卵丘細胞對豬卵母細胞體外成熟影響的設計說明

1、 燕山大學課 程 設 計 說 明 書卵丘細胞對豬卵母細胞體外成熟影響的設計學院（系）：年級 專業(yè)： 0 學 號：學生 ：指導 教師：教師 職稱：燕山大學課程設計（論文）任務書院（系）： 基層教學單位： 學 號學生專業(yè)（班級）設計題目卵丘細胞對豬卵母細胞體外成熟的影響設計主要容1.卵丘細胞存在對豬卵母細胞成熟的影響2.卵丘細胞層數(shù)對豬卵母細胞體外成熟的影響設計要求1.提出設計方案前應充分查閱各種文獻資料，2.要有明確設計的目的,設計合理的操作方式3.設計出合理的測定指標4.設計的容要與題目基本一致5.設計總結(jié)與分析工作量1.至少閱讀15篇以上的相關科技文獻2.設計文字至少在15000字以上工作計

2、劃12.28-12.31 查閱資料1.1-1.3 整理文獻1.4-1.8 設計方案1.9-1.11 撰寫說明書1.12 檢查容準備答辯參考資料1 大元. 受精生物學M. 科學, 2000, 51: 147-148.2 王海, 曾申明, 朱士恩. 培養(yǎng)介質(zhì)、卵丘細胞和卵泡直徑對豬卵母細胞體外成熟的影響J. 中國畜牧雜志, 2002, 38: 15-16.3 錢云, 丁家桐, 紅林. 卵母細胞成熟的形態(tài)學特征與其調(diào)控J. 國外畜牧科技, 2001, 26: 26-30.指導教師簽字基層教學單位主任簽字說明：學生、指導教師、基層教學單位各一份。年 月 日 燕山大學課程設計成績評定表設計者: 學號:設

3、計題目: 說明書成績評定（滿分100分）： 得分設計容的切題程度：滿分20分 （ ）設計容立題合理性：滿分10分 （ ）設計容的規(guī)程度：滿分10分 （ ）設計書前后容完整：滿分20分 （ ）設計說明說排版成績：滿分20分 （ ）設計說明書的工作量：滿分10分 （ ）設計過程平時成績： 滿分10分 （ ）總分成績：指導教師：年 月 日答辯成績評定：（滿分100分） 得分儀表成績：滿分20分 （ ）口語表達：滿分20分 （ ）幻燈質(zhì)量：滿分20分 （ ）設計分析：滿分40分 （ ） 總分： 教師：年 月 日設計撰寫成績（70%）答辯成績（30%）合計教師簽字：年 月 日2010-2011 秋季學期

4、生物工程專業(yè)課程設計結(jié)題論文卵丘細胞對豬卵母細胞體外成熟影響的設計學院（系）：年級 專業(yè)：學 號：學生 ：指導 教師：教師 職稱：摘 要卵丘細胞是影響卵母細胞成熟的重要因素，尤其是包裹在卵母細胞周圍的卵丘細胞。本設計主要探討卵丘細胞對牛卵母細胞體外成熟的影響。設計容主要分為兩部分：卵丘細胞存在對豬卵母細胞體外成熟影響的設計；卵丘細胞層數(shù)對豬卵母細胞體外成熟影響的設計。第一部分設計擬定探索出卵丘細胞的存在能夠提高卵母細胞體外培養(yǎng)成熟；第二部分設計是在第一部分的基礎上分析卵丘細胞層數(shù)對母細胞成熟的影響。通過本次設計，擬定探討卵丘細胞的存在和不同形態(tài)對豬卵母細胞的成熟率的影響。為提高卵母細胞的質(zhì)量，

5、使體外受精、細胞核移植、轉(zhuǎn)基因與胚胎干細胞等技術研究的順利進行，而作為這些研究基礎環(huán)節(jié)的卵母細胞體外成熟技術尤為重要。關鍵詞：卵丘細胞；豬卵母細胞；體外成熟17 / 25目 錄第一部分文獻綜述11.哺乳動物卵母細胞體外成熟研究進展11.1卵母細胞體成熟的生理機理11.2卵母細胞體外成熟的機理12. 影響豬卵母細胞體外成熟的因素22.1影響豬卵母細胞體外成熟的生理性因素22.1.1卵巢來源豬的年齡、品種與健康狀況22.1.2所采集卵巢所處的性周期22.1.3采集卵巢離體時間與保存溫度32.1.4采集卵母細胞的方法32.2影響豬卵母細胞體外成熟的物理性因素32.2.1體外成熟培養(yǎng)條件42.2.2體

6、外成熟培養(yǎng)時間42.2.3體外成熟培養(yǎng)方式42.3影響豬卵母細胞體外成熟的化學性因素42.3.1成熟培養(yǎng)基42.3.2激素52.3.3血清52.3.4卵泡液62.3.5細胞生長因子63.卵丘細胞與卵母細胞關系的研究進展73.1卵丘細胞與卵母細胞在卵母細胞成熟過程中的結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系73.2卵丘擴展對卵母細胞體外成熟的影響83.3卵丘細胞層數(shù)對卵母細胞體外成熟的影響93.4去除卵丘細胞的卵母細胞在體外成熟過程中的超微結(jié)構(gòu)變化10第二部分課程設計部分111.實驗材料111.1 卵巢111.2 實驗用的儀器111.3 實驗試劑122.方法122.1 卵丘-卵母細胞復合體（COCs）的收集122.2豬卵

7、母細胞的分級122.3卵母細胞的成熟培養(yǎng)132.4各組卵母細胞的成熟觀察133. 設計133.1卵丘細胞存在對卵母細胞體外成熟的影響133.2卵丘細胞層數(shù)對卵母細胞體外成熟的影響134.分析與總結(jié)144.1卵丘細胞存在對卵母細胞體外成熟的影響144.2卵丘細胞層數(shù)對卵母細胞體外成熟的影響145.設計體會15參考文獻16第一部分 文獻綜述1.哺乳動物卵母細胞體外成熟研究進展1.1卵母細胞體成熟的生理機理卵母細胞成熟是指卵母細胞恢復和完成第一次減數(shù)分裂，進入并停滯于第二次減數(shù)分裂中期，此間伴隨著胞漿成熟，即卵母細胞的成熟包括其核成熟和胞漿成熟兩個方面v。核成熟是核膜破裂，同源染色體分離和排出第一極

8、體；胞漿成熟是胞漿各種蛋白組成達到一定水平與線粒體的有效重排。1.2卵母細胞體外成熟的機理卵母細胞體外成熟（IVM）是指在體外人工給定的條件下，哺乳動物次級卵母細胞經(jīng)過一系列的生長發(fā)育最終形成有受精能力的成熟卵母細胞的過程。卵母細胞的體外成熟包括細胞核的成熟、細胞質(zhì)的成熟、卵丘細胞的成熟、透明帶的成熟以與其卵丘-卵母細胞復合體的發(fā)育成熟等一系列復雜的變化過程，主要表現(xiàn)在細胞核成熟和細胞質(zhì)成熟兩個方面。在形態(tài)學方面表現(xiàn)為紡錘體形成，核仁致密化，染色質(zhì)高度濃縮成染色體，第一極體釋放，細胞器重組，卵丘細胞擴展、膨脹和透明帶軟化等一系列生理變化vii。細胞核成熟即卵母細胞恢復減數(shù)分裂，發(fā)生生發(fā)泡破裂(

9、genninal vesiclebreakdown，GVBD)并發(fā)育到第一次減數(shù)分裂中期；與此同時，卵母細胞進一步跨越第一次減數(shù)分裂中期，排出第一極體(第一極體含有極微量的細胞質(zhì)，不久就退化)并停止于第二次減數(shù)分裂的中期，直到受精(或激活)后才完成第二次減數(shù)分裂并排出第二極體。細胞質(zhì)的成熟包括細胞器的變化和細胞基質(zhì)的變化，皮質(zhì)顆粒在胞質(zhì)合成后，逐漸遷移到質(zhì)膜下的皮質(zhì)區(qū)。高爾基復合體最初位于核的周圍，成熟過程中移向皮質(zhì)，皮質(zhì)顆粒完全形成后，高爾復合體在皮質(zhì)中消失。發(fā)育早期的線粒體為圓形或橢圓形等，主要分布于皮質(zhì)部，卵母細胞成熟后，線粒體又移向核周圍，形成幼稚型線粒體。隨著卵母細胞的成熟，粗面質(zhì)網(wǎng)

10、減少，而滑面質(zhì)網(wǎng)增多，到成熟晚期，滑面質(zhì)網(wǎng)變得很少。胞質(zhì)成熟一個非常重要的特點是積累一些穩(wěn)定的mRNA，并在卵母細胞成熟到一定階段進行蛋白質(zhì)翻譯。有些細胞質(zhì)成熟過程依賴于細胞核成熟。 透明帶軟化也是卵母細胞成熟的標志。透明帶是一層糖蛋白膜，受精時可以結(jié)合并誘導精子發(fā)生頂體反應，并阻止多精受精。在卵母細胞的成熟過程中，有很多化學物質(zhì)與因子參與反應，因此，只有當體外成熟條件與體卵母細胞發(fā)育所需要的環(huán)境非常接近時，才能獲得較高的成熟率，從而為進一步的科研工作提供優(yōu)質(zhì)大量成熟的卵母細胞。2. 影響豬卵母細胞體外成熟的因素2.1影響豬卵母細胞體外成熟的生理性因素2.1.1 卵巢來源豬的年齡、品種與健康狀

11、況同一種動物在不同年齡段其卵母細胞在體外成熟的情況也有所不同。從初情期前的青年母豬卵巢中獲得的豬卵母細胞經(jīng)過體外成熟培養(yǎng)后可得到IVP 后代，但是，成功的效率不如經(jīng)產(chǎn)母豬卵巢體外成熟的卵母細胞。不同的國家和地區(qū)之間，豬的品種必定存在著遺傳因素、飼養(yǎng)環(huán)境和氣候條件等等的因素而帶來品質(zhì)上的差異，從而影響豬卵母細胞的質(zhì)量進而對體外成熟培養(yǎng)也產(chǎn)生一定的影響。而即使是從同一品種和統(tǒng)一地區(qū)的豬種所獲得的卵母細胞進行體外培養(yǎng)，其培養(yǎng)效果也會因豬的健康情況和卵巢質(zhì)量等的影響而有很大的不同，比如，處在育齡盛期的健康母豬，其卵巢的體積大，表面卵泡多而且直徑在3-6mm 的卵泡相對比例就會較高，抽得的卵母細胞形態(tài)完

12、好，裸卵少，相對體外成熟培養(yǎng)效果也好。反之，取自仔豬、處女豬、老母豬與老弱病殘豬的卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)效果則較差。2.1.2所采集卵巢所處的性周期所采集的卵巢所處的性周期同樣影響卵母細胞體外成熟培養(yǎng)結(jié)果，根據(jù)采集卵巢所處的性周期，將其分為卵泡期和黃體期，再將黃體期卵巢分為有黃體期卵巢和無黃體期卵巢。無黃體期卵巢上的卵母細胞比黃體期卵巢上卵母細胞成熟效果要好。亞利等認為豬卵泡期卵母細胞的培養(yǎng)效果要高于黃體期，但差異不顯著。輝等研究表明，在牛卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)中，有著同樣的結(jié)果，即卵泡期卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)結(jié)果要高于黃體期xxvi。因此，卵巢所處性周期不同，卵泡的能量物質(zhì)、激素濃度等也會隨

13、之而發(fā)生變化，進而影響了體外成熟培養(yǎng)的結(jié)果。2.1.3采集卵巢離體時間與保存溫度一般而言，卵巢離體的時間要求在24h ，時間越短，所獲得的卵母細胞的質(zhì)量越好，體外成熟培養(yǎng)的效果也越好。文國藝等xxvii研究認為，豬卵巢離體時間越短，其卵母細胞的卵裂率越高，并且隨著離體時間的延長而降低。相對于其他哺乳動物而言，豬卵母細胞對溫度的敏感度較高，較高或較低都會直接影響到體外成熟的效果，一般來講，豬卵巢的保存溫度在2835，文國藝等研究表明，當卵巢的保存溫度低于25，豬卵母細胞體外成熟收到明顯的影響并進而影響到受精的結(jié)果。2.1.4卵泡的大小與卵丘細胞目前，普遍認為進行體外培養(yǎng)的豬卵母細胞在38mm，培

14、養(yǎng)效果較好。Yoon等研究發(fā)現(xiàn)來自38mm直徑卵泡的卵母細胞成熟率顯著高于小于3mm的卵泡卵母細胞(91%vs 58%)。毅冰等也證明小直徑卵泡卵母細胞(<12 mm)成熟率不如大直徑卵泡卵母細胞（26mm）。但在特別大的卵泡中有些卵母細胞有嚴重退化的現(xiàn)象。大多數(shù)哺乳動物的卵母細胞被卵丘細胞包裹形成COCs）。排卵之前，卵丘細胞擴展，合成大量胞外基質(zhì)，并富含透明質(zhì)酸（Hyaluronic：HA），有利于排卵后進入輸卵管，同時保證了卵母細胞正常的受精和胚胎發(fā)育潛力，所以，卵丘細胞的擴對卵母細胞成熟，特別是卵母細胞胞質(zhì)成熟起著重要作用。根據(jù)卵母細胞外面包裹的卵丘細胞的層數(shù)將其分成三級。A 級

15、：卵丘細胞在3 層或3層以上。B 級：卵丘細胞為12 層；或卵丘細胞雖在3 層或3 層以上，但是不完整，部分為12 層。C 級：裸卵或卵丘細胞雖為12 層或多層，但是不完整，部分裸露。A 級卵母細胞的培養(yǎng)效果要優(yōu)于B 級和C 級。2.1.4采集卵母細胞的方法目前，常用的采集豬卵母細胞的方法有三種即抽吸法、切割法和刺破法，相對于刺破法和切割法而言，抽吸法較為常用，但是所獲得的卵母細胞質(zhì)量較差，甚至出現(xiàn)較多的裸卵，進而間接地影響了體外培養(yǎng)的效果。2.2影響豬卵母細胞體外成熟的物理性因素2.2.1體外成熟培養(yǎng)條件溫度 不同動物的卵母細胞所需要的體外成熟培養(yǎng)溫度因動物種類的不同而不同，豬所需要的溫度一

16、般為3839較為適宜，過高或過低都不利于細胞的發(fā)育。濕度在IVM 時一般采用的是飽和濕度，目的是減少培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，從而維持培養(yǎng)基中卵母細胞所需要的各種物質(zhì)的濃度與保持滲透壓。通常在培養(yǎng)基上面覆蓋一層石蠟油或礦物油，以使在培養(yǎng)箱或離箱操作時維持培養(yǎng)基的氣相、濕度與pH 值。此外，培養(yǎng)箱所用的水的純度和高度無菌也是培養(yǎng)成功的關鍵性因素。氣相環(huán)境目前卵母細胞常用的培養(yǎng)氣相有兩種即是5%CO2、5%O2、90%N2和5%CO2、95%的空氣xxxii。在這兩種氣相中，CO2的含量很關鍵。多數(shù)培養(yǎng)基在配制前都已將pH 值調(diào)好，并具有一定的緩沖能力，因此，5%CO2 則剛好是維持pH 所必需。另外，要

17、保證所用氣體的無毒。2.2.2體外成熟培養(yǎng)時間不同動物的卵母細胞所需要的體外成熟培養(yǎng)時間因動物種類的不同而有所不同，大多數(shù)哺乳動物所需要的體外培養(yǎng)時間為2224h，但是對豬而言，卻需要更長的時間，一般，豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的時間為44h。Sosnowki 等研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4048 h 與3036 h 對豬卵母細胞體外成熟率差異顯著，但是分析染色體核型發(fā)現(xiàn)，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，染色體異常率會隨之增加。2.2.3體外成熟培養(yǎng)方式目前，常用的豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)方式有微滴培養(yǎng)法、套皿培養(yǎng)法與普通的單皿培養(yǎng)法。相對于普通的單皿培養(yǎng)法而言，微滴培養(yǎng)法和套皿培養(yǎng)法可以更好的保持細胞發(fā)育所需要的微環(huán)境

18、，同時減少微生物的污染。俊等研究認為在豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中，套皿培養(yǎng)法可以代替微滴培養(yǎng)法中礦物油的作用，從而可以減少礦物油對細胞的危害。2.3影響豬卵母細胞體外成熟的化學性因素2.3.1成熟培養(yǎng)基成熟基礎液的構(gòu)成,直接影響到卵母細胞的成熟率與以后的受精和胚胎發(fā)育。豬卵母細胞的IVM 液有Whitten's medium，NCSU-23，TCM-199NCSU-37。目前豬卵母細胞體外培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)液以TCM-199和NCSU-23使用較多。成熟培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)液不同卵母細胞成熟后GSH 的含量存在顯著差異，IVF后雄原核形成率也不同。Wang等人的研究顯示在NCSU-23 中成熟的卵

19、母細胞IVF 后囊胚發(fā)育率顯著高于在TCM-199 和改良Whitten's 液中Lalantha等人認為在不添加蛋白質(zhì)添加物的情況下TCM-199 更有利于卵母細胞的核成熟，而在Waymouth基礎液中成熟的卵母細胞其核成熟率雄原核形成率和囊胚發(fā)育率較低。王海等研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞在兩種培養(yǎng)液中的成熟率差異不顯著。但葉華虎等研究發(fā)現(xiàn)，受精后胚胎發(fā)育能力NCSU-23占明顯優(yōu)勢。2.3.2激素在卵母細胞的體外培養(yǎng)體系中，F(xiàn)SH、LH 有利于改變卵丘細胞的代機能，并阻斷卵丘細胞通過胞間連接向卵母細胞分泌減數(shù)分裂抑制因子的途徑，從而使卵母細胞恢復成熟分裂過程 。在豬卵母細胞體外成熟研究中，許

20、多學者都選擇添加PMSG,有人還認為添加PMSG 和hCG 的組合對豬卵母細胞核成熟的促進作用優(yōu)于添加FSH 和LH。尤其對于LH 的添加存在爭議，有研究者認為LH 在卵母細胞培育過程中并未發(fā)揮作用，Izadyar 等認為在不含血清的成熟培養(yǎng)液中，只有FSH 能影響卵母細胞的成熟，而LH 沒有作用；Bevers 等認為小于8mm 的牛卵泡中，顆粒細胞上只有FSH 受體mRNA，而沒有LH 受體mRNA。但禮繁等卻認為LH 對豬卵母細胞體外成熟的促進效果要強于FSH。在早期的研究中，促性腺激素多數(shù)存在于整個體外培養(yǎng)過程，但1994 年，F(xiàn)unashi 等的研究表明，在豬卵母細胞IVM 時，培養(yǎng)前

21、20 h 加入PMSG、hCG、E2，而在培養(yǎng)后20 h 去除，可增加卵母細胞的成熟率，同時可以促進卵母細胞減數(shù)分裂和胞質(zhì)的成熟，而且有利于卵母細胞的發(fā)育和受精。蔡令波等在培養(yǎng)后期去除促性腺激素也得出了相似結(jié)果。2.3.3血清自20 世紀80 年代血清應用于卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)以來，血清在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)并利用，血清中含有許多成分包括能量物質(zhì)、氨基酸、維生素、激素、生長因子和細胞因子等等能夠促進原始卵泡卵母細胞生長啟動，并提供生長所需的一種或幾種因子，因而，培養(yǎng)液中添加動物血清可促進卵母細胞成熟。在豬卵母細胞體外培養(yǎng)中，用得最廣泛的是在成熟培養(yǎng)液中添加10%的胎牛血清（F

22、etal bovine serum，F(xiàn)BS）。蔡令波等曾研究表明發(fā)情牛血清（Estrus cows serum，ECS）較新生犢牛血清（Newborn Calf Serum，NCS）更有利于豬卵母細胞體外成熟。近年來，許多研究者又在豬的卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加一定比例的豬血清，其中包括:新生仔豬血清，母豬發(fā)情的血清等。雖然血清對于豬卵母細胞的體外培養(yǎng)有較好的促進作用，但是血清也有其本身固有的不利因素，如血清中所含有的激素、維生素、細胞因子、生長因子，以與許多未知物質(zhì)，并且容易被支原體感染。此外血清的來源不同、批次不同均會導致血清中所含組分與組分間比例不同，從而導致了卵母細胞體外成熟、體外受精和

23、體外培養(yǎng)的不穩(wěn)定。因此，尋找比較適宜的血清替代品成為當前的一大研究熱點，目前用來代替血清的替代品有牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin ， BSA) 、聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol ， PVA) 、聚乙烯毗咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)等大分子有機物質(zhì)。2.3.4卵泡液豬卵泡液(pig follicular fluid，pFF)是豬卵母細胞發(fā)育的微環(huán)境，對卵母細胞的成熟有著重要的調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)在提高豬卵母細胞成熟的質(zhì)量并增加胚胎的發(fā)育能力。Naito 等xlv的研究認為：在體外成熟培養(yǎng)中，PFF 可以促進豬卵母細胞胞質(zhì)的成熟，并顯

24、著提高豬卵母細胞受精后的原核形成率。Yashida 等報道在成熟培養(yǎng)基中添加豬卵泡液可顯著提高豬卵母細胞的核成熟率、正常受精率與卵裂率。Vatzias 等研究發(fā)現(xiàn)冷凍卵泡液在促進卵母細胞的成熟、降低多精受精方面優(yōu)于新鮮卵泡液，孟慶剛等認為在激素存在的條件下，pFF 具有促進豬小腔卵泡卵母細胞體外成熟的作用。2.3.5細胞生長因子與卵母細胞體外成熟相關的細胞生長因子主要包括表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)，胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGF)、成纖維細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor，

25、FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF )與神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)等，這些細胞生長因子之間相互作用，對卵母細胞的成熟、受精與卵裂起著重要作用。目前已經(jīng)證實，EGF 可以促進豬卵母細胞的核成熟。Abeydeera的研究表明，EGF 能提高卵母細胞成熟過程中蛋白質(zhì)的合成，從而提高卵母細胞胞質(zhì)的質(zhì)量，IGF 對細胞具有促分裂、分化與促代等生物學功能，是一個具有多種生理功能的生長因子，因此，同樣能促進豬卵母細胞的成熟，并能提高所得胚胎的發(fā)育能力。TGF-，在結(jié)構(gòu)上和功能上與EGF 相似，因而也可以與EGF受體結(jié)合，誘

26、導豬卵丘細胞的擴散，促進卵母細胞核成熟。NGF 也是豬卵母細胞體外成熟過程中重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，能影響豬卵母細胞成熟的動力學，加快進入M11 期。3.卵丘細胞與卵母細胞關系的研究進展卵母細胞的體外成熟可以為細胞核移植、轉(zhuǎn)基因等胚胎工程的研究提供大量卵母細胞。在排卵前，由于促性腺激素的作用，卵母細胞完成減數(shù)分裂的同時，卵丘卵母細胞復合物（4C4D）的卵丘發(fā)生擴展，4C4D在體外成熟培養(yǎng)過程中也發(fā)生類似的變化。卵丘細胞與卵母細胞、卵丘擴展與卵母細胞成熟之間的關系很復雜。本文主要對卵丘細胞在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)過程中的作用加以闡述，進而對卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)加以改進。3.1卵丘細胞與卵母細胞在卵母

27、細胞成熟過程中的結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系卵母細胞的發(fā)育成熟與其周圍的卵泡細胞的作用是分不開的。原始卵泡由位于中心的卵母細胞和其周圍的一層扁平卵泡細胞組成。此時卵母細胞處于第一次減數(shù)分裂前期，以后隨著卵母細胞開始生長，卵泡細胞迅速增殖，由單層變?yōu)槎鄬?。在這些卵泡細胞，線粒體和粗面質(zhì)網(wǎng)豐富。卵泡細胞和卵母細胞伸出突起穿過透明帶互相聯(lián)系。到有腔卵泡時，卵泡細胞分為兩部分：一部分為壁層顆粒細胞，與基膜相連：另一部分為包圍卵母細胞的卵丘細胞。壁層顆粒細胞與卵丘細胞之間，卵丘細胞與卵丘細胞之間以與卵丘細胞與卵母細胞之間，存在著廣泛的縫隙連接。卵泡中的縫隙連接使壁層顆粒細胞、卵丘細胞和卵母細胞共同形成一個結(jié)構(gòu)和功能上

28、的合胞體1。處于成熟階段的卵母細胞，卵丘細胞通過大量充滿肌纖維蛋白的帶狀結(jié)構(gòu)緊密包裹著透明帶，保持卵母細胞和卵丘細胞之間縫隙聯(lián)系，進行離子交換和一些小的代物質(zhì)的交換。卵母細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)依賴卵丘細胞提供，兩者間通過縫隙連接進行信號傳導，進而調(diào)節(jié)卵母細胞的生長和成熟。裸卵僅能夠利用周圍介質(zhì)中的丙酮酸和三羧循環(huán)的中間產(chǎn)物，不能直接利用葡萄糖卵丘細胞可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，為卵母細胞的生長和發(fā)育提供能量。如果兩者間縫隙連接過早破壞，卵母細胞可能停止發(fā)育2。卵丘細胞合成的一些蛋白質(zhì)啟動和抑制卵母細胞生長和成熟。體外成熟過程中卵丘細胞的構(gòu)成蛋白和新生蛋白都有明顯改變，如果在培養(yǎng)過程中去除卵丘細胞將明顯

29、降低牛卵母細胞成熟、受精和胚胎發(fā)育能力3。總之，在卵母細胞成熟過程中，卵丘細胞對卵母細胞的發(fā)育是必需的。卵丘細胞與卵母細胞間的作用機制先前認為是一些生長因子如表皮生長因子（EFG）、胰島素樣生長因（IGF-1）通過卵丘細胞對卵母細胞行使促成熟影響，但目前證明生長因子對牛和鼠的裸卵也有促成熟作用，卵母細胞也存在IGF-1受體mRNA。因而卵丘細胞對卵母細胞成熟的啟動似乎并不起主導作用，應該只能認為是起加強或減弱的輔助作用。這可能是由于牛卵母細胞在體外大部分可自發(fā)恢復減數(shù)分裂并發(fā)育至成熟。盡管如此，據(jù)報道卵母細胞成熟過程中卵丘細胞對卵母細胞受精后至囊胚的發(fā)育是必不可少的。S.Hashimoto等人

30、報道培養(yǎng)液中，添加卵丘細胞(1.6×106個mL)可以促進牛有完整放射冠的卵母細胞的發(fā)育，但在培養(yǎng)液中，添加與COCs中卵丘細胞濃度一樣的卵丘細胞數(shù)（4.2×106個mL）對于裸卵的發(fā)育無作用，1.63.2×106個卵丘細胞mL對于帶有完整縫隙連接的卵母細胞的體外成熟效果最好?？梢娐亚鸺毎怯绊懧涯讣毎w外成熟的重要因素之一。3.2卵丘擴展對卵母細胞體外成熟的影響在卵母細胞成熟過程中，卵丘細胞也隨之成熟而充分擴展，從而中斷了卵丘細胞之間以與卵丘細胞與卵母細胞之間的緊密連接狀態(tài)，進而疏通了這些細胞之間營養(yǎng)物質(zhì)交換的通道。卵母細胞也可能通過分泌特殊因子或通過促卵泡素（

31、FSH）和EGF刺激卵丘透明質(zhì)酸酶的合成，調(diào)節(jié)卵丘擴散，從而解除卵丘-卵母細胞的異源連接，促使減數(shù)分裂恢復。卵丘細胞是否成熟是卵母細胞成熟的重要標志，只有兩者均成熟時，精子才能有效地穿透卵子并進而發(fā)生卵裂10。卵丘擴展常用作判斷卵母細胞體外成熟的特征，Hunter和Moor根據(jù)卵丘細胞擴展情況制定了牛卵母細胞體外成熟的判斷標準：1級成熟卵為“卵丘細胞完全擴展”；卵丘細胞團至少擴展-倍于裸卵直徑（300µm）；,級成熟卵為“卵丘細胞中等擴展”，卵丘細胞向外擴展約,倍于裸卵直徑（200µm）；-級成熟卵為“卵丘細胞輕度擴展”，卵丘細胞仍緊緊地粘貼在透明帶上。一般絕大多數(shù)的1級成

32、熟卵和多數(shù)的2,級成熟卵均已達到成熟狀態(tài)，排出第一極體.卵丘擴展與卵母細胞成熟之間的關系很復雜。在小鼠，去除卵母細胞的COCs即使在含有FSH的培養(yǎng)液中卵丘也不能擴展，說明卵丘擴展依賴于卵母細胞；但是如果在小鼠的COCs培養(yǎng)基中加入硫酸胺G和肝素，雖能抑制FSH或EGF誘導的卵丘擴展，但對卵母細胞成熟卻無影響，說明卵母細胞成熟不一定依賴于卵丘擴展。興參等實驗中卵丘擴展良好或不好對卵母細胞核成熟沒有明顯的影響，得出豬卵丘細胞擴展不依賴于卵母細胞4。在體卵丘擴展可促進精子獲能，保證正常受精和合子發(fā)育。但最近的報道對=>:過程中卵丘擴展在支持胚胎發(fā)育上提出質(zhì)疑。卵丘擴展對牛卵母細胞體外成熟不是

33、必需的。卵丘擴展對卵母細胞核成熟沒有明顯影響。至少與細胞質(zhì)進一步成熟無直接關系。因此，需要進一步研究來確定卵丘擴展與卵母細胞成熟是否有關系.3.3卵丘細胞層數(shù)對卵母細胞體外成熟的影響卵母細胞周圍的卵丘細胞層數(shù)是影響卵母細胞成熟的重要因素。不同的研究者對卵母細胞的分類不盡一致。目前的研究中，回收的大部分卵母細胞都有完整的卵丘細胞包圍（致密或分散）。卵丘細胞的形態(tài)不依賴于供體的類型，擁有完整多層并且擴散的卵丘細胞的卵母細胞的比例最大（39.346），其次是帶有致密多層的卵丘細胞的卵母細胞（26.928），裸卵的比例小于7。這些結(jié)果與Abdoon的報道一致，他也發(fā)現(xiàn)大部分的卵母細胞有5層或更多層的卵

34、丘細胞，并且具有均勻致密的卵質(zhì)。H.Tomer實驗結(jié)果得出，具有多層的卵丘細胞（致密或分散）的卵母細胞55以上到達染色質(zhì)結(jié)構(gòu)雙線期，具有體外發(fā)育完全的最大潛力。榮鳳等實驗，以皮層顆粒（CG）單層分布于質(zhì)膜下做為卵母細胞質(zhì)成熟的指標，分別于成熟培養(yǎng)前后觀察各類卵子的CG分布情況。結(jié)果證實裸卵成熟培養(yǎng)后CG完全消失或卵子本身形態(tài)出現(xiàn)異常?？梢姡懵咽且活惿形闯墒旒蹿呌谕嘶穆炎?，不能正常受精與進一步發(fā)育。卵丘細胞已擴散成蜘蛛網(wǎng)狀的卵子成熟培養(yǎng)前后的質(zhì)成熟率均顯著高于多卵丘細胞和少卵丘細胞卵，而其受精后的發(fā)育潛力（囊胚發(fā)育率3.40）卻明顯不與后兩者（囊胚發(fā)育率28.70和23.10）。結(jié)果還表明，

35、卵泡直徑與卵丘細胞多少具有相關性，卵泡越大，多卵丘細胞卵所占的比率越高11。綜上所述，在卵母細胞體外成熟過程中，卵丘細胞發(fā)揮著至關重要的作用。體外成熟培養(yǎng)時，需選擇從直徑大于2mm卵泡吸出的卵丘細胞致密的多卵丘細胞卵進行培養(yǎng)。盡管目前卵丘擴展程度可作為卵母細胞成熟的標志之一，但卵丘擴展對卵母細胞體外成熟不是必需的。對于卵丘細胞與卵母細胞聯(lián)系的在機制仍需進一步研究。3.4 去除卵丘細胞的卵母細胞在體外成熟過程中的超微結(jié)構(gòu)變化去除卵丘細胞會降低小鼠卵母細胞的成熟質(zhì)量。利用透射電子顯微鏡技術觀察去卵丘細胞的小鼠卵母細胞體外成熟過程中的超微結(jié)構(gòu)變化，目的是在亞細胞水平上尋找由于卵丘細胞的去除而導致卵母

36、細胞質(zhì)量降低的原因。(1) 去除卵丘細胞的小鼠卵母細胞在體外成熟過程中微絨毛由細長到短粗，由倒伏到直立均與卵丘卵母細胞復合體成熟過程中微絨毛變化規(guī)律相符。(2) 去除卵丘細胞的小鼠卵母細胞在體外成熟過程中線粒體由簇狀分布逐漸變?yōu)樯⒉加诼奄|(zhì)，該過程與卵丘卵母細胞復合體成熟過程中線粒體變化規(guī)律相符。(3) 去除卵丘細胞的小鼠卵母細胞在體外成熟過程中，皮質(zhì)顆粒可能存在繼發(fā)性生成障礙或者數(shù)量異常，該結(jié)果可能是去除卵丘細胞的小鼠卵母細胞存在體外受精障礙的原因之一。第二部分 課程設計部分卵丘細胞對豬卵母細胞體外成熟的影響獲取高質(zhì)量的體外成熟卵母細胞是成功進行人類體外受精、動物胚胎生產(chǎn)和克隆的關鍵。盡管動物

37、卵母細胞能夠在體外自發(fā)完成細胞核成熟，但卵母細胞成熟質(zhì)量遠不如體成熟卵母細胞，其受精后胚胎發(fā)育能力較差。目前認為，這可能是由于體外成熟的卵母細胞胞質(zhì)成熟不充分造成的。研究表明，卵母細胞體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)與受精率和囊胚發(fā)育率有強相關性。所以，繼續(xù)深入認識卵母細胞的成熟規(guī)律、改善體外成熟培養(yǎng)環(huán)境、建立一種完善的卵母細胞體外成熟系統(tǒng)是當前胚胎工程研究的重要容之一。盡管研究證明，卵泡細胞在卵母細胞胞質(zhì)成熟過程中起到了重要的作用，但對于不同類型細胞發(fā)揮的具體作用以與作用機制的理解還比較匱乏。本研究主要目的有兩點：第一，深入探討卵丘細胞支持卵母細胞胞質(zhì)成熟的作用機制；第二，通過改善體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)，最大限度

38、的提高裸卵的體外成熟與發(fā)育能力，為生發(fā)泡移植和GV期卵母細胞冷凍保存等技術提供有效的裸卵成熟方法。因此，本研究通過對機械裸卵和COCs進行體外成熟，經(jīng)體外培養(yǎng)而探討卵丘細胞存在和不同形態(tài)卵丘細胞對卵母細胞體外成熟與孤雌發(fā)育能力的影響。1.試驗材料1.1 卵巢豬卵巢采集自省市海濱區(qū)新店子屠宰場。豬宰殺剖腹后，立即無菌剪下卵巢，挑選黃體期和紅體較少，卵泡直徑約35 mm、大小均勻的卵巢，使用37的PBS緩沖液沖洗干凈，置于37的PBS緩沖液4h帶回實驗室。1.2 試驗用的儀器儀器廠商型號體式顯微鏡日本NikonSMZ熒光顯微鏡日本NikonE600全自動高壓消毒鍋日本YamatoSM-51CO2培

39、養(yǎng)箱美國 BINDER低溫臺式高速離心機德國 Eppendorf自動數(shù)字天平ADEK-120A液氮罐Taylar-Wharton1.3試驗藥品藥品廠商TCM199GIBCOHepesSIGMAFCSSIGMAFSH市激素制品LH市激素制品PFF自制青霉素美羅大藥廠鏈霉素美羅大藥廠蔗糖生物優(yōu)先公司GlySIGMADMSOSIGMA0.25ml細管耀北生物技術公司四孔板耀北生物技術公司2.方法2.1豬卵丘-卵母細胞復合體(COCs)的收集從屠宰場收集卵巢后，放入35雙抗生理鹽水中，用保溫瓶在3h 運到實驗室，去除血污。然后用帶有18G針頭的一次性注射器，抽吸直徑2 10 mm卵泡中的卵泡液。吸卵液

40、為TCM199+25 mmol/L HEPES+10g/mL肝素+4.0 g/L BSA。吸出液收集在35 mm一次性培養(yǎng)皿中，靜置510 min后，在實體顯微鏡下挑選形態(tài)與顏色正常的、細胞質(zhì)均勻的卵母細胞。2.2 豬卵母細胞的分級收集的未成熟豬卵母細胞以卵丘細胞層數(shù)為準分為三級：A級：卵丘細胞在3層或3層以上。B級：卵丘細胞為12層；或卵丘細胞雖在3層或3層以上，但是不完整，部分為12層。C級：裸卵或卵丘細胞雖為12層或多層，但是不完整，部分裸露。2.3卵母細胞的成熟培養(yǎng)卵母細胞采用微滴培養(yǎng)法.檢出的COCS用含體積分數(shù)為5%胎牛血清的DPBS洗滌3次，然后用成熟培養(yǎng)液洗滌3次，最后按實驗設

41、計分別移入含有成熟培養(yǎng)液滴的直徑35mm培養(yǎng)皿中。每個液滴50L并覆蓋石蠟油，每滴放COCs1015枚。液滴預先在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡2h以上。成熟培養(yǎng)條件39,5%的CO2與飽和濕度，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2224 h。成熟培養(yǎng)液為見試驗設計。2.4各組卵母細胞的成熟觀察成熟24 h時，將各組卵丘一卵母細胞復合體移入含O25透明質(zhì)酸酶的M199(Sigma，M4530)中，移液槍輕輕吹打移除卵丘細胞，體視鏡下用玻璃針撥動卵母細胞檢查第一極體排出的情況(第一極體排出作為卵母細胞成熟的標志)，并記錄各組成熟卵母細胞數(shù)與成熟率。3. 設計3.1 去除卵丘細胞對豬卵母細胞成熟的影響先將包裹3層以上卵丘

42、細胞且包裹緊密的COCs隨機分為2組：A組, COCs經(jīng)機械吹打脫除卵丘細胞成為機械裸卵(Dos)，B組, 包裹卵丘細胞3層以上的且包裹緊密的卵丘一卵母細胞復合體記為(COCs)，各自單獨培養(yǎng)。 3.2卵丘細胞層數(shù)對豬卵母細胞體外成熟的影響根據(jù)包裹卵母細胞的卵丘細胞的完整性分為3組:A組，有3層以上卵丘細胞緊密包圍的卵母細胞復合體記為(COCs)；B組，有3層卵丘細胞包圍的卵母細胞記為(COCs)；C組，有12層卵丘細胞包圍的裸露卵母細胞記為(NOs)，3組分別放于一樣且適宜條件下培養(yǎng)。探索卵丘細胞層數(shù)的多少對豬卵母細胞成熟的影響的大小。4.分析與總結(jié)4.1去除卵丘細胞對豬卵母細胞成熟的影響本

43、研究中將包裹5層以上卵丘細胞的COCs經(jīng)機械脫除卵丘細胞層后，其體外成熟與孤雌胚胎發(fā)育能力顯著低于正常的COCs，這與Geshi等試驗結(jié)果類同。這可能是因為在卵母細胞成熟過程中，卵丘細胞通過與卵母細胞間的緊密縫隙連接為卵母細胞的成熟發(fā)育提供物質(zhì)和能量，促進卵母細胞發(fā)育成熟。Antezak等和Goud等提出卵泡液和卵丘細胞層可儲存和釋放某些生長因子和特定蛋白，這些因子和蛋白在卵母細胞的成熟與胚胎發(fā)育過程中按一定順序或選擇性地發(fā)揮調(diào)節(jié)胚胎生長發(fā)育的作護包裹在卵母細胞外的卵丘細胞層，以提高卵母細胞的體外成熟與后期胚胎發(fā)育的潛力。4.2 卵丘細胞層數(shù)對豬卵母細胞體外成熟的影響卵母細胞周圍的卵丘細胞層數(shù)

44、是影響卵母細胞成熟與后期胚胎發(fā)育的重要因素?？岬雀鶕?jù)卵母細胞周圍卵丘細胞層數(shù)對綿羊進行分類成熟培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)卵丘細胞包裹3層以上和包裹1-3層疏松卵丘細胞的卵母細胞成熟率分別為824和806，其試驗結(jié)果與本試驗卵母細胞體外成熟結(jié)果基本一致，這在一定程度上說明卵丘細胞層包裹程度對卵母細胞體外成熟后體外成熟率并沒有顯著的影響。不同類型COCs的孤雌胚胎發(fā)育能力卻不同，這可能是包裹卵丘細胞較少的卵母細胞在體外成熟后已有老化的趨勢，卵裂后發(fā)育至囊胚的能力下降，但包裹3層以上卵丘細胞與附帶FSP的COCs在體外成熟后孤雌激活時正處于發(fā)育的較佳時期，能夠很好的發(fā)育至囊胚期。本研究結(jié)果表明，包裹卵母細胞的卵丘細胞層的存在與其層數(shù)對卵母細胞的體外成熟和孤雌激活后胚胎發(fā)育的能力具有重要作用。本設計重點研究了卵丘細胞在卵母細胞體外成熟過程中的作用，初步篩選了有卵丘細胞和無卵丘細胞兩種情況下，卵母細胞中差異表達的基因，并且進一步研究卵丘細胞的不同形態(tài)對豬卵母細胞體外成熟的影響，為提高卵母細