每類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個(gè)就出現(xiàn)一個(gè)NGG PAM。CRISPR/Cas 9基因編輯實(shí)驗(yàn)流程圖基因編輯實(shí)驗(yàn)流程圖CRISPR/Cas 9的技術(shù)應(yīng)用的技術(shù)應(yīng)用應(yīng)用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。應(yīng)用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。能夠在真核細(xì)胞中發(fā)揮作用，使真核基因組中的特能夠在真核細(xì)胞中發(fā)揮作用，使真核基因組中的特異性位點(diǎn)發(fā)生雙鏈斷裂。異性位點(diǎn)發(fā)生雙鏈斷裂。在模式生物中

6、的應(yīng)用在模式生物中的應(yīng)用: :成功地對線蟲成功地對線蟲( (左左) )、斑馬魚胚胎（中）和果蠅進(jìn)行遺傳學(xué)改造，斑馬魚胚胎（中）和果蠅進(jìn)行遺傳學(xué)改造，獲得更粗短的線蟲，腹部組織體積更大的獲得更粗短的線蟲，腹部組織體積更大的斑馬魚胚胎，和眼睛顏色更深的果蠅，表斑馬魚胚胎，和眼睛顏色更深的果蠅，表明明CRISPR技術(shù)在動物基因改造方面有巨技術(shù)在動物基因改造方面有巨大應(yīng)用潛力。大應(yīng)用潛力。中國科學(xué)院遺傳中國科學(xué)院遺傳所高彩霞團(tuán)隊(duì)：所高彩霞團(tuán)隊(duì)：成功地使三種水成功地使三種水稻基因失活。稻基因失活。三大基因修飾技術(shù)比較三大基因修飾技術(shù)比較CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的優(yōu)勢系統(tǒng)的優(yōu)勢操作簡單，靶向精確性更高

7、。操作簡單，靶向精確性更高。sgRNA靶向序列和基因組序列靶向序列和基因組序列必須完全匹配，必須完全匹配，Cas9才會對才會對DNA進(jìn)行剪切。編碼進(jìn)行剪切。編碼sgRNA 的序列的序列不超過不超過100bp，因此比構(gòu)建，因此比構(gòu)建TALENs和和ZENs更簡單方便，用于更簡單方便，用于CRISPR的的sgRNA識別序列僅需識別序列僅需2020個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由系統(tǒng)是由RNA調(diào)控的對調(diào)控的對DNA的修飾，其基因修的修飾，其基因修飾可遺傳。飾可遺傳。基因修飾率高，基因修飾率高，CRISPRs基因敲入的效率為基因敲入的效率為51%-79%，TALENs的效率為的效率為

8、0%-34%?；蛘{(diào)控方式多樣，例如敲除、插入、抑制、激活等基因調(diào)控方式多樣，例如敲除、插入、抑制、激活等無物種限制無物種限制, ,可實(shí)現(xiàn)對靶基因多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)敲除?？蓪?shí)現(xiàn)對靶基因多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)敲除。實(shí)驗(yàn)周期短，最快僅需實(shí)驗(yàn)周期短，最快僅需2個(gè)月，節(jié)省大量時(shí)間和成本。個(gè)月，節(jié)省大量時(shí)間和成本。(ZFNS(ZFNS一個(gè)靶點(diǎn)成本一個(gè)靶點(diǎn)成本60006000) )CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的評價(jià)系統(tǒng)的評價(jià)參考文獻(xiàn)：參考文獻(xiàn)：1 Y. Ishino, H. Shinagawa, K. Makino, M. Amemura, A. Nakata, Nucleotide sequence of the ia

9、p gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology 169, 5429-5433 (1987).2 R. Jansen, J. D. A. v. Embden, W. Gaastra, L. M. Schouls, Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology 43, 1565-1575 (2002).3方銳,暢飛,孫照霖,李寧,孟慶勇. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)J. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2013