離子交換層析純化及丙酮沉淀

1、1離子交換層析簡介離子交換層析簡介概念：概念： 離子交換層析（離子交換層析（Ion Exchange Ion Exchange ChromatographyChromatography簡稱為簡稱為IECIEC）是以離子交換）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時，其交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時，其結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。方法。 2 離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。離子

2、交換層析的固換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)和平衡離子。純純 化化 原原 理理離子交換劑固定相離子交換劑固定相纖維素纖維素 0(CH2)2-NH+(CH2H5) OHOH- - 基質(zhì)基質(zhì) 電荷基團(tuán)電荷基團(tuán) 反離子反離子 （平衡離子）（平衡離子） 3 離子

3、交換劑的電荷基團(tuán)能夠吸附溶液中的相反離子。若溶液中的離子交換劑的電荷基團(tuán)能夠吸附溶液中的相反離子。若溶液中的 反離子對電荷基團(tuán)的結(jié)合力比平衡離子強(qiáng)，則置換出平衡離子，與電反離子對電荷基團(tuán)的結(jié)合力比平衡離子強(qiáng)，則置換出平衡離子，與電 荷基團(tuán)結(jié)合，這樣溶液中的相反離子與平衡離子發(fā)生交換從而被離子荷基團(tuán)結(jié)合，這樣溶液中的相反離子與平衡離子發(fā)生交換從而被離子 交換劑吸附。這個過程是可逆的。改變洗脫條件又能把被吸附的離子交換劑吸附。這個過程是可逆的。改變洗脫條件又能把被吸附的離子 交換下來。能吸附正離子基團(tuán)發(fā)生交換作用的，稱為交換下來。能吸附正離子基團(tuán)發(fā)生交換作用的，稱為陽離子交換劑陽離子交換劑； 能吸

4、附負(fù)離子基團(tuán)發(fā)生交換作用的稱為能吸附負(fù)離子基團(tuán)發(fā)生交換作用的稱為陰離子交換劑陰離子交換劑。離子交換反應(yīng)。離子交換反應(yīng) 可以表示為可以表示為 陽離子交換反應(yīng)：陽離子交換反應(yīng)： ( R-X( R-X )-Y)-Y + A+ A ( R-X ( R-X )- A)- A + Y+ Y 陰離子交換反應(yīng)：陰離子交換反應(yīng)： ( R-X( R-X+ +)- Y)- Y- -+ A+ A- - ( R-X ( R-X+ +)- A)- A- - + Y+ Y- - ( R-X)-( R-X)-：離子交換劑：離子交換劑 Y Y： 平衡離子平衡離子 A A： 溶液中的離子基團(tuán)溶液中的離子基團(tuán)純化原理純化原理4 從

5、上面的反應(yīng)式中可以看出，如果從上面的反應(yīng)式中可以看出，如果A A離子與離子交換劑的結(jié)合力強(qiáng)離子與離子交換劑的結(jié)合力強(qiáng)于于Y Y離子，或者提高離子，或者提高A A離子的濃度，或者通過改變其它一些條件，可以離子的濃度，或者通過改變其它一些條件，可以使使A A離子將離子將Y Y離子從離子交換劑上置換出來。也就是說，在一定條件下，離子從離子交換劑上置換出來。也就是說，在一定條件下，溶液中的某種離子基團(tuán)可以把平衡離子置換出來，并通過電荷基團(tuán)結(jié)溶液中的某種離子基團(tuán)可以把平衡離子置換出來，并通過電荷基團(tuán)結(jié)合到固定相上，而平衡離子則進(jìn)入流動相，這就是離子交換層析的基合到固定相上，而平衡離子則進(jìn)入流動相，這就是

6、離子交換層析的基本置換反應(yīng)。通過在不同條件下的多次置換反應(yīng)，就可以對溶液中不本置換反應(yīng)。通過在不同條件下的多次置換反應(yīng)，就可以對溶液中不同的離子基團(tuán)進(jìn)行分離。下面以陰離子交換劑為例簡單介紹離子交換同的離子基團(tuán)進(jìn)行分離。下面以陰離子交換劑為例簡單介紹離子交換層析的基本分離過程層析的基本分離過程。溶液中的正離子溶液中的正離子溶液中的負(fù)離子，溶液中的負(fù)離子， 代表負(fù)電量大小代表負(fù)電量大小平衡離子平衡離子純化原理純化原理5 陰離子交陰離子交換劑的電荷換劑的電荷基團(tuán)帶正電，基團(tuán)帶正電，裝柱平衡后，裝柱平衡后，與緩沖溶液與緩沖溶液中的帶負(fù)電中的帶負(fù)電的平衡離子的平衡離子結(jié)合。洗脫結(jié)合。洗脫曲線呈基線曲線呈

7、基線狀態(tài)。狀態(tài)。固固定定相相平衡液平衡液洗脫曲線基線純化原理純化原理6 待分離溶液中待分離溶液中可能有正電基團(tuán)、可能有正電基團(tuán)、負(fù)電基團(tuán)和中性負(fù)電基團(tuán)和中性基團(tuán)。加樣后，基團(tuán)。加樣后，負(fù)電基團(tuán)可以與負(fù)電基團(tuán)可以與平衡離子進(jìn)行可平衡離子進(jìn)行可逆的置換反應(yīng)，逆的置換反應(yīng)，而結(jié)合到離子交而結(jié)合到離子交換劑上。而正電換劑上。而正電基團(tuán)和中性基團(tuán)基團(tuán)和中性基團(tuán)則不能與離子交則不能與離子交換劑結(jié)合，隨流換劑結(jié)合，隨流動相流出，在洗動相流出，在洗脫曲線上出現(xiàn)雜脫曲線上出現(xiàn)雜蛋白峰蛋白峰。加加 樣樣純化原理純化原理洗脫曲線雜蛋白出峰7 溶液中的負(fù)電基團(tuán)結(jié)溶液中的負(fù)電基團(tuán)結(jié)合到離子交換劑上。離合到離子交換劑上。

8、離子交換劑的電荷基團(tuán)對子交換劑的電荷基團(tuán)對不同的離子有不同的結(jié)不同的離子有不同的結(jié)合力。合力。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)等生物大等生物大分子通常呈兩性，它們分子通常呈兩性，它們與離子交換劑的結(jié)合力與離子交換劑的結(jié)合力與它們的與它們的等電點(diǎn)等電點(diǎn)與緩沖液與緩沖液pHpH有較大關(guān)系。對于陰有較大關(guān)系。對于陰離子交換劑來說，在一離子交換劑來說，在一定的定的pHpH緩沖液中，等電緩沖液中，等電點(diǎn)越小的蛋白與離子交點(diǎn)越小的蛋白與離子交換劑結(jié)合力越強(qiáng)。換劑結(jié)合力越強(qiáng)。平衡液平衡液純化原理純化原理洗脫曲線雜蛋白峰8 通過選擇合適的洗脫通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液，如增加方式和洗脫液，如增加離子強(qiáng)度的梯度洗脫。離子強(qiáng)度的

9、梯度洗脫。隨著洗脫液離子強(qiáng)度的隨著洗脫液離子強(qiáng)度的增加，洗脫液中的離子增加，洗脫液中的離子可以逐步與結(jié)合在離子可以逐步與結(jié)合在離子交換劑上的各種負(fù)電基交換劑上的各種負(fù)電基團(tuán)進(jìn)行交換，結(jié)合力小團(tuán)進(jìn)行交換，結(jié)合力小的負(fù)電基團(tuán)先被置換出的負(fù)電基團(tuán)先被置換出來，結(jié)合力強(qiáng)的需要較來，結(jié)合力強(qiáng)的需要較高的離子強(qiáng)度才能被置高的離子強(qiáng)度才能被置換出來，這樣各種負(fù)電換出來，這樣各種負(fù)電基團(tuán)就會按其與離子交基團(tuán)就會按其與離子交換劑結(jié)合力從小到大的換劑結(jié)合力從小到大的順序逐步被洗脫下來，順序逐步被洗脫下來，從而達(dá)到分離目的。從而達(dá)到分離目的。洗洗 脫脫 液液純化原理純化原理洗脫曲線各組分洗脫峰9 洗脫液中的反離子將

10、洗脫液中的反離子將結(jié)合在離子交換劑上的結(jié)合在離子交換劑上的各種負(fù)電基團(tuán)置換出來，各種負(fù)電基團(tuán)置換出來，檢測儀輸出回復(fù)基線狀檢測儀輸出回復(fù)基線狀態(tài)。如此便完成了一個態(tài)。如此便完成了一個層析過程。層析過程。洗洗 脫脫 液液純化原理純化原理10根據(jù)基質(zhì)性質(zhì)分類根據(jù)基質(zhì)性質(zhì)分類根據(jù)電荷基團(tuán)性質(zhì)分類根據(jù)電荷基團(tuán)性質(zhì)分類反離子反離子性質(zhì)性質(zhì)交換交換容量容量應(yīng)用應(yīng)用類型類型種類種類親水性離子交親水性離子交換劑換劑 纖維素離子交換劑纖維素離子交換劑 交聯(lián)葡聚糖離子交換劑交聯(lián)葡聚糖離子交換劑 交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑強(qiáng)酸型陽離子交換劑強(qiáng)酸型陽離子交換劑弱酸型陽離子交換劑弱酸型陽離子交換劑正離子正

11、離子見各產(chǎn)見各產(chǎn)品的使品的使用說明用說明書書主要應(yīng)用主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)于蛋白質(zhì)等大分子等大分子物質(zhì)的分物質(zhì)的分離離強(qiáng)堿性陰離子交換劑強(qiáng)堿性陰離子交換劑弱堿性陰離子交換劑弱堿性陰離子交換劑負(fù)離子負(fù)離子疏水性離子交疏水性離子交換劑換劑各種樹脂各種樹脂強(qiáng)酸型離子交換樹脂強(qiáng)酸型離子交換樹脂弱酸型離子交換樹脂弱酸型離子交換樹脂正離子正離子主要應(yīng)用主要應(yīng)用于核苷酸、于核苷酸、氨基酸等氨基酸等小分子物小分子物質(zhì)的分離質(zhì)的分離強(qiáng)堿性離子交換樹脂強(qiáng)堿性離子交換樹脂弱堿性離子交換樹脂弱堿性離子交換樹脂負(fù)離子負(fù)離子離子交換劑的種類和性質(zhì)離子交換劑的種類和性質(zhì)11 在分離純化生物大分子方面，在分離純化生物大分子方面，離

12、子交換纖維素使用較多，其中以離子交換纖維素使用較多，其中以DEAE-DEAE-纖維素（二乙基氨基纖維素）和纖維素（二乙基氨基纖維素）和CM-CM-纖維素（羧甲基纖維素）纖維素（羧甲基纖維素）最常用，它們在生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)，酶，核酸等）的分離方最常用，它們在生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)，酶，核酸等）的分離方面顯示很大的優(yōu)越性。一是它具有開放性長鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，面顯示很大的優(yōu)越性。一是它具有開放性長鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多；二是它具有親水性，對蛋白質(zhì)等生物大分子物子交

13、換樹脂大的多；二是它具有親水性，對蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達(dá)到分離的目的，因此質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達(dá)到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。三是它的回收率高。所以不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。三是它的回收率高。所以離子交換纖維素已成為非常重要的一類離子交換劑。離子交換纖維素已成為非常重要的一類離子交換劑。 本實驗使用的本實驗使用的DEAE(DEAE(二乙氨乙基二乙氨乙基)-)-纖維素纖維素DE-52DE-52，是弱堿性陰離，是弱堿性陰離子交換纖維素。其結(jié)構(gòu)如下：子交換纖維素。其結(jié)構(gòu)如下：纖維素纖維素 0(CH2)2-NH+

14、(CH2H5) OH- 基質(zhì)基質(zhì) 電荷基團(tuán)電荷基團(tuán) 反離子反離子 （平衡離子）（平衡離子） 離子交換劑固定相離子交換劑固定相12操作要點(diǎn)操作要點(diǎn) 1.離子交換劑的前處理離子交換劑的前處理 離子交換劑使用前一般要進(jìn)行再生和轉(zhuǎn)型處理。首先將干粉在水中充分離子交換劑使用前一般要進(jìn)行再生和轉(zhuǎn)型處理。首先將干粉在水中充分溶脹，用水懸浮去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理溶脹，用水懸浮去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進(jìn)一步去除雜質(zhì)，并使離子

15、交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑進(jìn)一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為中通常陽離子交換劑為NaNa型，陰離子交換劑為型，陰離子交換劑為ClCl型。處理時一般陽離子交換型。處理時一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是HClHCl，堿是，堿是NaOHNaOH或再加一定的或再加一定的NaClNaCl，這樣處理后陽離子交換劑為，這樣處理后陽離子交換劑為NaNa型，陰離子交換劑為型，陰離子交換劑為ClCl型。型。使用的酸堿濃度一般小于使用的酸堿濃度一般小于0.5 mo

16、l / L0.5 mol / L，浸泡時間一般，浸泡時間一般30 min30 min。這就是離子。這就是離子交換劑的再生過程。使用過的離子交換劑通過再生處理，可以使其恢復(fù)原來交換劑的再生過程。使用過的離子交換劑通過再生處理，可以使其恢復(fù)原來性狀，反復(fù)使用。性狀，反復(fù)使用。 離子交換劑的轉(zhuǎn)型是指離子交換劑由一種平衡離子轉(zhuǎn)為另一種平衡離子離子交換劑的轉(zhuǎn)型是指離子交換劑由一種平衡離子轉(zhuǎn)為另一種平衡離子的過程。在離子交換層析前要注意使離子交換劑帶上合適的平衡離子，使平的過程。在離子交換層析前要注意使離子交換劑帶上合適的平衡離子，使平衡離子能與樣品中的組分離子進(jìn)行有效的交換。在分離蛋白質(zhì)時，一般不能衡離

17、子能與樣品中的組分離子進(jìn)行有效的交換。在分離蛋白質(zhì)時，一般不能使用使用H H或或OHOH型離子交換劑，因為分離過程中型離子交換劑，因為分離過程中H H或或OHOH離子被置換出來都會改變層離子被置換出來都會改變層析柱內(nèi)析柱內(nèi)pHpH值，影響分離效果，甚至引起蛋白質(zhì)的變性。本實驗使用的值，影響分離效果，甚至引起蛋白質(zhì)的變性。本實驗使用的DEAE(DEAE(二乙氨乙基二乙氨乙基)-)-纖維素，在酸堿處理再生后，用纖維素，在酸堿處理再生后，用0.02mol/L0.02mol/L，pH6.5pH6.5磷酸磷酸鹽緩沖溶液浸泡即可轉(zhuǎn)型。鹽緩沖溶液浸泡即可轉(zhuǎn)型。以以HPOHPO4 4取代取代DEAEDEAE中

18、的中的OHOH。 132. 2. 裝柱裝柱 裝柱操作過程和要求與凝膠過濾層析相同。離子交換用的層析柱裝柱操作過程和要求與凝膠過濾層析相同。離子交換用的層析柱 一般粗而短，不宜過長，一般粗而短，不宜過長， 直徑和柱長比一般為直徑和柱長比一般為1:101:10到到1:501:50之間。之間。 3. 3. 平衡緩沖液和洗脫緩沖液平衡緩沖液和洗脫緩沖液 平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。洗平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。洗 脫液是在雜蛋白完全流出后，進(jìn)行目的蛋白洗脫時使用的緩沖液，通脫液是在雜蛋白完全流出后，進(jìn)行目的蛋白洗脫時使用的緩沖液，通 常有在平衡液

19、的基礎(chǔ)上增加離子強(qiáng)度或改變常有在平衡液的基礎(chǔ)上增加離子強(qiáng)度或改變pHpH兩種方式。平衡液和洗兩種方式。平衡液和洗 脫液的使用順序不能顛倒。脫液的使用順序不能顛倒。 4. 4. 上樣量上樣量 離子交換層析的加樣量與柱床體積沒有直接關(guān)系，但與離子交換劑離子交換層析的加樣量與柱床體積沒有直接關(guān)系，但與離子交換劑 的總交換容量有關(guān)，還與樣品中目的蛋白的吸附性能和濃度有關(guān)。加樣的總交換容量有關(guān)，還與樣品中目的蛋白的吸附性能和濃度有關(guān)。加樣 量可以通過一些簡單的方法測定也可以參考相應(yīng)的交換容量。一般來說量可以通過一些簡單的方法測定也可以參考相應(yīng)的交換容量。一般來說 上樣量為總交換容量的上樣量為總交換容量的

20、40%40%。5. 5. 上樣操作：基本上與凝膠過濾層析相同，但是在有效成分與固定相之間的上樣操作：基本上與凝膠過濾層析相同，但是在有效成分與固定相之間的 離子交換吸附有一個過程，所以上樣流速不宜過快離子交換吸附有一個過程，所以上樣流速不宜過快。14雞卵粘蛋白的離子交換層析純化雞卵粘蛋白的離子交換層析純化 CHOM CHOM的分子是由的分子是由4 4個亞基組成的，其等電點(diǎn)個亞基組成的，其等電點(diǎn)在在pH3.9pH3.94.54.5之間，分子量為之間，分子量為2.8 2.8 10104 4。在。在PH6.5PH6.5的緩沖液中帶負(fù)電荷，能被弱陰性離子交換的緩沖液中帶負(fù)電荷，能被弱陰性離子交換劑劑D

21、EAEDEAE纖維素吸附。由于吸附力較弱，通過提高纖維素吸附。由于吸附力較弱，通過提高洗脫液中鹽離子的強(qiáng)度，可以將洗脫液中鹽離子的強(qiáng)度，可以將CHOMCHOM洗脫下來，洗脫下來，由此達(dá)到純化目的。由此達(dá)到純化目的。 15v主要儀器主要儀器 恒流泵恒流泵 紫外檢測儀紫外檢測儀 N2000N2000生化工作站軟件生化工作站軟件布氏漏斗、抽濾瓶布氏漏斗、抽濾瓶 循環(huán)水真空泵循環(huán)水真空泵 1010200mm 200mm 層析柱層析柱v材料材料 DEAE-52DEAE-52離子交換纖維素離子交換纖維素v樣品樣品 凝膠過濾層析脫鹽液凝膠過濾層析脫鹽液 v試劑試劑 離子交換劑再生：離子交換劑再生： 0.5m

22、ol/L HCl0.5mol/L HCl 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 平衡液：平衡液： 0.02mol/L, pH6.50.02mol/L, pH6.5磷酸緩沖液磷酸緩沖液 洗脫液：洗脫液： 0.3mol/L NaCl0.3mol/L NaCl0.02mol/L, pH6.50.02mol/L, pH6.5磷酸緩沖液磷酸緩沖液 試劑和器材試劑和器材16離子交換劑的前處理離子交換劑的前處理抽干后轉(zhuǎn)移至燒杯中抽干后轉(zhuǎn)移至燒杯中用用100ml 0.5mol/L NaOH-100ml 0.5mol/L NaOH-0.5

23、mol/L NaCl0.5mol/L NaCl溶液室溫下浸泡溶液室溫下浸泡20min20min布氏漏斗中抽濾，用蒸餾水洗至中性（大約布氏漏斗中抽濾，用蒸餾水洗至中性（大約PH8PH8即可）即可）抽干后轉(zhuǎn)移至燒杯中，用抽干后轉(zhuǎn)移至燒杯中，用100ml 0.5mol/L HCl100ml 0.5mol/L HCl浸泡浸泡20min20min布氏漏斗中抽濾，用蒸餾水洗至中性（布氏漏斗中抽濾，用蒸餾水洗至中性（PH6-7PH6-7即可）即可）抽干后轉(zhuǎn)移至燒杯中，用抽干后轉(zhuǎn)移至燒杯中，用100ml 0.02mol/L100ml 0.02mol/L，PH6.5PH6.5磷酸緩沖磷酸緩沖液浸泡，脫氣后裝柱。

24、液浸泡，脫氣后裝柱。稱稱10g DEAE10g DEAE纖維素粉（纖維素粉（DE-52DE-52），用過量的水傾），用過量的水傾去懸浮的細(xì)顆粒，轉(zhuǎn)入布氏漏斗中抽濾去懸浮的細(xì)顆粒，轉(zhuǎn)入布氏漏斗中抽濾17裝裝 柱柱 u裝柱操作過程和要求與凝膠過濾層析相同。裝柱操作過程和要求與凝膠過濾層析相同。1.1.垂直安裝好層析柱，檢查是否堵塞或漏液。垂直安裝好層析柱，檢查是否堵塞或漏液。2.2.往柱內(nèi)加入往柱內(nèi)加入1/ 4 1/ 4 平衡液，將處理好的離子交換劑平衡液，將處理好的離子交換劑全部全部裝入柱內(nèi)。打開恒流泵，以裝入柱內(nèi)。打開恒流泵，以1ml / min 1ml / min 的流的流速輸入平衡液，讓離

25、子交換劑沉降。沉降好的柱速輸入平衡液，讓離子交換劑沉降。沉降好的柱床高度約床高度約7-87-8厘米。注意柱床面留有厘米。注意柱床面留有3-43-4厘米高的厘米高的平衡液，以免柱頭滴下的液體沖壞柱床表面。平衡液，以免柱頭滴下的液體沖壞柱床表面。18檢測儀器的準(zhǔn)備 打開紫外檢測儀預(yù)熱。按照“N 2000 N 2000 生化工作站生化工作站使用方法使用方法”及“核酸蛋白檢測儀使用方法核酸蛋白檢測儀使用方法”連接連接導(dǎo)線、導(dǎo)線、設(shè)置參數(shù)，調(diào)整好儀器。點(diǎn)擊“基線查看”觀察基線，基線平穩(wěn)后即可上樣。19加 樣1. 關(guān)閉恒流泵，關(guān)緊止水夾，關(guān)緊止水夾，小心地吸去柱上多余的液體，凝膠床面上留下薄薄的一層液體即

26、可。2. 用滴管將已經(jīng)脫鹽的CHOM粗提取液上柱吸附。待樣品全部進(jìn)入固定相后，加入0.02mol/L，PH6.5磷酸緩沖液并點(diǎn)擊軟件的“數(shù)據(jù)采集”。20洗 脫 中性和酸性雜蛋白不被吸附，隨平衡液流出，在洗脫曲線上繪出雜蛋白峰。繼續(xù)以平衡液流經(jīng)柱子，當(dāng)雜蛋白峰完全下降，流出液在核酸蛋白質(zhì)檢測儀上繪出穩(wěn)定的基線后，改用含0.3mol/L NaCl的0.02mol/L，PH6.5磷酸洗脫液洗脫。雞卵粘蛋白在DEAE纖維素離子交換柱層析上分離圖如下： 洗脫體積/ml 雞卵粘蛋白在雞卵粘蛋白在DEAE-DEAE-纖維素離子交換纖維素離子交換 柱層析上的分離圖柱層析上的分離圖 21洗脫峰收集 收集第收集第

27、洗脫峰。收集的體積一般在洗脫峰。收集的體積一般在25-30ml25-30ml為為宜。如果在前面的提取過程中，條件控制得適宜，宜。如果在前面的提取過程中，條件控制得適宜，提取的雞卵粘蛋白是較純的，有可能不出現(xiàn)卵清提取的雞卵粘蛋白是較純的，有可能不出現(xiàn)卵清蛋白峰（峰蛋白峰（峰IIII）。）。vv盡量收集洗脫峰濃度較高的峰頂部盡量收集洗脫峰濃度較高的峰頂部分，利于下一步的丙酮沉淀。分，利于下一步的丙酮沉淀。22回收離子交換劑，方法與凝膠過濾層析實回收離子交換劑，方法與凝膠過濾層析實驗相同。驗相同。保存樣品，準(zhǔn)備脫鹽和丙酮沉淀純化。保存樣品，準(zhǔn)備脫鹽和丙酮沉淀純化。23 這一步驟不但繼續(xù)純化經(jīng)離子交換

28、層析這一步驟不但繼續(xù)純化經(jīng)離子交換層析制備的雞卵粘蛋白，還起到濃縮的作用，利制備的雞卵粘蛋白，還起到濃縮的作用，利于后續(xù)的偶聯(lián)工作。于后續(xù)的偶聯(lián)工作。 雞卵粘蛋白純品的制備雞卵粘蛋白純品的制備 丙酮沉淀丙酮沉淀24試劑：試劑： 丙酮（丙酮（A.R） 透析袋（透析袋（2.7cm2.7cm）儀器：儀器： 酸度計酸度計 低速離心機(jī)低速離心機(jī) 磁力攪拌器磁力攪拌器試劑和器材試劑和器材25 透析是最簡便的脫鹽方法。把專用的半透膜制成袋狀，將生物大透析是最簡便的脫鹽方法。把專用的半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品溶液置入袋內(nèi)，將此透析袋浸入水或緩沖液中，由于袋內(nèi)分子樣品溶液置入袋內(nèi)，將此透析袋浸入水或緩沖液

29、中，由于袋內(nèi)外溶液濃度的差異形成擴(kuò)散壓，樣品溶液向袋外擴(kuò)散。大分子量的外溶液濃度的差異形成擴(kuò)散壓，樣品溶液向袋外擴(kuò)散。大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)散到袋外，直生物大分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)散到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。不斷地更換袋外液，袋內(nèi)的小到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。不斷地更換袋外液，袋內(nèi)的小分子就能不斷地擴(kuò)散出去，最后達(dá)到脫鹽的目的。分子就能不斷地擴(kuò)散出去，最后達(dá)到脫鹽的目的。 丙酮沉淀前需要將收集的洗脫峰溶液脫鹽。脫鹽的方法用透析。丙酮沉淀前需要將收集的洗脫峰溶液脫鹽。脫鹽的方法用透析。 半透膜半透膜大分子大分子小分子小分子

30、透析簡介透析簡介26 目前最常用的透析袋是美國目前最常用的透析袋是美國Union Carbide Union Carbide （聯(lián)合碳化物公（聯(lián)合碳化物公司）和美國光譜醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的各種尺寸的透析袋，截留分子司）和美國光譜醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的各種尺寸的透析袋，截留分子量量MwCOMwCO（即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量，縮寫為（即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量，縮寫為MwCOMwCO）通常為）通常為1 1萬左右。萬左右。 商品透析袋制成管狀，其扁平寬度為商品透析袋制成管狀，其扁平寬度為23 mm23 mm50 mm50 mm不等。為防干裂，出廠時都用不等。為防干裂，出廠時都用1010的

31、甘油處理過，的甘油處理過，并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì)，并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì)，它們對蛋白質(zhì)和其它生物活性物質(zhì)有害，用前必須除去。可先它們對蛋白質(zhì)和其它生物活性物質(zhì)有害，用前必須除去?？上扔糜?050乙醇煮沸乙醇煮沸1 1小時，再依次用小時，再依次用5050乙醇、乙醇、0.01 mol/L0.01 mol/L碳酸氫碳酸氫鈉和鈉和0.001 mol/L EDTA0.001 mol/L EDTA溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即可使用。溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即可使用。新透析袋如不作如上的特殊處理，則可用沸水煮五至十分鐘，新透析袋如不作如上的特殊處理，則可用沸水煮五至十分鐘，再用蒸餾水洗凈，也可使用。使用后的透析袋洗凈后可存于再用蒸餾水洗凈，也可使用。使用后的透析袋洗凈后可存于44蒸餾水中，若長時間不用，可加少量蒸餾水中，若長時間不用，可加少量NaN2NaN2，以防長菌。，以防長菌。 檢查透析效果的方法是：用檢查透析效果的方法是：用1 1 BaCl2BaCl2檢查檢查(NH4)2SO4(NH4)2SO4，用用1 1 AgNO3 AgNO3 檢查檢查NaClNaCl、KClKCl等。等。27透析袋的準(zhǔn)備：透析袋的準(zhǔn)備：