第三章 動物細胞培養(yǎng)總論

1、動動 物物 細細 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng)l無細胞壁l倍增時間長，生長緩慢l需氧量少，對攪拌敏感l(wèi)聚集體形成l原代細胞培養(yǎng)50代即開始退化l動物的體外培養(yǎng)分為： 細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。l1、細胞培養(yǎng)：將動物的某一組織取出， 使其分散成單個細胞，在人工條件下（無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下）使之存活、生長和增殖的技術(shù)。l2、組織培養(yǎng)： 將動物的組織取出，在模擬體內(nèi)生理環(huán)境下，在體外的人工條件下生存和生長， 并維持組織的結(jié)構(gòu)和功能不變的技術(shù)。l組織培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)的關系 在組織培養(yǎng)過程中，由于現(xiàn)有的培養(yǎng)手段還不能長期維持組織的結(jié)構(gòu)和功能不變，動物細胞往往會從組織中遷移生

2、長出來，在組織周圍形成一圈單層貼壁生長細胞，這圈細胞又稱為生長暈。 組織培養(yǎng)最終變成細胞培養(yǎng)最終變成細胞培養(yǎng)。l3.器官培養(yǎng)： 培養(yǎng)對象是器官的原基、器官的一部分或整個器官， 放在模擬體內(nèi)的生理環(huán)境的體外，使之存活、生長并保持一定功能的技術(shù)。l抑制細胞從器官培養(yǎng)物中遷移出來。抑制細胞的脫分化，維持器官培養(yǎng)物的結(jié)構(gòu)和功能不變，維持細胞的分化狀態(tài)。l5、組織工程的意義： 應用生命科學與工程學的原理與技術(shù)，在正確認識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關系的基礎上，研究、開發(fā)用于修復、維護、促進人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學科。l組織工程的基本方法： 是將體外

3、培養(yǎng)的高濃度組織細胞，擴增后吸附于一種生物相容性良好、并可被人體逐步降解吸收的細胞外基質(zhì)上。該材料可為細胞提供生存的三維空間，有利于細胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，進行氣體交換，使細胞按預制形態(tài)的三維支架生長。然后將這種細胞生物材料復合體植入機體病損部位，在生物支架降解吸收過程中，種植的細胞繼續(xù)增生繁殖，形成了新的具有其原來特殊功能和形態(tài)的相應組織和器官，達到修復創(chuàng)傷和重建功能的目的。 l1885年， Roux將雞胚神經(jīng)板在溫暖的生理鹽水中培養(yǎng)幾個月，首次提出組織培養(yǎng)的概念。l1907年，Harrison 的髓管培養(yǎng)試驗，將蛙胚的神經(jīng)管的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，從細胞中長出軸突這是公認的組織培

4、養(yǎng)的真正開始。l1912年，Carrel 將無菌操作引入組培試驗l另外，他將7天的雞胚心肌組織塊包埋培養(yǎng)于血漿和雞胚提取液，觀察到心肌細胞搏動達104天， 并采用更新培養(yǎng)基和將原代細胞傳代 的培養(yǎng)措施，從而解決了細胞體外長期生存的營養(yǎng)問題。l1951年，Eagle,研發(fā)人工合成的培養(yǎng)基。l1975年，Sato 用激素、生長因子代替血清，開發(fā)了成分明確的培養(yǎng)基。l貼附生長： 必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞。如：人胚肺細胞，Hela細胞，巨噬細胞，神經(jīng)細胞。l懸浮生長： 在懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。如血細胞、淋巴細胞、某些腫瘤細胞 群體培養(yǎng)（群體培養(yǎng)（mass

5、culturemass culture）：）：將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞。；克隆培養(yǎng)（克隆培養(yǎng)（clonal cultureclonal culture）：）：將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經(jīng)過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克?。╟lone）。l 一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。 群體培養(yǎng)克隆培養(yǎng) 第二節(jié) 組織培養(yǎng)細胞生命期 原代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期 原代培養(yǎng)期(primary culture) ： 從肌體取得材料（ 細胞，器官或組織）在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)到第一

6、次傳代前的這個過程稱為原代培養(yǎng) 。又稱初代培養(yǎng)。 此期細胞特點： 細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。 初代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大，呈二倍體核型。 由于與體內(nèi)細胞相似性大，可用于檢測藥物 細胞群是異質(zhì)的，即各細胞的遺傳性狀互不相同 細胞相互依存性強，克隆形成率低，即細胞獨立生存性差。 克隆形成率（Cloning efficiency）:指細胞群被稀釋分散成單個細胞進行培養(yǎng)時，形成細胞群（克?。┑陌俜謹?shù)。原代培養(yǎng)的方法：1、組織塊培養(yǎng)法：將有機體取出的組織， 切成1mm3大小的組織塊，進行培養(yǎng)的 方法。 a）、薄層培養(yǎng)法 b)、反轉(zhuǎn)干涸法2、酶解培養(yǎng)法：將組織剪

7、成1mm3大小的組織后， 用胰蛋白酶或膠原蛋白酶溶液進行進行 消化，進行培養(yǎng)的方法。魚類細胞組織塊原代培養(yǎng)：魚類細胞組織塊原代培養(yǎng)： 魚類消毒處理魚類消毒處理取取 材材接接 種種 培培 養(yǎng)養(yǎng)1）、魚類消毒處理： 將海水煮沸消毒 加入青霉（1000IU/mL）鏈霉素（終濃度1000g/mL） 將魚放入浸泡24h.2)、取材： 無菌條件下取魚的鰓、吻端、鰭、心肝等組織 磷酸緩沖液（PBS）漂洗 剪成1mm3的組織小塊。3）、接種和培養(yǎng)： 用培養(yǎng)液漂洗組織小塊數(shù)次移入培養(yǎng)瓶，靜置12min， 翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，將適量培養(yǎng)液加在非細胞生長面，靜置培養(yǎng)24h， 輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，繼續(xù)培養(yǎng)直到長成細胞單層；

8、或加薄層培養(yǎng)液，24h后補液。n哺乳動物的原代培養(yǎng)：哺乳動物的原代培養(yǎng)：n鼠胚胎制備：n（1）孕鼠的準備:交配后雌鼠陰道出現(xiàn)陰道栓計算 胎齡。n（2）殺死孕鼠：n（3）取胚胎 ： PBS洗滌浸入含有雙抗的 培養(yǎng)液n（4）酶解或是組織塊法培養(yǎng)n鳥類胚胎的制備鳥類胚胎的制備n（1）受精蛋的準備：38孵卵箱中靜置21d, 每日翻動12次n（2）消毒受精蛋n（3）取胚胎：大頭朝上，打破大頭，小心的撕去氣室膜和尿囊絨膜 用鑷子夾出胚胎。n（4）浸泡在培養(yǎng)液中備用。l傳代培養(yǎng)期： 從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個培養(yǎng)瓶去培養(yǎng)的過程。8 在全生命期中此期最長。此期細胞增殖旺盛。8 呈二倍體核型的細胞系，稱為二倍體細

9、胞系（Diploid cell line）懸浮培養(yǎng)的細胞懸浮培養(yǎng)的細胞： 離掉舊的培養(yǎng)液，換上新的培養(yǎng)液。貼壁培養(yǎng)的細胞貼壁培養(yǎng)的細胞： 倒掉舊的培養(yǎng)液 用PBS或PE沖洗單層細胞12次（去掉死細胞） 用適量的0.25%的胰酶消化細胞單層，制成單cell溶液，取1/2懸液接種于另一培養(yǎng)瓶， 并補加新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。A 為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。A 當前世界上常用細胞均在不出十代內(nèi)凍存。否則，需反復傳代，就失去二倍體性質(zhì)。A 一般情況下，當傳代10-15次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。 8 衰退期： 動物細胞傳代到一定時期就喪失生存能力

10、，到達衰退期。8 特點： 此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。 在以上三期任何一點，一般在傳代期末，或衰退期初，由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（遺傳性狀發(fā)生改變）。 轉(zhuǎn)化的標志之一是細胞可能獲得永生性（immortality）或惡生性（malignancy） 圖圖示示 體體外外培培養(yǎng)養(yǎng)的的種種類類細胞生長曲線的測繪方法：細胞生長曲線的測繪方法： 接種78組細胞；每組至少三瓶，每日抽一組，將培養(yǎng)液倒入帶刻度試管中記下毫升量，用胰酶消化細胞至脫壁，再把培養(yǎng)液倒回培養(yǎng)瓶中混勻，制成單細胞懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)；然后根據(jù)每天的細胞數(shù)繪成生長曲線。細胞固定化培

11、養(yǎng)即包埋培養(yǎng)： 材料：凝膠海藻鈣、膠原、交叉膠和瓊膠等。 貼壁細胞： 膠原。 非貼壁細胞：海藻鈣。 方法：細胞懸液與23的海藻鈣混合，通過成滴器滴入50100mmol/L的CaCl2溶液中，約1h后形成許多穩(wěn)定的內(nèi)含細胞的多孔珠（ 36mm）用生理鹽水洗滌然后將多孔珠放入培養(yǎng)容器中。 回收：加適量EDTA使多孔珠溶解，離心回收 細胞。包埋的優(yōu)點：1、步驟簡單，條件溫和2、細胞負荷量大，泄漏少。3、凝膠網(wǎng)絡可以保護細胞抵抗機械剪切。包埋的缺點：1、細胞的生長擴散受到限制。2、大分子物質(zhì)不能滲透凝膠高聚物、胚胚 胎胎 干干 細細 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng)歷史：歷史： Evans和Kaufman(1981)

12、首次從小鼠的胚胎中分離得到小鼠ES細胞。后來又分離得到許多其他動物（豬、牛、綿羊、山羊、家兔、水貂、倉鼠以及人）的ES細胞。但以小鼠的ES細胞分離方法最成熟。技術(shù)路線：技術(shù)路線： 手術(shù)切除受精2.5d的小鼠的卵巢，并同時給予外源激素改變母體生殖激素水平，抑制胚胎著床從而獲得延遲著床的胚囊。 將其培養(yǎng)于用有絲分裂C處理的小鼠胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層，從而獲得能夠在體外增殖并處于未分化狀態(tài)的早期胚胎ICM(inner cell mass,內(nèi)細胞團) 將ICM離散開，并培養(yǎng)于小鼠胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層上，得到在體外無限增殖、連續(xù)傳代的多能胚胎干細胞系1、早期胚胎獲取及處理方法； 小鼠3.5d囊胚或2.5d

13、桑椹胚（1620細胞） 豬 910d囊胚； 兔 34d囊胚； 牛 67d桑椹胚或78d囊胚； 綿羊 89d囊胚步驟步驟：a)、延緩胚胎著床摘除卵巢或給予外源性激 素。b)、分離ICM人工去除滋養(yǎng)層細胞（消除競 爭性抑制和分化誘導）c)、脫帶處理去除透明帶（胰酶、透明質(zhì)酸 酶和機械）d)、離散卵裂球ICM經(jīng)胰酶消化并輔以機械 方法分散成單個卵裂球，接種 于飼養(yǎng)層上。2、原始生殖細胞的獲取小鼠12.5d胎兒生殖嵴大鼠10.5d尿囊中胚層，12.5d背腸系膜和 13.5-14.5d生殖嵴1、飼養(yǎng)層：用絲列霉素C處理細胞單層，阻斷細胞有絲分裂后所得到的細胞單層。l作用：促進細胞增殖和抑制細胞分化l常用

14、：原代小鼠胎兒成纖維細胞PMEE, l 小鼠胎兒成纖維細胞系STO、l 子宮上皮細胞UE,l 同源胎兒成纖維細胞HEF2 2、條件培養(yǎng)基：、條件培養(yǎng)基：作用：利用其含有的細胞分泌的生長因子來 刺激ES細胞的增殖和抑制ES細胞的分化。優(yōu)點：操作簡單，消除飼養(yǎng)層細胞干擾，又使ES 細胞免受絲裂霉素C的影響。分化抑制因子分化抑制因子： 白血病抑制因子。胚胎干細胞系的建立與保存： 及 時 換 液； 及 時 傳 代； 不 斷 凍 存。一、氣升式深層培養(yǎng)系統(tǒng)二、微載體培養(yǎng)系統(tǒng):l 細胞生長環(huán)境均一，培養(yǎng)基利用率高，采樣重復性好；放大培養(yǎng)容易，占用空間小，勞動強度小。三、微囊培養(yǎng)系統(tǒng)：l 防止污染，細胞密度

15、大，分泌產(chǎn)物量高；產(chǎn)物分離純化方便。四、大載體培養(yǎng)系統(tǒng)l 海藻酸鈉的凝膠大顆粒2.6mm裝入培養(yǎng)器通入培養(yǎng)液和混合氣體大規(guī)模培養(yǎng)，配有先進的監(jiān)控設備，控制氧氣，pH，培養(yǎng)的輸入和產(chǎn)物的收獲。n五、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)n有聚砜和丙烯聚合物制成的中空管狀纖維，管壁厚約50-75，管壁似海綿，毛細管壁是半透膜。n培養(yǎng)器：n內(nèi)室：n外室：l一、體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)l懸浮培養(yǎng)球形l貼壁培養(yǎng)成纖維細胞型l 上皮細胞型l 游走細胞型l 多形細胞型1、成纖維型細胞：形態(tài)與體內(nèi)成纖維細胞相似而得名，細胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出2-3個長短不同的突起。細胞在生長時多呈放射狀，火焰狀或旋渦狀走

16、行。來源來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織. 如：真正的成纖維細胞心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內(nèi)皮生長特點生長特點 排列成放射狀，漩渦狀并不緊靠連成片，細排列成放射狀，漩渦狀并不緊靠連成片，細胞胞細胞接觸易斷開而單獨行動游離的單獨的成纖細胞接觸易斷開而單獨行動游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起. 2 2、上皮型細胞、上皮型細胞： 具有扁平不規(guī)則多角形，中有圓形核，細胞緊密相連成單層膜。 起源于內(nèi)、外胚層細胞 如:皮膚表皮及其衍生物消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮等 皆呈上皮型形態(tài)皆呈上皮型形態(tài)。3 3、游走型細胞、游走型細胞： 本型細胞在支持物上散在生

17、長，一般不連成片。 細胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，成活躍的游走或變形運動，速度快而且不規(guī)則。 此型細胞不穩(wěn)定，有時亦難和其它型細胞相區(qū)別。聯(lián)接成片后可呈多角形，有時成纖維細胞形態(tài)。4 4、多形型細胞、多形型細胞： 除上述三型細胞外，還有一些組織和細胞如神經(jīng)組織的細胞等，難以確定它們規(guī)律的形態(tài)，可統(tǒng)稱為多形型細胞。培養(yǎng)細胞形態(tài)分類的探討 當細胞處于較好的培養(yǎng)條件時，形態(tài)上有相對的穩(wěn)定性，在一定程度上能反映細胞的起源，正常和異常也能夠區(qū)分開來，故可作為判斷細胞生物學性狀的一個指標或依據(jù)。n體外細胞培養(yǎng)有很大的可塑性：受到培養(yǎng)條件的影響：培養(yǎng)基，溫度，pH，細胞密度，污染狀況，培養(yǎng)方式等。n條件改變，細

18、胞形態(tài)可有變化 因此由于細胞形態(tài)的易變性，在利用形態(tài)學指標判定細胞類型和其它一些性狀時，應持謹慎態(tài)度。培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定血清血清 Hela 高血清高血清 低血清低血清 成纖維細胞樣成纖維細胞樣 上皮樣細胞上皮樣細胞 pH Hela 太酸或太堿太酸或太堿 標準標準pH 成纖維細胞樣成纖維細胞樣 上皮樣細胞上皮樣細胞 細胞密度細胞密度 3T3 低密度低密度 高密度高密度 成纖維細胞樣成纖維細胞樣 上皮樣細胞上皮樣細胞生長狀態(tài)改變生長狀態(tài)改變懸浮或貼附懸浮或貼附 懸浮懸浮 貼附貼附 圓形圓形 成纖維或上皮樣成纖維或上皮樣 轉(zhuǎn)化與否轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化未轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)化后 成纖維樣成纖維

19、樣 可成上皮樣可成上皮樣 細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。 此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著，細胞附著或貼附與底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。 貼附速度與細胞的種類，培養(yǎng)基成分，底物的理化性質(zhì)有關。 初代培養(yǎng)細胞貼附慢，可長達10-24小時或更長；連續(xù)和惡性轉(zhuǎn)化細胞系快，10-30分鐘即可貼壁。 細胞貼附于支持物上后，經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖。 在潛伏期時細胞可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。 初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24-96小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6-24小時。 潛伏期除與細胞類型有關，還與細胞接種密度，培養(yǎng)基性質(zhì)有關。 當細胞分

20、裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入指數(shù)增生期。 指數(shù)增生期指數(shù)增生期(Logarithmic (Logarithmic growth phase) growth phase) 這是細胞增殖最旺盛的階段，細胞分裂相增多。 指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂指數(shù)表示。細胞分裂指數(shù)(Mitotic Index: MI):細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。分裂相指處于分裂中的細胞。 指數(shù)增生期指數(shù)增生期體外培養(yǎng)的細胞分裂指數(shù)受細胞的種類、培養(yǎng)液成分，PH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。 一般細胞分裂指數(shù)介于0.1%-0.5%。 初代細胞分裂指數(shù)低，

21、連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%-5%b、指數(shù)增生期是細胞一代中活力最好的時期，因此是進行各種實驗最好的和最重要的階段。C、接觸抑制(Contact inhibition)隨著培養(yǎng)細胞數(shù)量的不斷增多，生長空間也漸趨減少，細胞相互接觸匯合成片，如培養(yǎng)的是正常的細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制。惡性細胞無接觸抑制，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積。 接觸抑制可作為區(qū)別惡性細胞與正常細胞的標志之一。 指數(shù)增生期d.密度抑制(Density Inhibition): 細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。

22、 但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，而發(fā)生密度抑制，導致細胞分裂停止。 指數(shù)增生期3、停滯期(Stagnate phase)l 細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞停止增殖，進入停滯期。l 此時細胞數(shù)量持平，故也稱平頂期(platean)停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累，pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳一兩代，通過換液淘

23、汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。結(jié)果反而耽誤了時間。 停滯期 無污染環(huán)境 培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證培養(yǎng)細胞生存條件的首要條件。 機體內(nèi)因為有免疫系統(tǒng)及肝臟等解毒器官，可以抵御病原的侵入，以及將有毒物解毒并排除體外。細胞一旦被置于體外，便失去了防御能力，一旦被污染或自身代謝物積累，可導致細胞死亡。 因此在進行培養(yǎng)時，保持細胞生存環(huán)境無任何污染，代謝物及時消除等，是維持細胞生存的基本條件。二、培養(yǎng)細胞生存環(huán)境條件 溫度 維持細胞增殖生長，必須有適宜的溫度。v 人和哺乳動物36.50.5v 鳥類細胞為38.5，一般36.5v 海水魚類20-25v 對蝦：22-31 總的來說，培養(yǎng)細

24、胞對低溫的耐受力比對高溫強。 43以上1小時，細胞將被殺死。而溫度不低于0，對細胞代謝雖有影響，但并無傷害作用。 氣體環(huán)境和氫離子濃度P氣體是細胞生存的必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。P氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長，增殖和合成各種所需成分。二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，它的主要作用在于能維持培養(yǎng)基的pH值。大多數(shù)細胞的pH為7.2-7.4。 在封閉營養(yǎng)時，細胞代謝不斷釋放二氧化碳，pH變酸，需用堿來調(diào)整； 在開放培養(yǎng)時，細胞代謝不斷釋放二氧化碳，能逸出到外界環(huán)境中，而溶液變堿，因此我們在開放培養(yǎng)時，需將培養(yǎng)瓶放在含有5%二氧化碳的氣體環(huán)境中。采用二氧化碳孵

25、育箱。 體外培養(yǎng)細胞生存所需基本物質(zhì) 需要糖、氨基酸、維生素、促生長因子（激素類物質(zhì)，尤其促生長因子）、微量元素、促貼附物質(zhì)。5.滲透壓： 大多數(shù)細胞 260-320mosm/kg 對蝦 800 mosm /L左右l定義： 指細胞在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生與原代細胞形態(tài)、核型、增殖或其他特性的可遺傳的變化。 l原因：外源性、自然發(fā)生、化學致癌物 l 的誘導定義：是指細胞在體外培養(yǎng)過程中獲得了致癌性，當這種細胞接種于適當?shù)膭游?，可以產(chǎn)生腫瘤。轉(zhuǎn)化種類：倍性轉(zhuǎn)化、腫瘤性轉(zhuǎn)化、惡性轉(zhuǎn)化l生長特性l永生性l貼壁不依賴性l接觸抑制喪失l在細胞單層上聚集生長和堆積生長l生長密度抑制降低和高的生長飽和度密度l低血

26、清依賴性l生長因子不依賴性l貼壁率高l倍增時間短遺傳特性自然突變率高非整倍體化異倍體化腫瘤特性致瘤性血管生成性蛋白水解酶分泌旺盛侵染性 定義；中末分化的細胞在體外人工環(huán)境下，重新獲得分裂增殖的能力，有些細胞還會失去其特異分化性質(zhì)，甚至通過誘導也不能再現(xiàn)。這種現(xiàn)象叫 體外培養(yǎng)的細胞能否發(fā)生去分化，重新獲得增殖能力，是獲得細胞系的關鍵所在。* 體外細胞培養(yǎng)的目的： 培養(yǎng)出的細胞系發(fā)生去 分化，但仍維持 分化功能。 * 已經(jīng)成功的細胞系： 小鼠骨瘤細胞 產(chǎn)生抗體 大鼠腦垂體瘤細胞分泌生長激素 人類胎盤細胞分泌絨毛膜促性腺激素 1、培養(yǎng)細胞常規(guī)檢查2、細胞系鑒定1、培養(yǎng)液pHl酚紅作為pH指示劑l中性

27、櫻桃紅色l堿性粉紅色l酸性黃色變酸的原因：細胞生長放出CO 2；培 養(yǎng)液營養(yǎng)耗盡，酸性代謝物廢物積累。 污染細菌和霉菌。2、細胞健康狀況：生長狀態(tài)良好透明度大、細胞內(nèi)顆粒少、 沒有空泡，胞膜清晰,胞液清晰透明， 懸浮細胞碎片少。生長狀態(tài)不良胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和 其他顆粒， 細胞之間出現(xiàn)空隙，細胞 形態(tài)不規(guī)則。3、微生物污染及其排除：A、細菌：、細菌：鑒定 取細胞培養(yǎng)液接種于肉湯或瓊脂培養(yǎng)基， 37C培養(yǎng)數(shù)日，培養(yǎng)基混濁。 取細胞培養(yǎng)液涂平板，菌落形成結(jié)決方法:加510倍常用劑量抗生素，沖擊細胞2448h，再轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)基B、真菌、真菌鑒定： 肉眼可見白色、黃色、黑色菌落。 光鏡絲狀、樹枝狀、

28、或瘤狀菌絲。 酵母菌出芽生殖特性。 C、支原體、支原體鑒定：較難（對細胞作用不明現(xiàn)， 嚴重時細胞增殖減慢）檢測：DNA熒光染色法，支原體培養(yǎng)法（“煎蛋樣”菌落） 免疫學方法，PCR等 排除支原體污染的方法：排除支原體污染的方法：a)、抗生素法：卡那霉素、泰樂霉素等b)、特異性抗血清處理c)、高熱處理41作用510h,最長18h.d)、巨噬細胞和抗生素聯(lián)合處理：比例100：1e)、鼠的傳代處理：“蝕斑”是病毒污染的早期指示特征。交叉污染的后果： a、 污染的細胞增殖超過被污染細胞細胞系丟失。 b、污染的細胞是細胞系不純不能用于實驗研究。5、化學污染1、形態(tài)學分析：、形態(tài)學分析：注：注：條件的一致

29、性培養(yǎng)液、培養(yǎng)基質(zhì)、l 細胞密度、生長條件2、細胞生長情況：、細胞生長情況：lA、分裂指數(shù)lB、生長曲線lC、集落或克隆形成率高，生存能力強。lD、細胞表面受體改變惡性細胞高于正 l 常細胞3、染色體分析、染色體分析 是細胞遺傳學的基礎： 作用： 鑒定細胞系的種屬和性別來源。 檢測細胞系遺傳物質(zhì)是否穩(wěn)定。 離體培養(yǎng)的細胞是否轉(zhuǎn)化。 區(qū)別異常和正常細胞。 定義：是指同一種屬中由不同基因位點或同一位 點的復等位基因編碼的多肽鏈所組成的單體、 同聚體或雜聚體。 特點：具有種屬特異性、發(fā)育特異性及 組織特異性。 意義：鑒定細胞系的種屬 作為細胞系細胞特征的指標 鑒定細胞是否惡性轉(zhuǎn)化或區(qū)分正常和腫瘤 細

30、胞。 鑒定細胞系在培養(yǎng)過程中有無交叉感染。 常用的：乳酸脫氫酶（LDH）; 6-磷酸葡萄糖脫氫 酶（G6PD）; 嘌呤核苷酸磷酸化酶（NP）5、軟瓊脂細胞克隆形成分析：、軟瓊脂細胞克隆形成分析： 是細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，失去貼壁依賴型的重要檢測指標。 步驟： 1、制備1103個細胞/mL的細胞懸液 2、制備底層瓊脂(0.5%) 3、制備接種瓊脂(細胞懸液與50的瓊脂混合) 靜置培養(yǎng)23周，計算細胞克隆數(shù) （每個克隆的細胞數(shù)大于25）l細胞表面抗原：LC亞種分類，上皮C與基質(zhì)C l 區(qū)分，N外胚層C與其他胚層C區(qū)分。l中間絲蛋白：星形膠質(zhì)C的膠質(zhì)原f酸性Pr、肌肉 l 的結(jié)Pr等。l特意表達產(chǎn)物：紅C的

31、血紅Pr、肌肉的肌球Pr和肌l 原Pr等。l標記酶：肝癌C系HTC表達酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等。l專一性功能：心肌的收縮功能，NC膜的去極化等l轉(zhuǎn)化特征：永生性轉(zhuǎn)化，染色體倍性轉(zhuǎn)化，形態(tài)l 學轉(zhuǎn)化，腫瘤性轉(zhuǎn)化，惡性轉(zhuǎn)化。 細胞DNA含量和組成是最恒定均一的指標。每個細胞DNA含量、RNA/DNA含量之比、 蛋白質(zhì)/DNA含量之比的測定。原位核酸雜交技術(shù)分子標記鑒定1、非玻璃化凍存2、玻璃化凍存l1、原 理l冰晶損傷和溶質(zhì)損傷：l細胞內(nèi)冰晶損傷細胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細胞損傷，稱l溶質(zhì)損傷因電解質(zhì)濃度過高而引起的細胞損傷，稱細胞內(nèi)外形成冰晶低于0細胞膜和細胞器損傷電解質(zhì) 濃度C內(nèi)結(jié)冰C外結(jié)冰時間過長細胞膜上

32、脂質(zhì)受損細胞膜破裂大量水分流入細胞內(nèi)大量水分流入細胞內(nèi) 造成細胞死亡造成細胞死亡l緩慢冷凍和快速復蘇細胞以及冷凍保護劑的作用l冷凍保護劑:l 滲透性甘油、DMSO、乙二醇、乙酰胺和甲醇。l 非滲透性大分子物質(zhì)，聚乙烯吡咯酮（PVP）、蔗糖、 l 聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。l滲透性保護劑的作用：l a、降低細胞的冰點；l b、提高細胞膜對水的通透性l c、稀釋細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃 度，從 l 而減少溶質(zhì)損傷。非玻璃化凍存：非玻璃化凍存： “ 緩慢凍存”、“快速復蘇”、“冷凍保護劑” 等措 施來減少冰晶損傷。具體步驟：具體步驟：、緩慢凍存進行階段性降溫。、快速復蘇驟然升溫，避免水重結(jié)晶

33、，減少冰晶損 傷。、冷凍保護劑甘油或DMSO以5的終濃度加到培養(yǎng) 液中。步驟步驟：生長好的C， 凍前24h換液胰Pr酶消化、離心甘油、DMSO21066106細胞/mL 凍存液分裝塑料凍存管4放3060min-70冰箱放12d塑料棉花等包裹直接投入液氮使用降溫儀：1、從5-30以每分鐘13速度降；2、每分鐘2030降至-100-1503、放入液氮中l(wèi)從液氮中取出快速放入3740水浴中l(wèi) l盡快融凍后接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，補加培養(yǎng)液l 貼壁后馬上換液凍存溫度：液氮（-196）較干冰（-79）效果好冷凍速度：緩慢冷凍較快速冷凍對細胞結(jié)構(gòu)影響小溶凍速度：溶凍速度愈快，細胞存活率越高冷凍保護劑：蔗糖對快速冷

34、凍和慢速冷凍都有保護作用 PVP僅對慢速冷凍又保護作用1、原理： 玻璃化是指液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉墙Y(jié)晶態(tài)（玻璃態(tài)）的固化過程。玻璃態(tài)固體分子之間的空間排列和液態(tài)相比無明顯變化。 技術(shù)支持只要降溫速度足夠快，任何液體 都可以進入玻璃化狀態(tài)。 解決方法： a、尋求容易實現(xiàn)玻璃化并且對細胞 損害較小的溶液 b、設法提高冷凍速度二、玻璃化凍存： 指液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉墙Y(jié)晶態(tài)玻璃態(tài)的固化過程。 “快速冷凍快速冷凍”“緩慢復蘇緩慢復蘇”“冷凍保護劑冷凍保護劑”步驟：1、“快速冷凍”: 冰浴加預冷凍存液液氮 原理： 胞內(nèi)水分來不及形成冰晶，或冰晶很少。細胞進入一種人工的完全玻璃化狀態(tài)，水分子無重排，不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)、體積的變化，故

35、不會引起冰晶、溶質(zhì)損傷。2、“緩慢復蘇” 液氮冰浴5分鐘。3、冷凍保護劑濃度高，對細胞毒性大，故滴加和棄除時均需冰浴條件下緩慢進行，保證冷凍保護劑有足夠時間滲出細胞，避免對細胞損害。冷凍步驟：冷凍步驟：制備凍存液Hanks平衡鹽溶液20.5%DMSO（W/V）15.5%乙酰胺（W/V）10丙二醇10聚乙二醇NaOH調(diào)pH至7.4制備動物細胞常規(guī)方法離心制備凍存動物細胞，置冰浴中添加凍存液緩慢滴加，終濃度為1.1061.5106個細胞/mL 前3min以0.3mL/min; 后5min以0.6mL/min分裝入凍存小管混 勻直接投入液氮直接投入液氮復復 蘇蘇 步步 驟驟：取出冰浴取出冰浴5min

36、轉(zhuǎn)移到大離心管轉(zhuǎn)移到大離心管冰浴冰浴用預冷的用預冷的20的的Hanks平衡也稀釋平衡也稀釋稀釋后低速離心稀釋后低速離心稀釋過程緩慢緩慢進行： 50mL需65min前10min0.2mL/min; 10min0.5mL/min ； 15min0.75mL/min； 30min1mL/min1、分離同步化細胞2、誘導細胞同步化l1、各期細胞的分離A、離心洗脫法： 原理：C大小、密度和形狀不同，其在一定介質(zhì)中的浮力大小不同，當C浮力與離心力達到平衡后，停留在淘洗室的不同位置。降低離心速度增加液流量，不同細胞先小后大流出來。DNA熒光染色，流式細胞儀測定DNA含量。 難點：特殊離心轉(zhuǎn)頭和流式細胞儀B、

37、細胞分類揀選法：原理：熒光染色DNA，用流式細胞儀檢測難點：DNA染色時RNA同時被染色。C、梯度沉降法： 根據(jù)形狀、大小和密度不同的細胞，在密度梯度溶液的沉降速度不同來分離細胞的。* 梯度溶液：含血清或Ficoll的PBS來制備。* 條件：溫度越低，溶液黏度越大，沉降效果越好。 操作在4進行2、M期細胞的分離： 細胞特點：從G2期進入M期，胞體逐漸 隆起，成為圓球形，此時細胞與培養(yǎng)基質(zhì)的黏 附力大為降低，極易脫落。振搖脫落法： 接種2d后，換液，12h后倒掉舊液， 加新培養(yǎng)液搖晃，使M期細胞脫落。胰蛋白酶消化法： （同上）加0.1%冷胰蛋白酶，輕輕 搖晃，離心回收。1、G1/S期細胞的分離：

38、處理方法： 低溫處理法、營養(yǎng)饑餓法和DNA合成阻斷法 低溫處理法： 4處理210h，細胞阻滯在G1期 營養(yǎng)饑餓法： 低血清、異亮AA或精AA培養(yǎng)基，然后恢復正常。 胸腺嘧啶核苷酸阻斷法： 胸腺嘧啶進入細胞后，會迅速轉(zhuǎn)換成脫氧胸腺嘧啶核苷三磷酸，而后者可以反饋抑制核苷還原酶的活性，阻止其他脫氧核苷三磷酸的合成，阻抑DNA的合成。2、M期細胞分離： 秋水仙素（0.051g/mL）處理細胞， 使細胞阻滯于M期一、器官培養(yǎng)的基本方法二、器官培養(yǎng)在生物學和醫(yī)學上的應用1、原則： a、必須給培養(yǎng)物提供充足的營養(yǎng)和氧氣，并及時排除代謝廢物。l 組織塊要小，創(chuàng)面平整 b、抑制細胞從外植塊中遷移生長出來l將培養(yǎng)

39、物放置在遷移時細胞難以有力黏附的表面。l用一層薄的瓊脂包被培養(yǎng)物l把培養(yǎng)物經(jīng)常轉(zhuǎn)移到新的表面上表玻璃培養(yǎng)法：血漿和胚胎提取液瓊脂凝膠培養(yǎng)法：合成、天然培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法：外植塊懸浮于培養(yǎng)液氣液界面上的培養(yǎng)：直接漂浮法、擦鏡紙法、 金屬格柵法循環(huán)培養(yǎng)液培養(yǎng)法：器官灌注培養(yǎng)法：較大的完整器官培養(yǎng)環(huán)境：l 血清、胚胎提取液、培養(yǎng)基質(zhì)團塊效應：l 細胞間的相互作用。細胞數(shù)量達到一定時可以引起N系統(tǒng)的分化。不同組織間的相互作用：l 如：上皮細胞與間充質(zhì)細胞接觸可以引起分化。l1、器官的形態(tài)發(fā)生研究l2、器官的發(fā)育分化研究l3、胚胎致畸作用的研究l4、器官移植研究l5、腫瘤侵襲研究1、動物細胞的形狀主要有哪

40、幾類？2、體外培養(yǎng)動物細胞的生長曲線有何特點？ 外植塊外植塊：為體外培養(yǎng)而切下的一小塊組織或者器官。 細胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細胞系 亞系：由原細胞系分離出的與原細胞系不同性狀的細胞系。 有限細胞系：傳代次數(shù)有限的細胞系。 連續(xù)細胞系：發(fā)生了轉(zhuǎn)化，獲得了用生性，可以在體外永久存活下來的細胞系，也成為已建成的細胞系，或永生性細胞系 體外轉(zhuǎn)化： 細胞在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生與原代細胞形態(tài)、核型、增殖或其他特性的可遺傳的變化 惡性轉(zhuǎn)化： 細胞在體外培養(yǎng)過程中獲得了致瘤性，當把這種細胞接種動物時可以產(chǎn)生腫瘤 克?。?由單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體。 細胞株： 通過選擇法或克隆形成法，從原代細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或者特異標記的培養(yǎng)物。 貼壁依賴性： 細胞需貼附在培養(yǎng)基質(zhì)上才能生長的特性，我們稱該細胞具有。 接觸抑制： 體外培養(yǎng)細胞匯合接觸后，生長和增殖停止的現(xiàn)象 匯合： 培養(yǎng)瓶中貼壁生長的細胞彼此相互接觸，從而鋪滿培養(yǎng)瓶的生長面形成細胞單層的過程 密度抑制： 細胞的數(shù)量達到一定的量后抑制生長，該特性被稱為Vero細胞