細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí).

1、研究生實(shí)驗(yàn)技能培訓(xùn)講座研究生實(shí)驗(yàn)技能培訓(xùn)講座 細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心侯孟君侯孟君基本概念基本概念w細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) w細(xì)胞系細(xì)胞系w細(xì)胞株細(xì)胞株w原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)w傳代傳代 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)技術(shù)技術(shù) 即是選用各種細(xì)胞的即是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件最佳生存條件對(duì)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)，是廣活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)，是廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。細(xì)胞系細(xì)胞系w培養(yǎng)物開(kāi)始培養(yǎng)物開(kāi)始第一次第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞w有限細(xì)胞系（有限細(xì)胞系（Finite Cell Line

2、）w連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系（連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）w腫瘤細(xì)胞系或株腫瘤細(xì)胞系或株我國(guó)已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。我國(guó)已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞 具有不死性和異體接種致瘤性。具有不死性和異體接種致瘤性。 細(xì)胞株細(xì)胞株w用用單細(xì)胞單細(xì)胞分離培養(yǎng)增殖形成的具特定分離培養(yǎng)增殖形成的具特定生長(zhǎng)特性的細(xì)胞群生長(zhǎng)特性的細(xì)胞群w再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株。株。細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名細(xì)胞系或細(xì)

3、胞株的命名 以供體患者的姓名命名：以供體患者的姓名命名： HeLa （來(lái)源于宮頸癌）（來(lái)源于宮頸癌）以時(shí)間地點(diǎn)來(lái)命名：以時(shí)間地點(diǎn)來(lái)命名： CHO 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 （Chinese Hamster Ovary， ）宮宮-743： 宮頸癌上皮細(xì)胞，宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立）建立 每每3天傳代，每次接種天傳代，每次接種3105細(xì)胞細(xì)胞ml以組織來(lái)源命名：以組織來(lái)源命名：如如BHK(幼地鼠腎細(xì)胞幼地鼠腎細(xì)胞) 以臨床疾病類型命名：以臨床疾病類型命名：

4、如如BALL-1細(xì)胞系細(xì)胞系(來(lái)自來(lái)自B淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)w直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行的第一次培直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行的第一次培養(yǎng)物。養(yǎng)物。w優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 組織細(xì)胞剛脫離機(jī)體，生物性狀尚未發(fā)生組織細(xì)胞剛脫離機(jī)體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。的狀態(tài)。 大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)1.細(xì)胞種類：大鼠原代肝細(xì)胞；細(xì)胞種類：大鼠原代肝細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：剛分離，未經(jīng)培養(yǎng)；培養(yǎng)的天數(shù)：剛分離，未經(jīng)培養(yǎng)； 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：剛分離時(shí)球形透亮，貼細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：剛分離時(shí)球形透亮

5、，貼壁壁 后呈不規(guī)則。后呈不規(guī)則。 傳代傳代w將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)w原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長(zhǎng)、繁殖一定時(shí)間后，由于原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長(zhǎng)、繁殖一定時(shí)間后，由于空間不足空間不足或或細(xì)胞密度過(guò)大細(xì)胞密度過(guò)大導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)枯竭，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此需要導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)枯竭，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。 HepG2細(xì)胞細(xì)胞 細(xì)胞種類：人肝腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞種類：人肝腫瘤細(xì)胞； 培養(yǎng)的天數(shù)：傳代培養(yǎng)培養(yǎng)的天數(shù)：傳代培養(yǎng)2天；天； 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：呈多角型、不規(guī)則細(xì)胞狀態(tài)與特

6、征簡(jiǎn)述：呈多角型、不規(guī)則 貼壁生長(zhǎng)，成團(tuán)聚集。貼壁生長(zhǎng)，成團(tuán)聚集。 傳代注意事項(xiàng)傳代注意事項(xiàng)w接種數(shù)量為接種數(shù)量為51048105個(gè)個(gè)/ml 傳代密度太低，細(xì)胞容易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá)到傳代密度太低，細(xì)胞容易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá)到增長(zhǎng)前有增長(zhǎng)前有較長(zhǎng)的滯留期較長(zhǎng)的滯留期。w培養(yǎng)液由于培養(yǎng)液由于pH下降而呈現(xiàn)下降而呈現(xiàn)黃色黃色，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。w如果是單層貼壁的細(xì)胞，等長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面，即可如果是單層貼壁的細(xì)胞，等長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面，即可進(jìn)行傳代。進(jìn)行傳代。 細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件w無(wú)菌條件無(wú)菌條件w細(xì)胞生

7、長(zhǎng)條件細(xì)胞生長(zhǎng)條件w細(xì)胞檢測(cè)條件細(xì)胞檢測(cè)條件w細(xì)胞保存條件細(xì)胞保存條件w實(shí)驗(yàn)室安全實(shí)驗(yàn)室安全細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌環(huán)境 w無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。作間三部分組成。 w（使用前）紫外照射（使用前）紫外照射（1小時(shí)）小時(shí)）w每周甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（每周甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）和小時(shí)）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒行消毒 生物安全柜生物安全柜 w使用前開(kāi)啟柜內(nèi)紫外燈照射使用前開(kāi)啟柜內(nèi)紫外燈照射1030分鐘，分鐘，w預(yù)工作預(yù)工作1015分鐘，以除去臭氧分鐘

8、，以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)。和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)。w使用完畢后，要用使用完畢后，要用70%酒精將臺(tái)酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈。面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈。w還要定期用福爾馬林熏蒸。還要定期用福爾馬林熏蒸。 常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒 w玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過(guò)浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個(gè)步驟一般經(jīng)過(guò)浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個(gè)步驟 w新的橡膠制品洗滌方法新的橡膠制品洗滌方法 0.5M NaOH煮沸煮沸15分鐘，流水沖洗，分鐘，流水沖洗，0.5MHCl煮沸煮沸15分鐘，流水沖洗，自來(lái)水煮沸分鐘，流水沖洗，自來(lái)水煮沸2次，蒸餾水煮沸次，蒸餾水煮沸2

9、0分鐘，分鐘，50烤干備用?？靖蓚溆?。 消毒前包裝消毒前包裝w常用的包裝材料常用的包裝材料 牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、鋁箔牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、鋁箔火焰消毒火焰消毒w在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如打開(kāi)或封閉瓶口等，都需以后一切操作，如打開(kāi)或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼進(jìn)行。在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼進(jìn)行。w培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶w滴管、試管、吸管滴管、試管、吸管細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)用品細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)用品 w細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)瓶 w25平方厘米，正方斜頸平方厘米，正方斜頸w25平方厘米，三角斜頸平方厘米，三角斜頸w75平方厘米，正方

10、斜頸平方厘米，正方斜頸w75平方厘米，三角斜頸平方厘米，三角斜頸w150平方厘米，正方斜頸平方厘米，正方斜頸 w細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)板w 6孔，孔，w12孔，孔，w24孔，孔，w48孔孔w96孔孔w細(xì)胞培養(yǎng)皿細(xì)胞培養(yǎng)皿w 35mmw 60mm w100mm w凍存管w1.2ml w2ml，w5mlw離心管離心管w 15mlw 50mlw細(xì)胞刮細(xì)胞刮濾濾 器器大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過(guò)法除菌。酶液等均采用濾過(guò)法除菌。液氮罐何處購(gòu)買細(xì)胞何處購(gòu)買細(xì)胞wATCC 細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞庫(kù)().w美國(guó)菌種保藏中心又稱美國(guó)模式

11、菌種收集中心美國(guó)菌種保藏中心又稱美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營(yíng)的，是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營(yíng)的，非贏利性組織。非贏利性組織。w目前它可以提供以下物品目前它可以提供以下物品 細(xì)胞系細(xì)胞系3000種種 細(xì)菌和噬菌體細(xì)菌和噬菌體 15000種種 動(dòng)植物病毒動(dòng)植物病毒 2500種種 原生動(dòng)物原生動(dòng)物 1200種以及重組物品種以及重組物品 w歐洲動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)歐洲動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)(ECACC)和日本細(xì)胞庫(kù)和日本細(xì)胞庫(kù)(RCB) 國(guó)內(nèi)細(xì)胞庫(kù)中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心聯(lián)系方法：聯(lián)系方法：地址：

12、上海市岳陽(yáng)路地址：上海市岳陽(yáng)路320號(hào)，號(hào)，200031電話：電話 54920405Fax:系人：陳松華，徐惠均聯(lián)系人：陳松華，徐惠均e-mail: whttp:/ 也稱武漢大學(xué)保藏中心，是國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的專利培也稱武漢大學(xué)保藏中心，是國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的專利培養(yǎng)物養(yǎng)物/生物材料菌種保藏機(jī)構(gòu)生物材料菌種保藏機(jī)構(gòu)訂購(gòu)程序訂購(gòu)程序w向中心訂購(gòu)培養(yǎng)物，可查閱向中心訂購(gòu)培養(yǎng)物，可查閱CCTCC培養(yǎng)物目錄，并向培養(yǎng)物目錄，并向CCTCC提出訂購(gòu)培養(yǎng)物的名稱、提出訂購(gòu)培養(yǎng)物的名稱、CCTCC保藏號(hào)等內(nèi)容。保藏號(hào)等內(nèi)容。w聯(lián)系方式可通過(guò)電話、傳真，

13、信函，電子郵件等方式。聯(lián)系方式可通過(guò)電話、傳真，信函，電子郵件等方式。 電話：電話傳真：傳真E-mail:w細(xì)胞系：細(xì)胞系：300500元元/每株每株 w菌種準(zhǔn)備時(shí)間菌種準(zhǔn)備時(shí)間 一般情況一般情況CCTCC收到訂購(gòu)人的匯款后的收到訂購(gòu)人的匯款后的3-4天寄出，每周寄天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。送二次（周一，周五）。細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)w碳水化合物、氨基酸和脂類碳水化合物、氨基酸和脂類三大類三大類w也需要一定量的無(wú)機(jī)鹽、維也需要一定量的無(wú)機(jī)鹽、維生素和微量元素生素和微量元素細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)液 w水水w平衡鹽溶液平衡鹽溶液 wpH調(diào)

14、節(jié)液調(diào)節(jié)液w消化液消化液w抗生素溶液抗生素溶液w培養(yǎng)基培養(yǎng)基 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水水：新鮮配置的三蒸水或去離子水桶裝水：怡寶桶裝水：怡寶細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制平衡鹽溶液平衡鹽溶液w主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成w作用作用 維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度 w常用的緩沖液常用的緩沖液 生理鹽水生理鹽水 PBS Hanks液液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）常用于配制胰酶溶液） pH調(diào)節(jié)液調(diào)節(jié)液(1) 碳酸氫鈉液碳酸氫鈉液 (2) Hepes緩沖液緩沖液 是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中pH值較

15、長(zhǎng)時(shí)值較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑通常使用濃度為通常使用濃度為1015mM 消化液消化液(1) 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開(kāi)來(lái)使細(xì)胞游離分散開(kāi)來(lái) 常用濃度為常用濃度為0.25%或或5%胰蛋白酶。胰蛋白酶。(2) EDTA溶液溶液 作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。 對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，可用對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，可用EDTA和胰酶的混合液和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用濃度為溶液的使用濃度為0.02%，配制時(shí)

16、應(yīng)加堿助溶，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶 (3)膠原酶溶液膠原酶溶液 膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。 抗生素溶液抗生素溶液w通常是通常是青霉素青霉素和和鏈霉素鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱聯(lián)合使用，俗稱“雙抗雙抗溶液溶液”。w青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。大多數(shù)細(xì)菌污染。 培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升培

17、養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。單位。慶大霉素：每毫升慶大霉素：每毫升100單位單位 培養(yǎng)基培養(yǎng)基w分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基w天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基： 血清血清 血漿血漿 組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）組織提取液（如雞胚和牛胚浸液） 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 w根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。工方法模擬合成的。w包括四大類物質(zhì)：無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、包括四大類物質(zhì)：無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物碳水化合物w目前常用培養(yǎng)基：目前常用培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、w

18、另有無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基另有無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基RPMI1640w最初是由最初是由G，E，Moore為培養(yǎng)小鼠白血病細(xì)為培養(yǎng)小鼠白血病細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。胞而設(shè)計(jì)的。w開(kāi)始的配方特別適合于懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)，主要是開(kāi)始的配方特別適合于懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)，主要是針對(duì)淋巴細(xì)胞，后經(jīng)過(guò)改良，從針對(duì)淋巴細(xì)胞，后經(jīng)過(guò)改良，從RPMI1630、RPMI1634、直至、直至RPMI1640。w其組分較為簡(jiǎn)單，適合許多種細(xì)胞生長(zhǎng)，如腫其組分較為簡(jiǎn)單，適合許多種細(xì)胞生長(zhǎng)，如腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。w尤其適合人白細(xì)胞，如尤其適合人白細(xì)胞，如H9、T-15、HL-

19、60、IM-9、Jurkat、 K-562 及及KATOIII等細(xì)胞系等細(xì)胞系的培養(yǎng)。的培養(yǎng)。RPMI1640種類種類wRPMI1640（A） （不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）（不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）wRPMI1640（A）無(wú)酚紅）無(wú)酚紅 （不含谷氨酰胺、高壓滅菌）（不含谷氨酰胺、高壓滅菌）wRPMI1640 （含谷氨酰胺、除菌過(guò)濾滅菌）（含谷氨酰胺、除菌過(guò)濾滅菌）DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)基w 是在是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的w與與MEM比較增加了各種成分用量，同時(shí)又分為高糖型（低比較增加了各種成分用量，同時(shí)又分為高糖型（低于于4500g/L）和低糖型）和低糖型(低于低

20、于1000g/L)。w高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等。著較困難腫瘤細(xì)胞等。 w DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】 DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過(guò)濾滅菌】）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過(guò)濾滅菌】 DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過(guò)濾滅菌】。）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過(guò)濾滅菌】。干粉培養(yǎng)基的配制干粉培養(yǎng)基的配制 w認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)都注明干粉不包含的成分，常見(jiàn)的認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)都注明干粉不包含的成分，常見(jiàn)的有有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮

21、酸鈉、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分等。這些成分有些是必須添加的，如有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。需要決定。w配制是要保證充分溶解，配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。w配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。w 所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。 w配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾，無(wú)菌保存于配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾，無(wú)菌保存于4度。度。 血清的使用血清的使用w血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵血

22、清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵w常用血清常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，胎牛血清是品質(zhì)最高的。清、馬血清等，胎牛血清是品質(zhì)最高的。w優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn) 透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。體、病毒污染。w血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）血清的滅活（消除補(bǔ)體活性） 56 ，30 分鐘。分鐘。w血清的消毒血清的消毒 過(guò)濾除菌。過(guò)濾除菌。牛血清牛血清w胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛w新牛血清取自出生新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛小時(shí)之內(nèi)的新生牛w小牛血清取自出

23、生小牛血清取自出生1030天的小牛天的小牛w使用濃度：使用濃度： 一般為一般為520，最常用是，最常用是10 何謂何謂FBS、FCS、 CS、HS ?wFBS (fetal bovine serum) 和和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清，兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼，乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用。請(qǐng)不要再使用。wCS (calf serum) 則是指小牛血清則是指小牛血清wHS (horse serum) 則是指馬血清則是指馬血清血清解凍步驟血清解凍步驟w逐步解凍法逐步解凍法 20 或或70 至至4 冰箱溶解

24、一天，至冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無(wú)菌離無(wú)菌離心管可分裝心管可分裝4045 ml。w勿直接勿直接由由20 至至37 解凍，因溫度改變太解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。 無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽wCaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4w對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。及溶液的酸堿度都是必須的。 氨基酸氨基酸 w纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸

25、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型型)w細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成w谷氨酰胺谷氨酰胺具有特殊的作用，補(bǔ)加一定量的具有特殊的作用，補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺谷氨酰胺 。wL-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性于一些細(xì)胞具有毒性 。 休息一會(huì)兒吧！休息一會(huì)兒吧！w伸伸腿，彎彎腰！體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型 貼附型貼附型大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：w成纖維細(xì)胞

26、成纖維細(xì)胞w上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞w游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型w多型細(xì)胞型多型細(xì)胞型1、成纖維細(xì)胞型、成纖維細(xì)胞型名稱：名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來(lái)源：來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮血管內(nèi)皮形態(tài)：形態(tài)：胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2 23 3個(gè)長(zhǎng)短不等個(gè)長(zhǎng)短不等 的突起，中有卵圓形核的突起，中有卵圓形核生長(zhǎng)特點(diǎn)：生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀排列成放射狀，漩渦狀 細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開(kāi)

27、而細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而單獨(dú)行動(dòng)，單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維游離的單獨(dú)的成纖維 樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起細(xì)胞突起成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞 HUVECs人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞1.細(xì)胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：4d；原代培養(yǎng)；原代培養(yǎng)；3.放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DMEM+15胎牛胎牛 血清；血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈梭細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈梭 形，扁平形或多角形，貼壁生長(zhǎng)。形，扁平形或多角形，貼壁生長(zhǎng)。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1.細(xì)胞種

28、類：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代；細(xì)胞種類：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代；2.培養(yǎng)天數(shù)：培養(yǎng)天數(shù)：7天；天；3.放大倍數(shù)：放大倍數(shù)：200倍，倒置顯微鏡；倍，倒置顯微鏡；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DF12+10FBS；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：使用細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：使用percoll密度密度梯度離心法分離人骨髓細(xì)胞。首次換液梯度離心法分離人骨髓細(xì)胞。首次換液48h，這是這是7天后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增情況。天后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增情況。 2、上皮型細(xì)胞、上皮型細(xì)胞名稱：名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同來(lái)源：來(lái)源：來(lái)源于外胚層來(lái)源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞,

29、如：如： 皮膚及其衍生物皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤上皮性腫瘤形態(tài)：形態(tài)：類似體內(nèi)的類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形不規(guī)則多角形，中有圓，中有圓形核形核 生長(zhǎng)特點(diǎn)：生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連易相連成片，成片，相靠相靠緊密相連緊密相連成薄層成薄層鋪石狀鋪石狀生長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)呈時(shí)呈膜狀膜狀移動(dòng)，移動(dòng)，很少很少脫離細(xì)胞群而脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)單個(gè)活動(dòng)上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞 SKOv3 （卵巢癌細(xì)胞）1.細(xì)胞種類：SKOv3（卵巢癌細(xì)胞）2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后3d；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：DMEM+5%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞

30、貼壁生 長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度較快。 CCL-1491.細(xì)胞種類：大鼠肺泡上皮細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：1d（種在48孔板中）；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：F12K+10%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈梭形，透亮貼壁生長(zhǎng)，34天傳代一次，Giemsa染色。3 3、游走細(xì)胞型：、游走細(xì)胞型：呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。和其他細(xì)胞相區(qū)別。 CNE11.細(xì)胞種類：高分化鼻咽癌細(xì)胞系；細(xì)胞種類：高分化鼻咽

31、癌細(xì)胞系；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：3d；3.放大倍速：相差放大倍速：相差100；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：PMI1640+10%CS；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：貼壁細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：貼壁細(xì)胞， 梭型成團(tuán)生長(zhǎng)。梭型成團(tuán)生長(zhǎng)。 4、多型細(xì)胞型、多型細(xì)胞型w有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。 SD大鼠神經(jīng)元大鼠神經(jīng)元 原代原代1.細(xì)胞種類：腦皮質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞種類：腦皮質(zhì)細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：4-5天；天；3.放大倍速：電鏡放大倍速：電鏡20000；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DMEM+

32、10%小牛血清小牛血清+10%馬馬 血清；血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：貼壁細(xì)胞，有多量軸細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：貼壁細(xì)胞，有多量軸 突和樹(shù)突。突和樹(shù)突。懸浮型懸浮型概念：概念：培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)來(lái)源：來(lái)源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點(diǎn)：特點(diǎn)：在在懸浮中生長(zhǎng)良好懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞細(xì)胞圓形圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便提供數(shù)量大，傳代方便( (不需消化不需消化) )，易于收獲，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：觀察不方便，

33、很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)( (尤以正常細(xì)尤以正常細(xì)胞胞) ) HL-60 分化細(xì)胞分化細(xì)胞Giemsa染色染色1. 細(xì)胞種類：細(xì)胞種類：HL-60； 2. 培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：ATRA 1微摩爾作用微摩爾作用5天；天；3. 放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4. 培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：1640+8胎牛血清；胎牛血清；5. 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞，分化的細(xì)胞核漿比例減小，核仁減少或，分化的細(xì)胞核漿比例減小，核仁減少或 消失，胞核呈桿狀或分葉狀。消失，胞核呈桿狀或分葉狀。 KU8121.細(xì)胞種類：人嗜堿細(xì)胞性白血病

34、細(xì)胞系；細(xì)胞種類：人嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：5d；3.放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%新生牛血清；新生牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈圓形，懸浮生長(zhǎng)。細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈圓形，懸浮生長(zhǎng)。 HeLa細(xì)胞細(xì)胞1.細(xì)胞種類：人細(xì)胞種類：人HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng)；細(xì)胞傳代培養(yǎng)；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：7d；3.放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X200；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清；小牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈多角形，貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：

35、細(xì)胞呈多角形，貼壁生長(zhǎng)。 K562細(xì)胞細(xì)胞1.細(xì)胞種類：細(xì)胞種類：K562（人慢性紅白血病細(xì)胞株）；（人慢性紅白血病細(xì)胞株）；2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后2天；天；3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡放大倍數(shù)：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%胎牛血清，胎牛血清，4mM Glutamine；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)介：懸浮生長(zhǎng)，少數(shù)貼壁，喜愛(ài)成團(tuán)懸浮。細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)介：懸浮生長(zhǎng)，少數(shù)貼壁，喜愛(ài)成團(tuán)懸浮。 每代貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程每代貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程w游離期游離期w貼壁期貼壁期w潛伏期潛伏期w對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期w停止期（平臺(tái)期）停止期（平臺(tái)期）w游離期游離期

36、 懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。w吸附期吸附期 貼附底物，一般貼附底物，一般24小時(shí)內(nèi)貼壁。小時(shí)內(nèi)貼壁。w潛伏期潛伏期 此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖。此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖。 細(xì)胞株潛伏期一般為細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。小時(shí)。w對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)研究。行實(shí)驗(yàn)研究。w停止期（平臺(tái)期）停止期（平臺(tái)期） 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的

37、恃點(diǎn)，傳代方法有根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3 3種：種：1 1懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（離心法傳代：離心（10001000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分分）去上清，沉淀物加新）去上清，沉淀物加新 培養(yǎng)液后再混勻傳代。培養(yǎng)液后再混勻傳代。 2 2半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（HelaHela細(xì)胞）細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用 直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3 3貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。采用酶消化法傳代。 常用的消化液有常用

38、的消化液有0.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。細(xì)胞傳代方法細(xì)胞傳代方法首次傳代注意事項(xiàng)首次傳代注意事項(xiàng)w細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不能急于傳代細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不能急于傳代 w原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間 w吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷 w首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些 w首次傳代培養(yǎng)的首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些應(yīng)偏低些 w小牛血清濃度可加大至小牛血清濃度可加大至15%20%左右左右 細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)w計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示w細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同w血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞

39、wCoulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟w1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。w2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。片和計(jì)數(shù)板之間。w3、靜置、靜置3分鐘。分鐘。w4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)。、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml4大格細(xì)胞總數(shù)大格細(xì)胞總數(shù)/ 4104注意注意：壓線細(xì)胞只計(jì)：壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)左側(cè)和和上方上方的。的。 鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)

40、以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定w細(xì)胞活力：細(xì)胞活力： 總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比w由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。w復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。蘇的效果。測(cè)定方法測(cè)定方法w臺(tái)盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。w流式細(xì)胞儀 細(xì)胞活性指標(biāo)通常包括細(xì)胞膜對(duì)

41、核酸染料的通透性，代謝活性，膜電位等。 3四唑鹽（MTT）比色法w四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)；wMTT比色法的原理： 活細(xì)胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臢 （formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。 二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值；細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存和復(fù)蘇w細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：細(xì)胞深低溫保存的基本原理是： 在在70以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故