DNA限制性內(nèi)切酶 分生討論

1、主講：葉晨 陳炳宏（麻醉1201） 每當(dāng)我走進(jìn)父親的辦公室，總會(huì)看見(jiàn)他桌上放著的一些培養(yǎng)皿，里面裝的是菌群。它們就象一個(gè)住著許多居民的城市，在每一種細(xì)菌中都有一個(gè)國(guó)王，他長(zhǎng)得瘦瘦的、高高的。國(guó)王有很多仆人，這些仆人長(zhǎng)得矮矮胖胖的，跟皮球差不多。父親把國(guó)王叫做“DNA”，仆人叫做“酶”。國(guó)王就像一本書，仆人們做的每一件事情在這本書中都有記載。對(duì)于我們?nèi)祟悂?lái)說(shuō)，國(guó)王記載的這些細(xì)目是個(gè)謎。 我爸爸已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了其中的一個(gè)仆人，他的工作就像一把剪刀，如果有外國(guó)國(guó)王來(lái)侵犯一個(gè)細(xì)菌，這個(gè)仆人就會(huì)把他剪成小碎片，但他不會(huì)對(duì)自己的國(guó)王造成任何傷害。 聰明的人類用這個(gè)帶著剪刀的仆人來(lái)探究國(guó)王的秘密，他們搜集了很多帶

2、剪刀的仆人，并把他們放進(jìn)一個(gè)國(guó)王里，這個(gè)國(guó)王就被剪成了碎片。用這種方法得到的小碎片使人類探究國(guó)王的秘密變得容易了。爸爸就是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了帶著剪刀的仆人而獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。 限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn) 這是瑞士微生物遺傳學(xué)家W阿爾伯（1929）的女兒西爾維婭（當(dāng)時(shí)10歲）在聽(tīng)完父親給她講完限制性內(nèi)切酶后寫下的一個(gè)故事，限制性內(nèi)切酶就是故事中帶剪刀的仆人。 限制性內(nèi)切酶能夠在DNA上尋找特定的“切點(diǎn)”，認(rèn)準(zhǔn)后將DNA分子的雙鏈交錯(cuò)地切斷。因此，限制性內(nèi)切酶被稱為“分子剪刀”，它可以完整地切下個(gè)別基因。 1965年，阿爾伯首次從理論上提出了生物體內(nèi)存在具有切割基因功能的限制性內(nèi)切酶。并于19

3、68年成功分離出I型限制性內(nèi)切酶，但這種酶的切割基因功能不理想。1970年，美國(guó)分子生物學(xué)家、遺傳學(xué)家HO史密斯（1931）分離出了II型限制性內(nèi)切酶。1971年，美國(guó)微生物遺傳學(xué)家D內(nèi)森斯（1928）使用II型限制性內(nèi)切酶首次完成了對(duì)基因的切割。他們的研究成果為人類在分子水平上實(shí)現(xiàn)人工基因重組提供了有效的技術(shù)手段，他們于1978年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 DNA限制性內(nèi)切酶原理酶切反應(yīng)實(shí)驗(yàn)步驟影響因素結(jié)果分析討論核酸限制性內(nèi)切酶（restriction enzyme）是一類能識(shí)別雙鏈DNA特定堿基序列的核酸水解酶。能識(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)并裂解磷酸二酯鍵。特異位點(diǎn)：特定的堿基序列

4、，通常是46個(gè)堿基對(duì)、具有回文序列的DNA片段，大多數(shù)酶是錯(cuò)位切割雙鏈DNA分子，產(chǎn)生5或3粘性末端。磷酸二酯鍵：一種化學(xué)基團(tuán)，指一分子磷酸與兩個(gè)醇（羥基）酯化形成的兩個(gè)酯鍵。該酯鍵成了兩個(gè)醇之間的橋梁。例如一個(gè)核苷的3羥基與另一個(gè)核苷的5羥基與同一分子磷酸酯化，就形成了一個(gè)磷酸二酯鍵。一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理限制性核酸內(nèi)切酶都是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的，可以為宿主抵御外來(lái)DNA的侵襲。根據(jù)酶的切割特性、催化條件及是否具有修飾性可分為I、II、III型三大類。I型酶具有核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四種活性。其內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)和切割部位不一致，相距幾千個(gè)堿基，無(wú)固定的切割位點(diǎn)，不產(chǎn)生特

5、異片斷。III型酶和I型酶類似，也有甲基化功能，但無(wú)ATP酶和DNA解旋酶活性。此類酶可在DNA鏈的特異位點(diǎn)切割，但切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外，一般相距幾十個(gè)堿基，對(duì)基因工程的意義也不大。分類分類 II型酶限制修飾系統(tǒng)分別由限制酶和修飾酶組成。II型限制酶需要Mg2+作為催化反應(yīng)輔助因子，能識(shí)別雙鏈DNA的特定序列，一般為4-6個(gè)堿基的反轉(zhuǎn)重復(fù)序列。II型限制酶一般在識(shí)別序列內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的DNA片斷。 II型修飾酶識(shí)別和II型限制酶一致的DNA序列，但其作用是負(fù)責(zé)對(duì)識(shí)別序列的甲基化修飾。 基因工程中使用的DNA限制性內(nèi)切酶 II型限制酶切割DNA雙鏈可產(chǎn)生三種不同的DNA末端：平末端、5端

6、突出的粘性末端、和3端突出的粘性末端。BamH I識(shí)別及切割位點(diǎn)： 5GGATC C3 3C CTAGG5 5G3 5GATCC3 3CCTAG5 3G5Xho I識(shí)別及切割位點(diǎn)：5CTCGA G3 3G AGCTC5 二、二、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)1.配制反應(yīng)體系 DNA：必須具備一定純度，微量的酚、氯仿、大于10mM的EDTA、去垢劑、及高鹽的存在均將影響限制性內(nèi)切酶的活性。DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的重要因素。 反應(yīng)緩沖液：不同廠家、不同的酶都有不同的最佳反應(yīng)條件。應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書操作。雙酶切時(shí)要選擇兩種酶都具有最高活性的緩沖液。 反應(yīng)容積：在DNA濃度0.4g/l的情況下，

7、根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求選擇合適的反應(yīng)容積。過(guò)高濃度的DNA會(huì)使溶液過(guò)于粘稠影響酶的擴(kuò)散，并降低酶活性。 內(nèi)切酶及使用的酶量根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇限制性內(nèi)切酶。1個(gè)酶活力單位的定義：在50l反應(yīng)體系中，1gDNA在推薦的反應(yīng)緩沖液和溫度下反應(yīng)1個(gè)小時(shí)，被完全酶切所需要的內(nèi)切酶的量。過(guò)量的酶可縮短反應(yīng)時(shí)間。但使用過(guò)多的酶將導(dǎo)致識(shí)別序列特異性下降。一般采用2-10倍的酶量。加入酶的總?cè)莘e不能超過(guò)反應(yīng)體系總?cè)莘e的10%。否則甘油終濃度將達(dá)到5%以上，將抑制酶的活性。 2.酶切溫度及時(shí)間：根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明確定最佳反應(yīng)溫度。反應(yīng)時(shí)間不宜太長(zhǎng)，以免內(nèi)切酶產(chǎn)生星活性。星活性（Star Activity）：是指限制性內(nèi)切酶在

8、某些反應(yīng)條件產(chǎn)生的識(shí)別并切割非特異序列位點(diǎn)的現(xiàn)象。其結(jié)果是酶切條帶增多。星活性除了與酶本身的性質(zhì)有關(guān)外，與酶過(guò)量、甘油濃度過(guò)高，pH值不合適、離子濃度過(guò)低、酶切時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等有關(guān)。酶切時(shí)間比增加酶量更易產(chǎn)生星活性。 3.終止反應(yīng)：可以通過(guò)以下3種方式終止酶切反應(yīng)： 若DNA在酶切后不進(jìn)行進(jìn)一步的酶反應(yīng)時(shí)，可加入EDTA至終濃度10mM，或加入0.1%SDS。EDTA對(duì)酶的滅活徹底，但EDTA存在將使連接反應(yīng)變得極為困難。 若DNA在酶切后須進(jìn)行下一步的酶反應(yīng)，可將反應(yīng)產(chǎn)物置65或80加熱20分鐘。但有些酶加熱滅活不徹底。 用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀。4.酶切結(jié)果的鑒定 酶切完成后，取適量反應(yīng)液進(jìn)

9、行瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié)果。 1.按順序，在1.5ml微量離心管中配制反應(yīng)試劑： 10X Buffer（緩沖液）5l DNA (100ng/l)（質(zhì)粒） 44l BamH I (15Units/l)0.5l Xho I (10Units/l)0.5l2.混勻試劑。將離心管置37水浴，反應(yīng)1小時(shí)。三、三、實(shí)驗(yàn)步驟微量移液槍將微量離心管置于適當(dāng)支撐物上面（如插在泡沫塑料板上面）3. 瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段 制備1%瓊脂糖凝膠。 在每個(gè)酶切反應(yīng)管中加入1/10體積10X上樣緩沖液，混勻。 將樣品平均加入2個(gè)加樣孔內(nèi)，每個(gè)孔加樣27.5l。 135V衡壓電泳30-40分鐘。 在紫外燈下觀察酶切條

10、帶。 將酶切完全的質(zhì)粒大片斷、PCR產(chǎn)物從凝膠中切割下來(lái)，裝入1.5ml微量離心管中。 置-20保存。 四、影響因素內(nèi)切酶：內(nèi)切酶：n不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染；污染；n注意內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)及形成的粘性末端；注意內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)及形成的粘性末端；n內(nèi)切酶的用量：根據(jù)內(nèi)切酶單位和用量而定，內(nèi)切酶的用量：根據(jù)內(nèi)切酶單位和用量而定，通常通常 1u1u指在適當(dāng)條件下，指在適當(dāng)條件下，1 1小時(shí)內(nèi)完全酶解小時(shí)內(nèi)完全酶解ugug特定特定底物所需要的限制性內(nèi)切酶量，使用中一般底物所需要的限制性內(nèi)切酶量，使用中一般以以u(píng)g DNAug DNA對(duì)

11、對(duì)u u酶短時(shí)間為宜。酶短時(shí)間為宜。n同時(shí)內(nèi)切酶體積不能超過(guò)反應(yīng)體系，因內(nèi)切同時(shí)內(nèi)切酶體積不能超過(guò)反應(yīng)體系，因內(nèi)切酶中含甘油，體系中甘油超過(guò)會(huì)抑制內(nèi)酶中含甘油，體系中甘油超過(guò)會(huì)抑制內(nèi)切酶活力；切酶活力；n內(nèi)切酶操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行（冰上）；使用時(shí)防止內(nèi)切酶操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行（冰上）；使用時(shí)防止操作中對(duì)內(nèi)切酶的污染。操作中對(duì)內(nèi)切酶的污染。 n作為內(nèi)切酶底物，應(yīng)該具備一定的純度，其溶液中不作為內(nèi)切酶底物，應(yīng)該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、能含酚、氯仿、乙醚、SDSSDS、EDTAEDTA、高鹽濃度、酒精等，這、高鹽濃度、酒精等，這些因素的存在均不同程度影響限制性內(nèi)切酶的活力。些因素的

12、存在均不同程度影響限制性內(nèi)切酶的活力。n這種抑制可通過(guò)：這種抑制可通過(guò)： 增加酶作用單位數(shù)（增加酶作用單位數(shù)（1020U/ug DNA1020U/ug DNA）、）、 增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑 或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間加以克服?；蜓娱L(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間加以克服。： n反應(yīng)緩沖液主要由反應(yīng)緩沖液主要由TrisTrisHClHCl、NaClNaCl、Mg2Mg2+ +組成，其中組成，其中Mg2Mg2+ +為內(nèi)切酶輔基；為內(nèi)切酶輔基；nTrisTrisHClHCl維持反應(yīng)體系維持反應(yīng)體系pHpH值在值在7.2-7.67.2-7.6之間；之間；nNaClNaCl濃度不同形成種級(jí)別的離子

13、強(qiáng)度：濃度不同形成種級(jí)別的離子強(qiáng)度： 低鹽（低鹽（10mM NaCl)10mM NaCl) 中鹽（中鹽（50mM NaCl50mM NaCl） 高鹽（高鹽（100mM NaCl100mM NaCl）n 不同的內(nèi)切酶選擇特定的反應(yīng)緩沖液。不同的內(nèi)切酶選擇特定的反應(yīng)緩沖液。反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液： n大多數(shù)限制酶反應(yīng)溫度為大多數(shù)限制酶反應(yīng)溫度為，如，如EcoR, Hind, EcoR, Hind, BamH, PstBamH, Pst等，也有如等，也有如BclBcl需在需在下進(jìn)行反應(yīng)，下進(jìn)行反應(yīng)，n反應(yīng)時(shí)間根據(jù)酶的單位與用量之比來(lái)定，原則反應(yīng)時(shí)間根據(jù)酶的單位與用量之比來(lái)定，原則是酶：是酶：=：n1

14、212小時(shí)即可充分酶解。小時(shí)即可充分酶解。酶解溫度與時(shí)間：酶解溫度與時(shí)間：五、酶切結(jié)果 1 2 31 1泳道泳道 makermaker2 2泳道泳道 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA3 3泳道泳道 酶切產(chǎn)物酶切產(chǎn)物 從電泳結(jié)果可以看出，第三泳道出現(xiàn)兩個(gè)區(qū)帶，第二泳道只有一個(gè)比較寬大的區(qū)帶，也就是說(shuō)，限制性核酸內(nèi)切酶將質(zhì)粒切割成了性質(zhì)不同的兩部分，說(shuō)明了限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA的切割活性。六、分析討論一、如果DNADNA完全沒(méi)有被內(nèi)切酶切割？完全沒(méi)有被內(nèi)切酶切割？原因原因1. 1.內(nèi)切酶失活內(nèi)切酶失活2.2.DNADNA不純，含有不純，含有SDSSDS，酚，酚，EDTAEDTA等內(nèi)切酶抑制因子等內(nèi)切酶抑制因

15、子3.3.條件不適（試劑、溫度）條件不適（試劑、溫度）4.4.DNADNA酶切位點(diǎn)上的堿基被酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化甲基化5.5.DNADNA酶切位點(diǎn)上沒(méi)有甲基酶切位點(diǎn)上沒(méi)有甲基化（如化（如Dpn IDpn I）6.6.DNADNA位點(diǎn)上存在其它修飾位點(diǎn)上存在其它修飾7.7.DNADNA不存在該酶識(shí)別順序不存在該酶識(shí)別順序?qū)?duì)策策1. 1.標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性2.2.將將DNADNA過(guò)柱純化，乙醇沉淀過(guò)柱純化，乙醇沉淀DNADNA3.3.檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳4.4.換用對(duì)換用對(duì)DNADNA甲基化不敏感的同裂甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒酶酶解，重新將質(zhì)

16、粒DNADNA轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)化至dcm-dcm-，dam-dam-基因型的細(xì)菌菌株基因型的細(xì)菌菌株5.5.換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同裂換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同裂酶消化酶消化DNADNA（如（如San3A ISan3A I代替代替Dpn Dpn I) I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+dcm+ dam+菌菌株中擴(kuò)增株中擴(kuò)增6.6.將將DNADNA底物與底物與DANDAN混勻進(jìn)行切混勻進(jìn)行切割驗(yàn)證割驗(yàn)證7.7.換用其它的酶切割換用其它的酶切割DNADNA或過(guò)量酶或過(guò)量酶消化進(jìn)行驗(yàn)證消化進(jìn)行驗(yàn)證二、如果DNA切割不完全？原因原因1. 1.內(nèi)切酶活性下降內(nèi)切酶活性下降2.2.內(nèi)切酶

17、稀釋不正確內(nèi)切酶稀釋不正確3.3.DNADNA不純，反應(yīng)條件不佳不純，反應(yīng)條件不佳4.4.內(nèi)切酶識(shí)別的內(nèi)切酶識(shí)別的DNADNA位點(diǎn)上的堿位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存在其它修飾基被甲基化或存在其它修飾5.5.部分部分DNADNA溶液粘在管壁上溶液粘在管壁上6.6.內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn)內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn)7.7.酶切后酶切后DNADNA粘末端退火粘末端退火8.8.由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性蕩使內(nèi)切酶變性9.9.過(guò)度稀釋使酶活性降低過(guò)度稀釋使酶活性降低10.10.反應(yīng)條件不適反應(yīng)條件不適11.11.識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切

18、效率的核酸順序切效率的核酸順序?qū)?duì)策策1. 1.用用5-105-10倍量過(guò)量消化倍量過(guò)量消化2.2.用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶酶3.3.同上同上4.4.同上同上5.5.反應(yīng)前離心數(shù)秒反應(yīng)前離心數(shù)秒6.6.將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積7.7.電泳前將樣品置電泳前將樣品置6565保溫保溫5-105-10分鐘，取出后置冰浴驟冷分鐘，取出后置冰浴驟冷8.8.使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，避免強(qiáng)烈振蕩避免強(qiáng)烈振蕩9.9.適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏酶不能貯藏10.10.使用最佳反應(yīng)體系使用最佳反應(yīng)體系11.11.加大酶量加大酶量5-