TLC板技術(shù)經(jīng)驗(yàn)交流PPT教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1TLC板技術(shù)經(jīng)驗(yàn)交流板技術(shù)經(jīng)驗(yàn)交流2 第1頁(yè)/共42頁(yè)背景：薄層色譜法(Thin-Layer Chromatography,簡(jiǎn)稱(chēng)TLC）是Kirchner等人在五十年代從經(jīng)典柱色譜法及紙色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái) 的一 種 色 譜技術(shù)。六 十年代后，Stahl等人 對(duì)薄層色譜法的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)格化及擴(kuò)大應(yīng)用等方面進(jìn)行了許多工作，使該法日趨成熟。2010年版中國(guó)藥典一部有3341項(xiàng)鑒別采用TLC法分類(lèi)：按薄層色譜使用的固定相的性質(zhì)及其分離機(jī)制可分為吸附薄層、分配薄層、離子交換薄層及分子排阻薄層背景和分類(lèi)背景和分類(lèi)第2頁(yè)/共42頁(yè)4 特點(diǎn)特點(diǎn)：微量、快速、簡(jiǎn)單、節(jié)省微量、快速、簡(jiǎn)單、節(jié)省一般認(rèn)為T(mén)

2、LC是一種定性和半定量的方法原理和特點(diǎn)原理和特點(diǎn)第3頁(yè)/共42頁(yè)5點(diǎn)樣薄層板預(yù)處理展開(kāi)展開(kāi)劑選擇顯色顯色劑使用定位定量和定性操作過(guò)程操作過(guò)程第4頁(yè)/共42頁(yè)氧化鋁 有弱堿性 pH=9、酸性pH=4及中性pH=7.5三種氧化鋁。弱堿性氧化鋁用來(lái)分離中性或堿性化合物；中性氧化鋁適用于酸性及對(duì)堿不穩(wěn)定的化合物的分離；酸性化合物可用酸性氧化鋁分離。硅藻土、纖維素、葡聚糖凝膠等化學(xué)鍵合固定相（C18、C8 等）薄層板薄層板硅膠 表面帶硅醇基（SiOH），呈弱酸性 (pH=4.5)，活性硅膠適合分離酸性或中性化合物，如酚類(lèi)、有機(jī)酸、醛類(lèi)、甾體化合物以及氨基酸類(lèi)，是基于吸附作用；非活性硅膠含有一定的水，在分

3、離色素時(shí)是基于分配作用。第5頁(yè)/共42頁(yè)硅膠G: 是含有13煅石膏（gypsum）黏合劑的硅膠硅膠H：不含黏合劑的硅膠硅膠HF254：不含黏合劑，含有一種無(wú)機(jī)熒光劑（如錳激活的硅酸鋅），在254nm波長(zhǎng)紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光硅膠GF254：含有煅石膏黏合劑，含熒光劑，在254nm波長(zhǎng)紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光硅膠HF254+366：不含粘合劑，在254與366nm波長(zhǎng)有熒光硅膠PF254：制備型的，在254nm有熒光（有熒光劑，適用于不發(fā)光不易顯色物質(zhì)的制備與分離） 市售預(yù)制板規(guī)格市售預(yù)制板規(guī)格第6頁(yè)/共42頁(yè)將吸附劑或載體均勻涂布在玻璃板、塑料片或鋁箔上的預(yù)制板。薄層有軟板及硬板兩種。硬板系

4、在吸附劑中加入適量粘合劑后用濕法涂層，粘合劑的加入可以增加薄層的強(qiáng)度。常用的粘合劑為羧甲基纖維素鈉(CMCNa)或煅石膏(CaSO41/2H2O)使用前一般應(yīng)于110下活化30min薄層厚度約為 0.2-0.3mm。 制備板0.5-2mm。 薄層的制備薄層的制備第7頁(yè)/共42頁(yè)手動(dòng)點(diǎn)樣：靈活方便，常用于各種TLC鑒別中。自動(dòng)點(diǎn)樣 重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性好，常用于薄層掃描法的含量測(cè)定。半自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣量：原點(diǎn)位置的負(fù)荷有限，體積0.510微升，濃度通常為0.52mg。直徑3mm以?xún)?nèi)樣品溶劑：原則上應(yīng)選擇對(duì)可以溶解但溶解度不是很大的溶劑一定要有交叉點(diǎn)點(diǎn)樣點(diǎn)樣Spyringe第8頁(yè)/共42頁(yè)10Note:

5、毛細(xì)管取樣1cm？ 3.14*（0.3mm/2）*10mm=1.413mm=0.71L 3.14*（0.5mm/2）*10mm=3.925mm=1.96L第9頁(yè)/共42頁(yè)點(diǎn)樣常見(jiàn)問(wèn)題點(diǎn)樣常見(jiàn)問(wèn)題1、點(diǎn)樣量太多。展開(kāi)劑不能全部負(fù)載2、太濃了。展開(kāi)劑從原點(diǎn)外圍繞行3、濃。未分開(kāi)4、樣品溶劑殘留。吹干時(shí)應(yīng)注意高溫 破壞樣品5、點(diǎn)樣量太少?？床磺?、樣品溶劑中溶解度很大。原點(diǎn)將變 成空心圓第10頁(yè)/共42頁(yè)12一般極性溶劑體系一般極性溶劑體系(CH2Cl2, THF, ethyl acetate, etc)強(qiáng)極性溶劑體系強(qiáng)極性溶劑體系(DMSO, DMF)需要淬滅的體系需要淬滅的體系(NaH, LiA

6、lH4, n-BuLi, etc)強(qiáng)堿、酸性物質(zhì)強(qiáng)堿、酸性物質(zhì)(NaOH, H2SO4,etc)一般不推薦直接取一般不推薦直接取樣，建議淬滅后簡(jiǎn)樣，建議淬滅后簡(jiǎn)單后處理再取樣，單后處理再取樣，或稀釋后取樣?；蛳♂尯笕?。最好簡(jiǎn)單后處理最好簡(jiǎn)單后處理（加水和有機(jī)溶劑（加水和有機(jī)溶劑萃取）以后取樣萃取）以后取樣處理處理（如加水或（如加水或酸和有機(jī)溶劑）酸和有機(jī)溶劑）后取樣后取樣最好中和后取樣最好中和后取樣Note: ：第11頁(yè)/共42頁(yè)展開(kāi)方法 展開(kāi)劑浸入薄層下端高度不應(yīng)超過(guò) 0.5cm，當(dāng)心將樣品帶被展開(kāi)劑浸泡硬板可以進(jìn)行近水平、上行、下行、雙向、多次展開(kāi)等展開(kāi)槽有直立式、平臥式、雙槽式、夾心式

7、或水平式第12頁(yè)/共42頁(yè)Note：a.展開(kāi)槽應(yīng)密閉。溶劑蒸氣、液相( 展開(kāi)劑)、固定相 ( 吸附劑) 一起構(gòu)成復(fù)雜的三維層析過(guò)程b.展缸預(yù)先飽和以減弱邊緣效應(yīng)，如果薄層板也同時(shí)預(yù)飽和效果更佳。c.點(diǎn)樣帶寬時(shí)（常見(jiàn)制備板）。先用大極性溶劑展2cm以濃集樣品，干燥薄層板，再用所需展開(kāi)劑展開(kāi)。第13頁(yè)/共42頁(yè)使各成分間有較好的分離;Rf在0.20.8為有效;監(jiān)控點(diǎn)應(yīng)在0.40.6之間不與待測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng);沸點(diǎn)適中，黏度較小；展開(kāi)后組分斑點(diǎn)圓且集中；混合溶劑最好新鮮配制; 展開(kāi)劑的選擇原則展開(kāi)劑的選擇原則第14頁(yè)/共42頁(yè)16展開(kāi)方向有單向、單向長(zhǎng)板、多次、多種極性展開(kāi)等.展一次展多次第一次展

8、開(kāi)PE/EA=4:1 第二次展開(kāi)CH2Cl2/MeOH=10:1采用多次展開(kāi)的方法可以提高TLC的分離效果。做一次檢測(cè)得到較多的樣品信息，展開(kāi)前多思考。第15頁(yè)/共42頁(yè)17展開(kāi)機(jī)理的探討展開(kāi)機(jī)理的探討ABCD為硅膠層， EFCDG為展開(kāi)劑，EF為展開(kāi)劑前沿，CDG為展開(kāi)劑水平面。展開(kāi)劑以硅膠膠表面ED為界分A AB BC CD DE EF FG G展開(kāi)方向毛細(xì)層（EFCD）內(nèi)的展開(kāi)劑理所當(dāng)然向AB方向運(yùn)動(dòng)依附層（EDG）的展開(kāi)劑作為額外的補(bǔ)充源泉 同一瞬間，跨過(guò)薄層板上任一點(diǎn)展開(kāi)劑的絕對(duì)量彼此相等，但由于液層厚度不同，必然存在速度差異所以，Rf 值越大 ，斑點(diǎn)也就越大。第16頁(yè)/共42頁(yè)堿性

9、物質(zhì)能與硅膠作用，易被吸附出現(xiàn)脫尾，加TEA，NH3H2O，Pyridine等避免先低后高，先單一后復(fù)雜，酸加酸，堿加堿，羰基加丙酮，相似相容原則展開(kāi)劑的選擇方法展開(kāi)劑的選擇方法石油醚二氯甲烷乙醚四氫呋喃乙酸乙酯丙酮正丙醇甲醇水常用展開(kāi)劑極性順序常用展開(kāi)劑極性順序第17頁(yè)/共42頁(yè)三角形法三角形法（a）適于吸附薄層; (b) 適于分配薄層. （a）第18頁(yè)/共42頁(yè)點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)法點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)法最合適的展開(kāi)劑？第19頁(yè)/共42頁(yè)Note：a.展開(kāi)劑渾濁不清，應(yīng)分液澄清后b.正丁醇和丙醇對(duì)斑點(diǎn)擴(kuò)散影響較小c.丙酮可混溶溶劑，降低劑粘度，加快展速d.由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使 用是有限度的。

10、大展開(kāi)劑: ArOH (aq sat.)、n-BuOH (aq sat.) 、nBuOH-AcOH-H2O(5:1:1)、iPrOH-NH4OH-H2O(10:5:1)常用展開(kāi)劑對(duì)：E/P、M/D、PE / Acetone、THF/PE、 MeOH/Toluene、DCM/PE第20頁(yè)/共42頁(yè)nBuOH/acetone/AcOH/H2OVB1及其磷酸酯nPrOH/NH3H2O(con.)/H2O=20/20/1AMP單磷酸及3,5-雙磷酸n-BOH/HOAc/H2O=5/1/1巰基乙胺及甲基化后第21頁(yè)/共42頁(yè)DCM/MeOH/HOAc=10/1/0.05甘氨膽酸THF/PE=2/3ED-

11、71中間體AsMg、FPM中間體硫醚，亞砜、砜第22頁(yè)/共42頁(yè)24顯色顯色一一看看、首先在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置、首先在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置二二照照、在紫外燈下觀察有無(wú)暗斑或熒光斑點(diǎn)、在紫外燈下觀察有無(wú)暗斑或熒光斑點(diǎn)三三碘碘、多數(shù)有機(jī)物吸附碘可逆的產(chǎn)生棕色或黃色斑點(diǎn)、多數(shù)有機(jī)物吸附碘可逆的產(chǎn)生棕色或黃色斑點(diǎn)四四顯顯、既無(wú)色又無(wú)紫外吸收的物質(zhì)，可以用顯色劑顯色、既無(wú)色又無(wú)紫外吸收的物質(zhì)，可以用顯色劑顯色DIEADIEAPE/EA=1:2NEtNEt3 3第23頁(yè)/共42頁(yè)25各種常用顯色劑及其配制方法各種常用顯色劑及其配制方法: :硫酸溶液硫酸溶液 硫酸-水(1：1)

12、溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液；1.5 molL硫酸溶液與0.5-1.5 molL硫酸銨溶液大部分化合物大部分化合物高錳酸鉀高錳酸鉀 1.5g KMnO4 + 10g K2CO3 + 1.25mL 10% NaOH + 200mL含還原性基團(tuán)化合物，含還原性基團(tuán)化合物，比如羥基，氨基，醛比如羥基，氨基，醛磷鉬酸磷鉬酸(PMA) (PMA) 乙醇5磷鉬酸乙醇溶液 噴后120（可用加熱槍?zhuān)┚徛婵具€原性化合物顯藍(lán)色，還原性化合物顯藍(lán)色，再用氨氣薰，則背景再用氨氣薰，則背景變?yōu)闊o(wú)色。變?yōu)闊o(wú)色。茚三酮茚三酮O.2g溶于乙醇l00 ml中。方法：噴后于110oC加熱。醋酸呈紅紫色斑點(diǎn)氨基酸或胺基氨

13、基酸或胺基溴甲酚綠溴甲酚綠溴甲酚綠0.1g溶于乙醇500ml和0.1mol/L氫氧化鈉溶液5ml酸或堿酸或堿第24頁(yè)/共42頁(yè)26續(xù)表續(xù)表茴香醛溶液茴香醛溶液674mL乙醇+18.5mL茴香醛+25mL濃硫酸浸泡后吹干再加熱氰基、胺基及硝基氰基、胺基及硝基2,4-二硝基苯二硝基苯肼肼2g 2,4-二硝基苯肼+ 60mL濃硫酸+ 80mL水+ 200mL乙醇酮一般顯黃色，飽和醛則顯紅色或磚紅色不定羰基的化合物羰基的化合物吲哚醌吲哚醌1g溶于100ml丙酮中，加入10ml醋酸。噴灑試劑后，100110加熱l0min，顯藍(lán)、紅、桃紅或棕色斑點(diǎn)氨基酸、多肽氨基酸、多肽香草醛香草醛/ /硫酸硫酸 香草醛

14、1g溶于硫酸lOOml。噴后于120加熱至呈色最深。高級(jí)醇、酚、甾類(lèi)及精高級(jí)醇、酚、甾類(lèi)及精油油第25頁(yè)/共42頁(yè)定性定性影響Rf值的因素較多：溫度、濕度。一般在較高溫度下展開(kāi)時(shí)，Rf值較高，反之降低需經(jīng)過(guò)兩種以上不同組成的展開(kāi)劑得到的 R f值與標(biāo)準(zhǔn)品一致時(shí)，才可認(rèn)定該斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品是同一化合物；通過(guò)斑點(diǎn)顏色，有無(wú)紫外吸收或產(chǎn)生螢光的顏色，以及用專(zhuān)屬性顯色劑后斑點(diǎn)顯色的情況與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可幫助鑒定第26頁(yè)/共42頁(yè)手性薄層色譜手性薄層色譜一、手性選擇劑混合制板（較難實(shí)現(xiàn)）二、手性選擇劑添至流動(dòng)相中，作展開(kāi)劑使用三、？好的分析方法應(yīng)該是簡(jiǎn)單的，簡(jiǎn)潔是一種美。第27頁(yè)/共42頁(yè)手性薄層色譜分離的因素

15、手性選擇劑的種類(lèi)、 純度、 濃度大小、 與吸附劑的比例化合物消旋化， 配置成溶液后這種趨勢(shì)變得更大。第28頁(yè)/共42頁(yè)Nature 1965 208, p71 - 72nBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomernBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomer第29頁(yè)/共42頁(yè)31純 度?狀 態(tài)?合 理?可 行?第30頁(yè)/共42頁(yè)32監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程: :Note：a.點(diǎn)樣量 b.檢測(cè)時(shí)間c.留樣對(duì)照 d. 重要板留存第31頁(yè)/共42頁(yè)33檢測(cè)時(shí)機(jī)檢測(cè)時(shí)機(jī)第32頁(yè)/共42頁(yè)34官能團(tuán)轉(zhuǎn)化官能團(tuán)轉(zhuǎn)化極性大極性大極性小極性

16、小R=R R-RCHO C=COHX (Cl, Br, I) COOHCO2R ,R-SO-R R-SO2-R-NH2(-OH) NH-R ,(OH- R ,)第33頁(yè)/共42頁(yè)35TLCTLC組合判斷組合判斷TLCTLCMSMSNMRNMRLCMs/HPLCLCMs/HPLC第34頁(yè)/共42頁(yè)36后處理情況后處理情況EAEAH H2 2O O固體的純度和母液的取舍固體的純度和母液的取舍SolidSolidMother solutionMother solutionsolidmother .萃取是否有效萃取是否有效第35頁(yè)/共42頁(yè)37摸索柱層析洗脫條件摸索柱層析洗脫條件Note: Rf值在值在0.2左右的展開(kāi)劑比例為洗脫劑的合適值左右的展開(kāi)劑比例為洗脫劑的合適值 過(guò)柱時(shí)組分流出順序未必和過(guò)柱時(shí)組分流出順序未必和TLC上點(diǎn)極性順序一致上點(diǎn)極性順序一致Rf = 0.2Desired productDesired pr