廣大-土壤中分離芽胞桿菌 - 副本

1、綜合性實(shí)驗(yàn)方案土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選及淀粉酶活力的測(cè)定 一、摘要 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從土壤中分離出能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌并對(duì)其進(jìn)行鑒定、保存，試驗(yàn)中涉及菌株的分離純化、菌株的形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定，根據(jù)伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)鑒定其中的種屬。 實(shí)驗(yàn)中通過(guò)80水浴20min預(yù)處理，殺死無(wú)芽孢菌體，篩選出芽孢桿菌；再用稀釋涂布平板法對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行初步篩選；又通過(guò)分區(qū)劃線對(duì)初篩選菌株進(jìn)一步分離純化；然后再用選擇性淀粉培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到純培養(yǎng)的產(chǎn)淀粉酶，以及產(chǎn)芽孢的桿菌，最后通過(guò)對(duì)產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌做相關(guān)的生理生化實(shí)驗(yàn)，將篩選出來(lái)的菌株進(jìn)行鑒別，鑒別到了地衣芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌。 關(guān)鍵詞：芽孢桿菌 淀粉酶 酶活

2、測(cè)定二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、 了解微生物分離純化的原理及微生物分離純化常用的方法和技術(shù)；2、 掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理及方法；3、 掌握微生物的搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測(cè)定的原理及方法；4、 培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案流程、綜合分析解決問(wèn)題及判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力；5、 對(duì)所學(xué)習(xí)過(guò)的微生物實(shí)驗(yàn)方法井陘綜合技能訓(xùn)練；6、 從不同環(huán)境土壤樣品中篩選出能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，并分析比較各種淀粉酶菌株的產(chǎn)淀粉酶活力及總結(jié)各芽孢桿菌在土壤中的分布情況；三、實(shí)驗(yàn)原理 土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此，土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從

3、中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由有一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體。因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板法或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單的菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定

4、除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。 芽孢桿菌是土壤細(xì)菌中最具活力的部分之一，也是土壤細(xì)菌的主要種群之一。 芽孢桿菌屬實(shí)一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子的桿狀細(xì)菌。多數(shù)為腐生菌，主要分布于土壤、動(dòng)植物體表及水體中。由于芽孢桿菌屬的細(xì)菌可以產(chǎn)生多種有用代謝產(chǎn)物，芽孢又是菌體度過(guò)不良環(huán)境的休眠體，因此，在工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)商有較高的應(yīng)用價(jià)值。4、 實(shí)驗(yàn)材料與方法1、 實(shí)驗(yàn)材料1.1土樣的采集選取廣大理南前面、廣大生化樓前小河附近兩處的土壤，五點(diǎn)法采集，邊長(zhǎng)15cm。鏟去表層土，去10cm深土壤，每一個(gè)土樣

5、約200g左右（每個(gè)點(diǎn)40g)。將土樣放入無(wú)菌的紙袋中，并記錄采集的時(shí)間、地點(diǎn)、植被類型，4冰箱中保存?zhèn)溆?。分別記做A土樣、B土樣。1.2培養(yǎng)基淀粉篩選培養(yǎng)基淀粉20 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，瓊脂10 g，自來(lái)水1000 ml，pH自然。斜面種子培養(yǎng)基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，瓊脂1015 g，自來(lái)水1000 ml，pH 7.27.4。蛋白胨液體培養(yǎng)基（做吲哚實(shí)驗(yàn)用）蛋白胨10 g，NaCl 5g，自來(lái)水1000 ml，pH 7.27.4，121滅菌20 min。葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（VP和MR試驗(yàn)用）蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5g，自來(lái)水

6、1000 ml，pH 7.27.4，121滅菌20 min。糖發(fā)酵培養(yǎng)基（做糖酵解試驗(yàn)用：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇）蛋白胨2 g，NaCl 5g，K2HPO4 0.2g，1%溴麝香草酚藍(lán)水溶液3ml，待試糖10g（一般糖或醇按1%量加入，而乳糖，半乳糖按1.5%的量加入），自來(lái)水1000 ml，pH 7.27.4，121滅菌20 min。絡(luò)氨酸平板（做絡(luò)氨酸水解試驗(yàn)用）A：L絡(luò)氨酸0.5g，懸浮于10ml蒸餾水中，110，20min滅菌；B：稱取3.3g營(yíng)養(yǎng)瓊脂，蒸餾水100ml，121，20min滅菌；然后將A液倒入融化至溫?zé)岬?00ml無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，混合，即成絡(luò)氨酸水解平板。絡(luò)素

7、平板（做絡(luò)素水解試驗(yàn)用）A：取5g脫脂奶粉加入50ml蒸餾水中，110，15min滅菌B：另稱1.5g瓊脂溶于50ml蒸餾水中，121，20min滅菌。待冷至4550時(shí)，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過(guò)夜，使表面水分干燥；硝酸鹽培養(yǎng)基硝酸鉀0.2g、蛋白5g、蒸餾水1000mL、pH7.4、硝酸鹽還原試劑甲液：將對(duì)氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L，乙酸溶液100mL中。乙液：將甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。制法（溶解，校正pH，分裝試管，每管約5mL，121高壓滅菌15min。）西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)液（做檸檬酸鹽利用試驗(yàn)用）檸檬酸鈉2g，NaCl

8、 5g ,MgSO4.H2O 0.2g，K2HpO4.3H2O 1g，（NH4)2HPO4 1g，1%溴麝香草酚藍(lán)水溶液10ml，瓊脂15-20g，自來(lái)水1000ml，pH7.0，121滅菌20 min。淀粉牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基可溶性淀粉2g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂1520g，蒸餾水1000 ml，pH 7.27.4。(2%、5%、7%、10%）高鹽培養(yǎng)基（做耐鹽試驗(yàn)用）牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl（2g，5g，7g，10g），瓊脂1015 g，蒸餾水1000 ml，pH 7.27.4。明膠培養(yǎng)基（做明膠液化實(shí)驗(yàn)用）牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，明膠12g，

9、蒸餾水1000 ml，pH7.0半固體培養(yǎng)基（做運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)用）瓊脂含量0.5%，其他組分比例按牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。pH5.7肉湯蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，pH5.70.001%溶菌酶試驗(yàn)蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，pH7.2-7.4卵黃試驗(yàn)組分一：33g營(yíng)養(yǎng)瓊脂，1%葡萄糖，蒸餾水1000ml組分二：5ml無(wú)菌生理鹽水，5ml卵黃（移液槍無(wú)菌注射器吸取），混勻向50保溫的組分一中加入組分二5ml，混勻，倒平板，4，過(guò)夜備用1.3試劑耐鹽性試驗(yàn)：NaCL粉末糖酵解試驗(yàn)：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇。革蘭氏染色：草酸銨結(jié)晶

10、紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇，0.5%沙黃染色液；芽孢染色：5%孔雀綠染色液，0.5%石碳酸復(fù)紅。單染色：草酸銨結(jié)晶紫或石炭酸復(fù)紅。VP試驗(yàn)（MR試驗(yàn)）40%NaoH溶液，a-萘酚吲哚試驗(yàn)：乙醚、吲哚試劑碘原液：碘11g，碘化鉀22g，加水定容至500ml硝酸鹽試驗(yàn)：甲液（對(duì)氨基苯硫酸0.8g+5mol/L醋酸100ml; 乙液（a-萘胺0.5g + 5mol/醋酸100ml）;酪素水解：脫脂奶粉（牛奶）；酪氨酸水解：L酪氨酸 溶菌酶抗性實(shí)驗(yàn)：溶菌酶卵黃反應(yīng)：新鮮雞蛋硝酸鹽試驗(yàn)：硝酸鹽明膠液化試驗(yàn)：明膠檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：西蒙斯氏檸檬酸鹽淀粉酶活力測(cè)定：1% 3,5-二硝基水楊酸試劑1.3.

11、2 儀器； 無(wú)菌培養(yǎng)皿，接種環(huán)，土樣，三角瓶，燒杯，試管，酒精燈，無(wú)菌吸管，載玻片，吸水紙，涂布器，顯微鏡，移液管，移液槍等。恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，恒溫水浴箱，磁力攪拌器等。 2、試驗(yàn)方法 2.1 土壤樣品懸液制備 2.1.1 土壤懸液制備各稱取22.2g 土壤樣品于裝有200ml 無(wú)菌水的400ml 錐形瓶中，加入玻璃珠與土壤懸液一起振蕩，制成土壤懸液。置于100沸水10 min,以殺死非芽孢桿菌。靜置5min.2.1.2 土壤懸液稀釋吸取上清液1 ml 加到含有9 ml 無(wú)菌水的試管中，配成102 g/ml 的土壤懸液，并進(jìn)一步稀釋至103 g/ml、104 g

12、/ml , 共三個(gè)濃度梯度。2.2 分離純化2.2.1 芽孢桿菌屬的純培養(yǎng)涂布分離：分別吸取不同稀釋度的土壤懸液0.1-1 ml 于牛肉膏蛋白胨平板上，用無(wú)菌玻璃涂棒涂布均勻。每個(gè)稀釋度2 個(gè)重復(fù)，37倒置培養(yǎng)24h。劃線接種：每個(gè)土樣挑5個(gè)形態(tài)特征不同的單菌落。（一個(gè)平板一個(gè)細(xì)菌，并且分好區(qū)），挑取一個(gè)菌株，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約60角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置37倒置培養(yǎng)12h，再繼續(xù)分區(qū)劃線2

13、-3次，以獲取較純的菌種。（判斷純不純的方法是：通過(guò)革蘭氏染色觀察，方法在下面；還要通過(guò)芽孢染色確定純菌種為芽孢桿菌，兩個(gè)試驗(yàn)都通過(guò)后，在進(jìn)行菌種的保存，方法在下面）2.2.2經(jīng)單染色鏡檢直至得到純菌種挑取上述劃線所培養(yǎng)的部分菌種出來(lái)進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)出現(xiàn)形態(tài)、大小、顏色一致且為桿狀的菌體，則將其對(duì)應(yīng)的菌種劃線接種到新的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，標(biāo)記，37倒置培養(yǎng)24h，否則繼續(xù)進(jìn)行劃線分離，培養(yǎng)后再經(jīng)革蘭氏染色鏡檢直至得到純種桿菌。染色步驟涂片、干燥、固定；染色：在涂有菌種的載玻片上滴加草酸銨結(jié)晶紫或石碳酸復(fù)紅蓋住有菌的部分，染色，1-2min，傾去染液，用水沖洗直至無(wú)染色液為止。鏡檢：

14、用油鏡觀察；單菌落：菌落的形狀、顏色、質(zhì)地、透明度一致、菌體形態(tài)為直桿狀，長(zhǎng)度均一、寬度一致，并能產(chǎn)生芽孢時(shí)，確認(rèn)為芽孢桿菌屬的純培養(yǎng)物。2.2.3芽孢染色分離芽孢桿菌（24h菌種）挑取已純化的菌種，進(jìn)行芽孢染色，確定菌株為芽孢桿菌，確定后。將純化得到的單菌落分為兩部分，其中一部分接種到培養(yǎng)基內(nèi)，用以保存菌種，另一部分用來(lái)做其他試驗(yàn)。染色步驟涂布、干燥及固定；初染：于涂片上加入2-3滴5%孔雀綠水溶液，加熱，用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，邊加熱邊滴加染色液，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時(shí)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，約4min；脫色：傾去染液，待玻片冷卻后，水洗至孔雀綠不再褪色為止；復(fù)染：滴加沙黃染色液，染2-3

15、min，水洗；鏡檢：用油鏡觀察染色結(jié)果。芽孢呈綠色，菌體呈紅色。2.2.4 產(chǎn)淀粉霉菌株的篩選淀粉水解實(shí)驗(yàn)挑取顏色、質(zhì)地不同的單菌落，劃線接種于可溶性淀粉培養(yǎng)基中，每種菌株做2個(gè)平板，將接種完成得平板置于37恒溫箱中倒置培養(yǎng)24h。取一個(gè)平板，馬上加碘液，立即觀察記錄是否有透明圈出現(xiàn)。將有透明圈的菌株做好標(biāo)記。2.2.5斜面保存菌種取各種無(wú)菌斜面試管數(shù)支，將有透明圈的菌株（用平行的培養(yǎng)基里面的菌種）接種到斜面，貼上標(biāo)簽，其距試管口2-3cm處。每種要菌接3管，加塞、包扎好到37倒置培養(yǎng)24h。2.3 初步鑒定2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將所得的斜面菌種接種到新的平板上培養(yǎng)以觀察篩選出產(chǎn)淀粉酶芽孢桿

16、菌菌落的大小、顏色、干濕情況、形態(tài)、高度、透明程度、邊緣、是否易被挑起、氣味等。然后進(jìn)行一系列的鏡檢革蘭氏染色、芽孢染色（具體步驟同上）觀察是否符合芽孢桿菌的指標(biāo)。2.3.2生理生化鑒定（所有生化試驗(yàn)之前都要活化菌種：從冰箱中取出菌體，重新接種到斜面上，培養(yǎng)12-20h，使之達(dá)到對(duì)數(shù)期）革蘭氏染色步驟涂布：從各純培養(yǎng)的平板中挑取菌種于載玻片上，滴加無(wú)菌生理鹽水；干燥：將涂片置火焰高處微熱烘干或自然干燥；固定：涂面朝上，通過(guò)微火2-3次。初染：在涂有菌種的載玻片上滴加適量的草酸銨結(jié)晶紫染色液，染色1min，傾去染液，用水沖洗至無(wú)染色液顏色為止；媒染：滴加石碳酸復(fù)紅，染1-2min，水洗；脫色：滴

17、加95%乙醇，將玻片搖晃幾下傾去乙醇，重復(fù)2-3次，立即水洗；復(fù)染：滴加石碳酸復(fù)紅，染2-3min，水洗；鏡檢：用油鏡觀察染色結(jié)果溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響：將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化倒平板（培養(yǎng)基厚度為15-20cm）,使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將菌株十字接種到平板，分別在5C、15C、25C、30C、35C、40C、45C、50C、55C、60C、65C條件下培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌是否生長(zhǎng)。糖類發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）-直接觀察記錄取斜面培養(yǎng)菌種接種于37C溫箱中培養(yǎng)24h；觀察培養(yǎng)基是否變色，杜氏小管是否有氣泡，以證實(shí)菌株是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣。VP試驗(yàn)取葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，接種37C培養(yǎng)

18、兩天；取出以上試管，每個(gè)管分別加入40%NaoH溶液10-20滴（5-10d 40%KOH)，并加入等量5%萘酚，震蕩試管，以使空氣中的氧融入，置于37C恒溫箱中保溫15-30min后，若培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色，記為陽(yáng)性（+）反應(yīng)，若不呈現(xiàn)紅色則記為陰性（-）。MR試驗(yàn)取葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，接種37C培養(yǎng)兩天；取出以上試管，每管分別加入甲基紅2滴（向另一半葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液內(nèi)加入甲基紅2d)，震蕩，若培養(yǎng)液呈紅色，記為陽(yáng)性（+）反應(yīng)，若不呈紅色，記為陰性（-）。吲哚試驗(yàn)取蛋白胨水培養(yǎng)基，接種，37C培養(yǎng)兩天；取出試管，在培養(yǎng)基中加入乙醚1-2ml，經(jīng)充分震蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培

19、養(yǎng)液上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入5-10滴吲哚試劑，如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性（+），否則為陰性（-）。檸檬酸鹽利用試驗(yàn)取裝有西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面的試管，分別將少量菌苔接種于各支相應(yīng)的管中，然后置于37C恒溫箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基變藍(lán)色，則表明該菌能利用檸檬酸鹽作為碳源而生長(zhǎng)，即為陽(yáng)性（+），若培養(yǎng)基無(wú)變色，則為陰性（-）。耐鹽性試驗(yàn)將分離獲得的細(xì)菌分別接種在NaCl濃度為2%，5%，7%，10%，的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于37C下培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，并做記錄。硝酸鹽還原試驗(yàn)被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，置于35C中培養(yǎng)1-4天，將甲、乙液等量混合后（約0.1ml）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果，若出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。明膠液化試驗(yàn)穿刺接種，深度至明膠層2/3處，于37C恒溫箱培養(yǎng)24h；取出后靜置于冰箱中，待其凝固后，再觀察其是否被細(xì)菌液化，如果被液化，則為陽(yáng)性，能產(chǎn)生蛋白酶。運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)使用半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管，將接種針從直立柱培養(yǎng)基中央自上而下直刺到離管底1-1.5cm處，沿原穿刺線拔出接種針。置于37C溫箱中培養(yǎng)24h；觀察是否產(chǎn)生樹(shù)根狀生長(zhǎng)，若有，則菌株有鞭毛，