四種南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)生防菌菌株的篩選研究 第三稿

1、四種南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)生防菌菌株篩選研究四種南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)生防菌菌株篩選研究摘 要線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治是近幾年植保領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，本文從采自洛陽(yáng)市李樓蔬菜基地的根際土壤樣本中分離、篩選出了4株對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)具有明顯拮抗效果的生防細(xì)菌菌株，并對(duì)這4株生防菌進(jìn)行了一系列的生理生化指標(biāo)檢測(cè)。初步檢測(cè)結(jié)果如下：假單胞菌屬（18-4）、巨大芽胞桿菌屬（15-5）、蠟樣芽胞桿菌屬（20-7）、枯草芽孢桿菌屬（2-1）。該結(jié)果為下一步開(kāi)發(fā)防治南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的生物制劑提供了理論依據(jù)，利于減少傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥過(guò)度使用而導(dǎo)致的“3R”問(wèn)題。關(guān)鍵詞：根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)；生物防治；根際生防細(xì)菌；篩選； 1 引言通過(guò)有關(guān)植物線(xiàn)蟲(chóng)病害知識(shí)的問(wèn)卷調(diào)查發(fā)

2、現(xiàn)，現(xiàn)在農(nóng)戶(hù)中對(duì)于植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)所導(dǎo)致的病害中了解程度不夠，對(duì)于線(xiàn)蟲(chóng)病的危害沒(méi)有一個(gè)清晰的認(rèn)識(shí)，而相反植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)已經(jīng)是導(dǎo)致植物病害的第二大殺手，不僅能引起植物線(xiàn)蟲(chóng)病，同時(shí)他也能為植物病原細(xì)菌和真菌提供侵染途徑，也是很多植物病毒的傳播介體。傳統(tǒng)的防治線(xiàn)蟲(chóng)病害的方法一般都是采用傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥，化學(xué)方法防治植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)具有防治好，見(jiàn)效快的特點(diǎn)，但是不可避免的污染了自然環(huán)境，因此生物防治越來(lái)越引起廣泛的關(guān)注。利用對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)具有明顯拮抗效果的生防細(xì)菌對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行防治是當(dāng)今新的研究熱點(diǎn)。種類(lèi)繁多的細(xì)菌從寄主植物、線(xiàn)蟲(chóng)體、線(xiàn)蟲(chóng)的卵、土壤中上被分離，不同的作用方式被報(bào)道。自然界中存在有許多對(duì)植物有益的

3、細(xì)菌群落，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，充分利用這些細(xì)菌的生物學(xué)潛力來(lái)控制植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的種群數(shù)量將有助于減少化肥和農(nóng)藥投入、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、減輕對(duì)環(huán)境的污染，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)高效的發(fā)展。本研究首先從蔬菜的根際土壤中分離細(xì)菌，通過(guò)室內(nèi)離體實(shí)驗(yàn)的方法驗(yàn)證其防效，同時(shí)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)有拮抗作用的細(xì)菌進(jìn)一步鑒定。本次研究的結(jié)果能在一定程度上為開(kāi)發(fā)新型防治線(xiàn)蟲(chóng)的生物制劑提供理論依據(jù)。2 材料與方法2.1 材料2.1.1 土壤樣本與供試線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)源及處理土壤樣本采自洛陽(yáng)市李樓蔬菜基地的蔬菜大棚中，樣本土壤均為蔬菜大棚的根際土壤。在蔬菜收獲后，采用十點(diǎn)取樣法從515 cm的土層中采集作物根際土壤，共采集30份土樣，土樣自然風(fēng)干后過(guò)200

4、目篩，然后封裝于密封袋中并編號(hào)，置于4 冰箱保存?zhèn)溆?。從樣本土壤中分離得到細(xì)菌菌株50種，其中對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)具有拮抗效果的菌株有4種，編號(hào)分別為2-1、15-5、18-4、20-7。將其接種于LB固體培養(yǎng)基上，置于4冰箱冷藏室保存?zhèn)溆?。供試線(xiàn)蟲(chóng)為南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)，保存于本實(shí)驗(yàn)室中。2.1.2 供試培養(yǎng)基培養(yǎng)基具體配方如下表（表1）所示：表1 供試培養(yǎng)基種類(lèi)及成分培養(yǎng)基名稱(chēng)成 分LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g、酵母膏 5g、NaCl 5 g、蒸餾水1000 mLLB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g、蒸餾水1000 mL、酵母提取物5 g、NaCl 5 g、瓊脂粉18 g休和利夫森二氏培養(yǎng)基蛋白胨2 g、N

5、aCl 5 g、K2HPO4 0.2 g、葡萄糖 10 g、瓊脂20 g、溴百里酚藍(lán)1% 水溶液3 mL、蒸餾水1000 mL葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，K2HPO4 5.0 g，蒸餾水1000 mL淀粉培養(yǎng)基在 LB 固體培養(yǎng)基中加入2 g 可溶性淀粉檸檬酸鹽培養(yǎng)基NH4H2PO4 1 g，K2HPO4 1 g，NaCl 5 g，MgSO4 0.2 g，檸檬酸鈉2 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL。2.2 試驗(yàn)方法2.2.1 根際細(xì)菌的分離根際土壤細(xì)菌的分離一般采用稀釋涂平板法，具體實(shí)驗(yàn)方法步驟如下：（1）稀釋液的制備：稱(chēng)取土樣5 g，并將土壤磨成粉末狀，

6、放入50 mL去離子水中，搖床上振蕩30 min，靜置使澄清，用無(wú)菌槍頭吸取上清液100 L并加入900 L無(wú)菌水中，用無(wú)菌水稀釋為10-1 10-2 10-3 10-410-5 五個(gè)濃度梯度并保存。（2）培養(yǎng)：吸取各濃度稀釋液200uL涂布于LB固體培養(yǎng)基制成平板，拿封口膜封口后倒置于恒溫箱內(nèi)，37培養(yǎng)24h。（3）挑菌落：挑取單細(xì)菌菌落于新的LB培養(yǎng)基中，37恒溫培養(yǎng)24h。（4）菌株的純化：盡量挑取形態(tài)不同的單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，37、200r/min搖床振蕩培養(yǎng)，然后用平板劃線(xiàn)分離法進(jìn)行純化，直到獲得純培養(yǎng)。2.2.2 寄生線(xiàn)蟲(chóng)拮抗細(xì)菌的篩選取純化的細(xì)菌接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的試

7、管中，37 、200r/min搖床中培養(yǎng)24h，然后于無(wú)菌超凈工作臺(tái)上用移液槍取600 L培養(yǎng)液于Landy培養(yǎng)基（加100 L KH2PO4、1000 L 40%葡萄糖）中，37 搖床中震蕩培養(yǎng)48 h，取出后靜置，取上清液于離心管中，10000 r離心10 min，用移液槍取上清液于凹面皿、備用10。挑取2040條線(xiàn)蟲(chóng)于凹面皿上清液中，置于26 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，處理12 h、24 h和48 h后分別觀察和計(jì)數(shù)。由于供試線(xiàn)蟲(chóng)中存在假死現(xiàn)象，我們必須在解剖鏡下用自制挑針刺激線(xiàn)蟲(chóng)，如果線(xiàn)蟲(chóng)個(gè)體僵直不動(dòng)，則可以記做死亡，若呈彎曲狀則為假死狀態(tài)。生測(cè)結(jié)果計(jì)算參照陳立杰等人的方法11。線(xiàn)蟲(chóng)死亡率 (%)

8、 = 死亡線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)供試線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)100%2.2.3 細(xì)菌各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的鑒定共選取甲基紅（VP）、乙酰甲基甲醇（VP）、吲哚的產(chǎn)生（細(xì)菌對(duì)色氨酸的利用）、淀粉水解、葡萄糖的氧化發(fā)酵、產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽的利用這七項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，參照微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)中提到的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行該七項(xiàng)指標(biāo)的鑒定試驗(yàn)12。3 結(jié)果分析3.1 土壤細(xì)菌的分離和純化采用稀釋平板法對(duì)30份土壤進(jìn)行細(xì)菌的分離和純化，純化細(xì)菌劃線(xiàn)培養(yǎng)保存。由下圖（圖1）顯微鏡觀察可以看出所挑選出的4個(gè)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的拮抗細(xì)菌的單菌落形態(tài)各不相同，顏色也都不一致，每一種細(xì)菌都具有各自獨(dú)特的形態(tài)特征：2-1細(xì)菌單菌落呈微橢圓形，菌落整體顏色較為一致，為

9、淺黃色，邊緣整齊，表面無(wú)褶皺，菌落較為濕潤(rùn)，稍渾濁，呈半透明狀；15-5細(xì)菌單菌落呈圓形，菌落整體顏色一致，為從中心到邊緣皆為灰黑色，邊緣有突起，表面無(wú)褶皺，菌落較為濕潤(rùn)，不透明；18-4細(xì)菌單菌落呈圓形，菌落中心為灰黑色或黑色，由中心向邊緣顏色逐漸變淺，邊緣呈淺黃色，菌落邊緣呈不規(guī)則形狀，有突起，表面有褶皺，菌落中心不透明，邊緣為半透明狀，菌落中心較邊緣部分略厚；20-7細(xì)菌菌落不規(guī)則，菌株呈發(fā)散性生長(zhǎng)，無(wú)明顯的菌落中心，菌落淺黃色。菌落邊緣向四周發(fā)散生長(zhǎng)，菌落透明。 圖1主要拮抗細(xì)菌單菌落3.2 拮抗細(xì)菌的篩選將分離得到的50個(gè)菌株分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)寄生線(xiàn)蟲(chóng)離體抗性篩選： 用37 200 r

10、/min恒溫?fù)u床條件下培養(yǎng)48h得到細(xì)菌發(fā)酵上清液，將線(xiàn)蟲(chóng)置于該發(fā)酵上清液中放在26恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h、24 h、48 h后分別觀察結(jié)果，結(jié)果表明，不同細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的抑制效果不同，其中2-1、15-5、18-4、20-7這4個(gè)菌株的發(fā)酵液對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的抑制效果最為明顯，四種細(xì)菌在48h內(nèi)作用效果如下表（表2）：表2 拮抗細(xì)菌菌株上清液對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的活性處理線(xiàn)蟲(chóng)死亡率Nematode mortality(）Treatment12 h24 h48 h2-194.440.94100.000100.00015-580.561.1396.442.36100.00018-460.781.3595.

11、002.15100.00020-750.781.4591.661.95100.000CK0.0000.0000.000注：（1）CK：無(wú)菌水對(duì)照；（2）LANDY培養(yǎng)基上重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次4種細(xì)菌的發(fā)酵上清液在48h內(nèi)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的致死率均達(dá)到了100%。編號(hào)15-5、18-4、20-7在12 h 的時(shí)候相對(duì)防治效果分別為：80.56%、60.78%、50.78%，而編號(hào)為2-1的菌株的上清發(fā)酵液在12 h 內(nèi)對(duì)植物南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的致死率高達(dá)94.44%。得到的4株對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)具有拮抗作用的細(xì)菌中編號(hào)為2-1的細(xì)菌拮抗效果最為明顯。防治效果同時(shí)表明這4個(gè)拮抗細(xì)菌菌株在接種后024h內(nèi)對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的防治效

12、果呈上升趨勢(shì)，由此表明這些拮抗細(xì)菌菌株對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的防控具有較長(zhǎng)的持效期。3.3 主要拮抗細(xì)菌革蘭氏染色革蘭氏染色法：對(duì)各主要拮抗細(xì)菌樣品的染色玻片在顯微鏡的油鏡下觀察結(jié)果如圖（圖2）。圖2拮抗細(xì)菌革蘭氏染色后油鏡觀察圖表3 拮抗細(xì)菌革蘭氏染色編號(hào)革蘭氏染色顏色鑒別結(jié)果（+/-）15-5紫色+2-1紫色+18-4紅色-20-7紫色+注：“”代表陽(yáng)性；“”代表陰性根據(jù)表2的結(jié)果說(shuō)明：植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)拮抗細(xì)菌既有革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，又有革蘭氏陰性細(xì)菌,其中15-5、20-7、2-1為革蘭氏陽(yáng)性， 18-4為革蘭氏陰性。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌占75%，革蘭氏陰性細(xì)菌占25%。初步判斷自然界中對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)有拮抗作

13、用的細(xì)菌大多為革蘭氏陽(yáng)性菌。3.4 細(xì)菌的生理生化特征鑒定共有待測(cè)菌株4種，編號(hào)分別為2-1、15-5、18-4、20-7分別測(cè)定其甲基紅（VP）、乙酰甲基甲醇（VP）、吲哚的產(chǎn)生（細(xì)菌對(duì)色氨酸的利用）、淀粉水解、葡萄糖的氧化發(fā)酵、產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽的利用這7項(xiàng)生理生化特征，得到結(jié)果如下表（表3）所示由下表可知：在已經(jīng)測(cè)定的4株對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)具有明顯拮抗效果的細(xì)菌菌株中，甲基紅實(shí)驗(yàn)除了18-4外都呈現(xiàn)陰性結(jié)果；乙酰甲基甲醇的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性；吲哚的產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)除了2-1為陽(yáng)性外，其余樣本均為陰性；葡萄糖的氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)4種菌均為氧化型；2-1和15-5在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上呈陽(yáng)性反應(yīng)，18-4和20-7

14、在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)，不能利用檸檬酸鹽。對(duì)照以上7項(xiàng)生理生化特征的鑒定結(jié)果，查閱伯杰明細(xì)菌鑒定手冊(cè)，該4個(gè)菌株的鑒定結(jié)果為：?jiǎn)伟鷮伲?8-4）、巨大芽胞桿菌屬（15-5）、蠟樣芽胞桿菌屬（20-7）、枯草芽孢桿菌屬（2-1）.表4 待測(cè)細(xì)菌菌株生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果生理生化特征菌株編號(hào)甲基紅乙酰甲基甲醇吲哚淀粉水解葡萄糖的氧化發(fā)酵產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)檸檬酸鹽的利用2-1-+O+15-5-+O+18-4+-O+-20-7-+O+-符號(hào)：+，90%菌株陽(yáng)性；-，90%菌株陰性；d，1189%菌株陽(yáng)性；+w，陽(yáng)性弱反應(yīng)；O，氧化型；F，發(fā)酵型。部分指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖（圖3）所示：圖3 甲基紅（VP）實(shí)

15、驗(yàn)結(jié)果4 結(jié)論與討論本研究采用稀釋平板法13對(duì)所采取的土樣進(jìn)行細(xì)菌菌株分離與純培養(yǎng)，最終得到50株形態(tài)或顏色各不相同的單菌落，說(shuō)明植物的根際土壤中存在著種類(lèi)繁多的微生物品種。通過(guò)試驗(yàn)篩選出4株對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)具有明顯拮抗作用的細(xì)菌編號(hào)為2-1、15-5、18-4、20-7，這4個(gè)菌株的發(fā)酵液對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的抑制效果最為明顯，這4種細(xì)菌的發(fā)酵液在48h內(nèi)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的致死率均達(dá)到100%。其中編號(hào)為2-1的菌株的發(fā)酵上清液在12h內(nèi)對(duì)植南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的致死率高達(dá)94.44%，具有較好的防治效果和防治潛力。革蘭氏染色結(jié)果：除了18-4為革蘭氏陰性外，其余3種細(xì)菌均為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，由此可以初步的判斷自然界中存在的拮

16、抗植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的細(xì)菌大多為革蘭氏陽(yáng)性菌。通過(guò)接下來(lái)對(duì)其生理生化指標(biāo)的測(cè)定，對(duì)該四個(gè)菌株的鑒定結(jié)果為假單胞菌屬（18-4）、巨大芽胞桿菌屬（15-5）、蠟樣芽胞桿菌屬（20-7）、枯草芽孢桿菌屬（2-1）。前人研究證實(shí)，植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)拮抗細(xì)菌有芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌等。本實(shí)驗(yàn)的拮抗能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株2-1能有效的控制植物寄生根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的種群數(shù)量，同時(shí)控制時(shí)效較長(zhǎng)。不過(guò)盡管如此，但是該菌株是否能開(kāi)發(fā)為相應(yīng)的生物制劑進(jìn)行商品化生產(chǎn)，還需經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的研究去探究；而且該拮抗菌株對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的作用方式和作用機(jī)理也有待進(jìn)一步的探究。因?yàn)楸M管在實(shí)驗(yàn)室條件下該菌株對(duì)植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)具有良好的生物防治作用16,17，

17、當(dāng)時(shí)實(shí)際應(yīng)用效果應(yīng)該結(jié)合大田中土壤微生物數(shù)量，土壤理化性質(zhì)，以及環(huán)境條件等各方面的條件來(lái)綜合考慮18。只有綜合考慮各方面條件，制定合理的使用方法與使用數(shù)量，才能獲得最佳的防治效果。因此，本實(shí)驗(yàn)雖然篩選出了具有明顯拮抗作用的細(xì)菌，但是也有不足之處。由于室內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定沒(méi)有考慮大田環(huán)境中的土壤理化性質(zhì)，作物因素以及其他植物的影響等條件，若進(jìn)一步深入的研究其作用機(jī)理及方式，則對(duì)土壤跟及線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治工作會(huì)產(chǎn)生很大的啟示。為了更有效的防治植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)病害，我們必須運(yùn)用有害生物綜合防治策略（IPM），綜合考慮環(huán)境，作物，病原物三者間的關(guān)系，制定有效的綜合防治策略，綜合合理的總用各種防治手段，達(dá)到最大的經(jīng)濟(jì)，

18、環(huán)境收益，也響應(yīng)了我國(guó)21世紀(jì)植物保護(hù)工作的綜合方針；響應(yīng)了當(dāng)今潮流，采用高效、持久的生物防治手段對(duì)植物線(xiàn)蟲(chóng)病害進(jìn)行防治。參考文獻(xiàn)1 安川,永春柑橘根部15種線(xiàn)蟲(chóng)記述及線(xiàn)蟲(chóng)分離新技術(shù)的研究D.廈門(mén).廈門(mén)大學(xué)2009.2 許志剛.普通植物病理學(xué)M.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2009:219-220. 3 鐘爽,曾會(huì)才,等.香蕉植物線(xiàn)蟲(chóng)病的防治技術(shù) C. 中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)學(xué)會(huì)論文集. 2010.4 陳立杰，段玉璽;不同細(xì)菌菌株對(duì)大豆根腐病菌及胞囊線(xiàn)蟲(chóng)病的影響J.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006, 6; 435-437.5 鄭云峰,李建生,邱美強(qiáng),等.根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)生防菌研究進(jìn)展J.中國(guó)農(nóng)村小康科技,2006(11):62-65.6 郭榮軍,劉杏忠；應(yīng)用根際細(xì)菌防止植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的研究J. 中國(guó)生物防治1996,12(9): 134-137. 7 梁建根,鄭經(jīng)武,等.設(shè)施栽培中蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)生物防治研究進(jìn)展J.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010.8 鄭云峰,李建生.等.根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)生防菌研究進(jìn)展J.中國(guó)農(nóng)村小康科技.2006，11-13.9 Aravind R,Eapen S J,Kumar A.Screening of endopHytic bacteria and evaluation of selected isolates for suppression Of burrowing nemmo