本科生設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)生化——蠶豆病

1、2012年設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn) 患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。 體格檢查：體溫38，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞 1.981012/L，血紅蛋白53g/L，血清總膽紅素85.5mol/L，結(jié)合膽紅素13.7mol/L，未結(jié)合膽紅素71.8mol/L，尿蛋白（+），潛血(+)，尿膽紅素()，尿膽素原(+)

2、，尿液鏡下未見紅細(xì)胞。 （尿三膽）尿膽素（尿三膽）尿膽素（+）、尿膽紅素）、尿膽紅素()、尿膽素原、尿膽素原(+)肝腸肝腸循環(huán)循環(huán)增多增多膽紅素膽紅素單核單核吞噬吞噬系統(tǒng)系統(tǒng)降解降解血紅素血紅素紅細(xì)胞破裂紅細(xì)胞破裂血紅蛋白滲出血紅蛋白滲出尿蛋白尿蛋白(+)(1.0g/l)運(yùn)氧功能障礙運(yùn)氧功能障礙溶血性貧血溶血性貧血循環(huán)血量減少循環(huán)血量減少血壓下降血壓下降脈搏加快脈搏加快(心率加快心率加快)呼吸加快呼吸加快過多過多34.2umol/L時(shí)，時(shí)，黃疸黃疸血清總膽紅素血清總膽紅素 結(jié)合膽紅素變化不大（水溶結(jié)合膽紅素變化不大（水溶性大，隨尿排出）性大，隨尿排出）未結(jié)合膽紅素未結(jié)合膽紅素（水溶性（水溶性小

3、，不能隨尿排出，有毒）小，不能隨尿排出，有毒）醬油尿醬油尿理論依據(jù) 溶血性黃疸:由于紅細(xì)胞的大量破壞，使膽紅素產(chǎn)生過多，超過了肝細(xì)胞攝取結(jié)合的能力，使得尿中尿膽原和尿膽素含量增多。葡糖-6-磷酸脫氫酶缺乏，輸血不當(dāng)均會(huì)引起病癥 蠶豆?。浩咸?6-磷酸脫氫酶缺乏?；颊叽蠖嘣谑秤眯Q豆后發(fā)生急性溶血性貧血。典型病人常出現(xiàn)由于大量紅細(xì)胞破壞釋放出膽紅素二導(dǎo)致的溶血性黃疸 ，惡心嘔吐，尿液呈醬油樣等癥狀 誘因：一天前食用蠶豆 既往史：姐姐也曾出現(xiàn)過此癥狀蠶豆病發(fā)病機(jī)制 食用蠶豆 產(chǎn)生大量過氧化氫，不被清除 紅細(xì)胞膜脂質(zhì)被氧化破壞 急性血管內(nèi)溶血，產(chǎn)生過多膽紅素 導(dǎo)致溶血性黃疸，惡心，嘔吐，尿液呈醬油樣

4、6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏使磷酸戊糖途徑受阻。NADPH+H+缺乏致血還原型谷胱甘肽生成不足。 紅細(xì)胞被破壞，則可被肝等單核吞噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬，釋放血紅蛋白，進(jìn)一步分解為珠蛋白和血紅素，而血紅素被吞噬細(xì)胞降解為膽紅素。 膽紅素是人體內(nèi)原型抗氧化劑，能夠清楚超氧化劑和過氧化物自由基，因患兒體內(nèi)有大量過氧化氫，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，從而增加膽紅素的量升高來抵御氧化應(yīng)激狀態(tài)。患兒正常（兒童）紅細(xì)胞1.981.9810101212/L /L 4.04.0* *101012125.35.3* *10101212/L/L血紅蛋白53g/L 53g/L 120120140g/L 140g/L 血清總膽

5、紅素85.585.5mol/L mol/L 1.711.7117.1mol/L 17.1mol/L 結(jié)合膽紅素13.713.7mol/L mol/L 0 03.42mol/L 3.42mol/L 未結(jié)合膽紅素71.871.8mol/L mol/L 0 013.68mol/L 13.68mol/L 尿蛋白(+)(+)潛血(+)(+)尿膽紅素(-) (-) 尿膽素原(+)(+)從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 主要臨床表現(xiàn)：1. 血尿、排醬油色尿、面色蒼白 2. 皮膚及鞏膜黃染 3. 體溫升高 4. 呼吸急促1. 血尿、排醬油色尿、面色蒼白G6PDGSH的主要作用：的主要作用： 保護(hù)紅

6、細(xì)胞內(nèi)的含硫氫基保護(hù)紅細(xì)胞內(nèi)的含硫氫基 （-SH）血紅蛋白、酶蛋白和膜）血紅蛋白、酶蛋白和膜 蛋白的完整性，免遭氧化蛋白的完整性，免遭氧化 與谷胱甘肽過氧化酶共同使與谷胱甘肽過氧化酶共同使 H2O2還原成還原成H2ONADPH+H+紅細(xì)胞的抗氧化能力紅細(xì)胞的抗氧化能力GSH紅細(xì)胞紅細(xì)胞 膜破裂膜破裂溶血性貧血溶血性貧血（面色蒼白）（面色蒼白）游離游離Hb腎腎 吸收閾值吸收閾值血紅蛋白尿血紅蛋白尿/含鐵血黃素尿含鐵血黃素尿2. 皮膚及鞏膜黃染3. 體溫升高機(jī)理： 紅細(xì)胞破裂 血紅蛋白暴露 免疫系統(tǒng)攻擊（單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)） 體溫升高4. 呼吸急促溶血性貧血 具有載O2能力的Hb含量下降機(jī)體缺O(jiān)2

7、呼吸急促實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)高鐵血紅蛋白還原法高鐵血紅蛋白還原法實(shí)驗(yàn)思路 患者姐姐出現(xiàn)過此類狀況推測(cè)屬于家族性遺傳，且患者在食用蠶豆后出現(xiàn)癥狀，故即有可能為蠶豆病。6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏影響高鐵血紅蛋白的還原，故可以依據(jù)如下反應(yīng)機(jī)制設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。亞鐵血紅蛋白亞鐵血紅蛋白 高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白還原酶高鐵血紅蛋白還原酶 NADPH(輔酶輔酶) 亞甲藍(lán)亞甲藍(lán)(遞氫體遞氫體)亞硝酸鈉亞硝酸鈉實(shí)驗(yàn)反應(yīng)方向一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、檢測(cè)患者體內(nèi)6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性以及發(fā)病原因 2、掌握高鐵血紅蛋白還原法測(cè)6-磷酸葡萄糖脫氫酶的實(shí)驗(yàn)原理及方法 3、了解蠶豆病的發(fā)病機(jī)制及原因二、實(shí)驗(yàn)原理 在全血中加入亞

8、硝酸鈉，使紅細(xì)胞中的亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白（MHb）,高鐵血紅蛋白在高鐵血紅蛋白還原酶的作用下又被還原為亞鐵血紅蛋白。在這過程中，高鐵血紅蛋白還原酶不僅需要亞甲藍(lán)作為遞氫體，還需要由G6PD參與磷酸戊糖途徑形成NADPH作為輔酶才完成上述反應(yīng)。所以，G6PD缺陷癥的患者其MHb還原率下降（分光光度技術(shù)）。三、實(shí)驗(yàn)器材及試劑 器材：離心機(jī)、分光光度計(jì)、微量移液器 水浴箱、1.5mlEP管、抗凝管，試管 試劑： 0.18mol/L亞硝酸鈉-葡萄糖溶液； 0.4mmol/L亞甲藍(lán)溶液 ； 0. 28 mol/L 葡萄糖溶液、混合液 （等量+）生理鹽水、抗凝劑、 患者靜脈血、蒸餾水四、實(shí)驗(yàn)步驟

9、1、取靜脈血1.8mL于抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝劑+葡萄糖20mg），混勻2、離心沉淀1000r/min15min3、調(diào)整血細(xì)胞血漿=11，混勻，（調(diào)整后全血）4.1ml0.18 mol/L亞硝酸鈉、1ml0.28mol/L葡萄糖溶液、0.14 mmol/L亞甲基藍(lán)液，混勻，得到混合試劑1ml 5、取試管3 支,標(biāo)上A、B、S ,按下表加入試劑高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)操作步驟混合試劑/ mL 0. 01 / /生理鹽水/ mL / 0. 01 /0. 18 mol/ L 亞硝酸鈉- / / 0. 010. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 經(jīng)調(diào)整的全血/ mL 0. 1 0.

10、 1 0. 1來回?fù)u動(dòng)1520 次,置37 水浴箱靜置3 h蒸餾水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml 試劑 A B SB管為空白管,在波長635nm處，測(cè)定“A”管及“S”管吸光度五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：計(jì)算高鐵血紅蛋白還原率公式：MHb % = (1 - A/ S) 100 % 計(jì)算出其還原率與正常值比較六、實(shí)驗(yàn)分析 該患者可能患有先天性鐮刀貧血癥或蠶 豆病。 正常的高鐵血紅蛋白還原率75%，若計(jì)算所得還原率低于75%，且患者姐姐也有類似癥狀，患者吃過蠶豆后發(fā)病，故可推斷患者患有蠶豆病七、注意事項(xiàng)1、血細(xì)胞比容比值過低，高鐵血紅蛋白還原率降低。應(yīng)將血細(xì)胞比容調(diào)整到0.

11、35-0.402、細(xì)菌污染可產(chǎn)生亞硝酸鹽而造成假陽性，試管等應(yīng)無菌3、不穩(wěn)定Hb、高脂血癥等均可出現(xiàn)假陽性結(jié)果，故應(yīng)2h內(nèi)送檢4、標(biāo)本不應(yīng)有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在標(biāo)本內(nèi)應(yīng)適當(dāng)加入葡萄糖，以避免較全血缺乏要想探討該病發(fā)生的分子基礎(chǔ)，可以用哪些技術(shù)檢測(cè)什么目的基因？我組討論認(rèn)為：要想探討該病發(fā)生的分子基礎(chǔ) ，需要對(duì)目的基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，即DNA序列檢測(cè)DNA序列測(cè)定方法直接法直接法間接法間接法：對(duì)于未知片段，或片段過長，用幾種方法：對(duì)于未知片段，或片段過長，用幾種方法（RFLP；PCR-RFLP；SSCP）來粗略的估計(jì)待分析）來粗略的估計(jì)待分析基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)是否與對(duì)照基因相同基因的一

12、級(jí)結(jié)構(gòu)是否與對(duì)照基因相同雙脫氧末端終止法（雙脫氧末端終止法（Sanger法）法）化學(xué)裂解法（化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert法）法）DNA的自動(dòng)化測(cè)序的自動(dòng)化測(cè)序DNA序序列列測(cè)測(cè)定定方方法法患者體型瘦小與該病癥是否有關(guān)，為什么？ 我們認(rèn)為體型瘦小與該病有關(guān)，原因分析如下： 溶血性貧血 紅細(xì)胞比容下降 營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸不足（糖、蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)代謝障礙） 缺乏營養(yǎng) 體型瘦小實(shí)驗(yàn)思路 患者姐姐出現(xiàn)過此類狀況推測(cè)屬于家族性遺傳，且患者在食用蠶豆后出現(xiàn)癥狀，故即有可能為蠶豆病。6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏影響高鐵血紅蛋白的還原，故可以依據(jù)如下反應(yīng)機(jī)制設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。亞鐵血紅蛋白亞鐵血紅蛋白 高鐵血紅蛋白高鐵

13、血紅蛋白高鐵血紅蛋白還原酶高鐵血紅蛋白還原酶 NADPH(輔酶輔酶) 亞甲藍(lán)亞甲藍(lán)(遞氫體遞氫體)亞硝酸鈉亞硝酸鈉實(shí)驗(yàn)反應(yīng)方向一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、檢測(cè)患者體內(nèi)6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性以及發(fā)病原因 2、掌握高鐵血紅蛋白還原法測(cè)6-磷酸葡萄糖脫氫酶的實(shí)驗(yàn)原理及方法 3、了解蠶豆病的發(fā)病機(jī)制及原因二、實(shí)驗(yàn)原理 在全血中加入亞硝酸鈉，使紅細(xì)胞中的亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白（MHb）,高鐵血紅蛋白在高鐵血紅蛋白還原酶的作用下又被還原為亞鐵血紅蛋白。在這過程中，高鐵血紅蛋白還原酶不僅需要亞甲藍(lán)作為遞氫體，還需要由G6PD參與磷酸戊糖途徑形成NADPH作為輔酶才完成上述反應(yīng)。所以，G6PD缺陷癥的患者其MHb還原率下降（分光光度技術(shù)）。三、實(shí)驗(yàn)器材及試劑 器材：離心機(jī)、分光光度計(jì)、微量移液器 水浴箱、1.5mlEP管、抗凝管，試管 試劑： 0.18mol/L亞硝酸鈉-葡萄糖溶液； 0