第三章 層析技術(shù)

1、第三章第三章 層析技術(shù)層析技術(shù)Chromatography作作 者：王者：王 英英聯(lián)系電話聯(lián)系電話、概一、概 述述 層層析析（Chromatography）又稱為又稱為色色譜譜, ,它利用它利用混合物混合物中中各組分各組分的的物理、化物理、化學(xué)性質(zhì)學(xué)性質(zhì)間的間的差異差異( (溶解度、分子極性、溶解度、分子極性、分子大小、分子形狀、吸附力、分子親分子大小、分子形狀、吸附力、分子親和力等和力等) ) ，使，使各組分各組分在在支持物支持物上集中上集中分分布在不同區(qū)域布在不同區(qū)域，借此，借此將各組分分離將各組分分離。 1、分配系數(shù)、分配系數(shù)(Partition chromat

2、ography) 混合物混合物在在層析層析過程中不管層析技術(shù)采過程中不管層析技術(shù)采用的用的流動(dòng)相流動(dòng)相和和固定相固定相是哪種狀態(tài)都要達(dá)到是哪種狀態(tài)都要達(dá)到分配平衡分配平衡。敘述一種物質(zhì)在兩種特定的相。敘述一種物質(zhì)在兩種特定的相中的分配程度用中的分配程度用分配系數(shù)分配系數(shù)（K）來表示。在）來表示。在特定溫度特定溫度時(shí)這個(gè)系數(shù)是一個(gè)時(shí)這個(gè)系數(shù)是一個(gè)常數(shù)常數(shù)。溶質(zhì)在固定相中的濃度溶質(zhì)在固定相中的濃度Cs K= = 溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度 Cm 從一個(gè)混合物中從一個(gè)混合物中分離分離、純化樣品的純、純化樣品的純度如何，取決于混合物中各組分度如何，取決于混合物中各組分K值的差異值的差異程

3、度。程度。 混合物混合物中各組分若中各組分若 K值相差較大值相差較大, 則則較較易易把混合物中的各把混合物中的各樣品樣品分離分離。反之。反之,K值相值相差較小差較小,則則不易分離不易分離。 2、塔板理論塔板理論 在層析在層析分析過程分析過程把把層析柱層析柱劃分劃分(想象想象)為為若干個(gè)若干個(gè)連續(xù)部分連續(xù)部分,每個(gè)部分稱為一個(gè)每個(gè)部分稱為一個(gè)塔板塔板。 理論板數(shù)理論板數(shù)(n)：在層析柱上，溶劑連續(xù)不：在層析柱上，溶劑連續(xù)不斷加入，化合物在流動(dòng)相和固定相中不斷斷加入，化合物在流動(dòng)相和固定相中不斷分分配平衡配平衡，所發(fā)生的，所發(fā)生的平衡次數(shù)平衡次數(shù)稱為稱為理論板理論板數(shù)數(shù)。色譜歷史色譜歷史古羅馬人分

4、析混合染料（類似輻射紙色譜）古羅馬人分析混合染料（類似輻射紙色譜）1903年，年，Michael Tswett提出色譜法提出色譜法1931年，年，Kuhn采用柱色譜分離了類胡蘿卜素采用柱色譜分離了類胡蘿卜素1941年，年，Martin和和Synge提出分配色譜法提出分配色譜法 1944年，年，Martin等又提出紙色譜法等又提出紙色譜法 1952年，年，Martin和和James發(fā)明了氣液色譜法發(fā)明了氣液色譜法1955年，第一臺(tái)商品氣相色譜問世，標(biāo)志著現(xiàn)年，第一臺(tái)商品氣相色譜問世，標(biāo)志著現(xiàn)代色譜分析的建立代色譜分析的建立1956年，年，Stahl系統(tǒng)研究了薄層色譜法系統(tǒng)研究了薄層色譜法(TLC

5、)1958年，年，Stein和和Moore研制出氨基酸分析儀，研制出氨基酸分析儀，確定了核糖核酸的分子結(jié)構(gòu)確定了核糖核酸的分子結(jié)構(gòu)1967年，年，Horvvath和和Huber等研制了高效液等研制了高效液相 色 譜相 色 譜 ( h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d chromatography,HPLC)儀儀1975年，年，Small等提出離子色譜等提出離子色譜 20世紀(jì)世紀(jì)80年代，超臨界色譜年代，超臨界色譜20世紀(jì)世紀(jì)90年代，毛細(xì)管電泳（年代，毛細(xì)管電泳（1809年年Ress第一次電泳實(shí)驗(yàn)）第一次電泳實(shí)驗(yàn)）21世紀(jì)，聯(lián)用技術(shù)、大分子色譜

6、分離、制備世紀(jì)，聯(lián)用技術(shù)、大分子色譜分離、制備色譜可望取得更大的發(fā)展色譜可望取得更大的發(fā)展 層析法層析法進(jìn)行時(shí)有進(jìn)行時(shí)有兩個(gè)相兩個(gè)相組成，一組成，一個(gè)為個(gè)為固定相固定相(Stationary phase )，另一個(gè)，另一個(gè)為為流動(dòng)相流動(dòng)相(Mobile phase )。由于。由于各組分各組分所受的在所受的在固定相的阻力固定相的阻力和和流動(dòng)相的推流動(dòng)相的推力力影響影響不同不同，各組分，各組分移動(dòng)速度移動(dòng)速度也也各異各異，從而從而使各組分得到分離使各組分得到分離。二、層析的一般原理二、層析的一般原理三、層析技術(shù)的分類三、層析技術(shù)的分類 ( (一一) )按兩相所處的按兩相所處的物態(tài)物態(tài)分類分類 以以

7、液體液體作為作為流動(dòng)相流動(dòng)相的稱為的稱為液相層析液相層析 以以氣體氣體作為作為流動(dòng)相流動(dòng)相的稱為的稱為氣相層析氣相層析 其其固定相固定相也可有也可有兩種狀態(tài)兩種狀態(tài): 以以固體固體作為作為吸附劑吸附劑的固定相的固定相 以以涂布涂布在在固體表面固體表面的的液體液體作為固定相作為固定相（二）按固定相形式分類（二）按固定相形式分類 1、柱層析、柱層析（colum chromatography） 將固定相裝在層析柱中將固定相裝在層析柱中 2、紙層析紙層析（paper chrmatography） 紙作為固定相紙作為固定相 3、薄層層析薄層層析（thinlayperchromatography） 將吸附

8、劑在玻璃板或其他材料薄板上鋪成將吸附劑在玻璃板或其他材料薄板上鋪成薄層作為固定相薄層作為固定相（三）按層析過程的機(jī)制可分類（三）按層析過程的機(jī)制可分類 1、吸附層析、吸附層析(adsorption chromatography ) 利用不同組分利用不同組分吸附能力吸附能力的不同進(jìn)行分離的不同進(jìn)行分離 2、分配層析、分配層析(partition chromatography ) 利用不同組利用不同組分配系數(shù)分配系數(shù)不同進(jìn)行分離不同進(jìn)行分離 3、離子交換層析、離子交換層析（ion-exchange chromatography ） 利用離子交換劑與各組分之間的利用離子交換劑與各組分之間的靜電力靜電

9、力不同不同 4、凝膠層析、凝膠層析（gel chromatography） 利用不同組分之間利用不同組分之間分子大小分子大小不同進(jìn)行分離不同進(jìn)行分離 5、親和層析、親和層析（affinity chromatography） 利用生物大分子之間利用生物大分子之間特有親和力特有親和力的不同進(jìn)行分離的不同進(jìn)行分離 第一節(jié)第一節(jié) 凝凝 膠膠 層層 析析 Gel Chromatography一、概一、概 念：念： 凝膠層析凝膠層析：按照被分離：按照被分離物質(zhì)分子大小物質(zhì)分子大小,經(jīng)經(jīng)過具有一定孔徑的過具有一定孔徑的多孔凝膠物質(zhì)多孔凝膠物質(zhì)進(jìn)行分離的進(jìn)行分離的一種方法。又稱為一種方法。又稱為凝膠過濾凝膠過

10、濾或或分子篩過濾分子篩過濾或或排阻層析排阻層析。 主要機(jī)理是主要機(jī)理是分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng),當(dāng)被分離當(dāng)被分離物質(zhì)物質(zhì)流流經(jīng)經(jīng)凝膠柱凝膠柱時(shí)時(shí),因各組份的因各組份的分子大小不同分子大小不同,在凝膠在凝膠受到的受到的阻滯阻滯作用作用有差異有差異,從而造成各組分在從而造成各組分在凝凝膠柱膠柱中的中的遷移速度不同遷移速度不同得到分離。得到分離。 將將樣品樣品加入凝膠柱后加入凝膠柱后,分子大分子大的組份的組份不能不能進(jìn)入凝膠中進(jìn)入凝膠中被排阻在外被排阻在外,而而分子的小能通過孔分子的小能通過孔隙進(jìn)入凝膠中隙進(jìn)入凝膠中。加入。加入洗脫劑洗脫劑后后,大分子大分子就隨洗就隨洗脫劑從脫劑從凝膠顆粒間隙凝膠顆粒間

11、隙洗脫下來洗脫下來,其其流程短流速流程短流速快快,而而小分子小分子物質(zhì)從物質(zhì)從上一層凝膠孔隙中出來又上一層凝膠孔隙中出來又?jǐn)U散到下一層凝膠孔隙中擴(kuò)散到下一層凝膠孔隙中,這樣多次反復(fù)這樣多次反復(fù)即即流流程長(zhǎng)程長(zhǎng),故大分子物質(zhì)先從柱中流出故大分子物質(zhì)先從柱中流出,小分子物質(zhì)小分子物質(zhì)后流出而得到分離。后流出而得到分離。二、基本原理二、基本原理 大分子大分子不能進(jìn)不能進(jìn)入凝膠孔隙中入凝膠孔隙中,被排被排阻在外阻在外,受到受到阻力小阻力小,流程短流程短，流速快流速快，先先從柱中流出。從柱中流出。 小分子小分子進(jìn)入凝進(jìn)入凝膠孔隙中膠孔隙中,阻力大阻力大，流程長(zhǎng)流程長(zhǎng)，流速慢流速慢，后后從中柱流出從中柱流

12、出 。 三、凝膠層析的數(shù)理關(guān)系三、凝膠層析的數(shù)理關(guān)系 1、柱床體積、柱床體積(VT) ：即凝膠顆粒的體積以：即凝膠顆粒的體積以及外部間隙體積的總和。及外部間隙體積的總和。 2、洗脫體積（、洗脫體積（Ve）：即欲分離物質(zhì)被洗脫：即欲分離物質(zhì)被洗脫下來所需的洗脫液的體積。下來所需的洗脫液的體積。 3、外水體積（、外水體積（V0）：即凝膠顆粒間隙水的：即凝膠顆粒間隙水的體積，相應(yīng)于流動(dòng)相的體積。體積，相應(yīng)于流動(dòng)相的體積。 4、 內(nèi)水體積（內(nèi)水體積（）：即凝膠顆粒內(nèi)所含）：即凝膠顆粒內(nèi)所含水的體積，它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量水的體積，它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量求得。求得。 5、凝膠顆粒干體積（

13、、凝膠顆粒干體積（）+ 洗脫體積（）與及之間的關(guān)系洗脫體積（）與及之間的關(guān)系 （）（） 為分子量不同的樣品組分在凝膠為分子量不同的樣品組分在凝膠內(nèi)部和外部?jī)上嚅g的分配系數(shù)。內(nèi)部和外部?jī)上嚅g的分配系數(shù)。 它與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆粒它與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮∮嘘P(guān)，而與柱的長(zhǎng)短粗細(xì)等物孔隙的大小有關(guān)，而與柱的長(zhǎng)短粗細(xì)等物理?xiàng)l件無關(guān)。理?xiàng)l件無關(guān)。 Kd = 0時(shí)時(shí),Ve = Vo,意味著該分子完全意味著該分子完全被排阻于凝膠顆粒之外被排阻于凝膠顆粒之外,在固定相分布為在固定相分布為0,全部分布于流動(dòng)相里而最先流出。全部分布于流動(dòng)相里而最先流出。 當(dāng)當(dāng)Kd = 1時(shí)時(shí),Ve =

14、 Vo + Vi,意味著該分子意味著該分子完全不被排阻完全不被排阻,可以自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)入凝膠顆可以自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部粒內(nèi)部,它能均等地分布在流動(dòng)相和固定相它能均等地分布在流動(dòng)相和固定相里里,在兩相分配的比值為在兩相分配的比值為1,而最后流出而最后流出. 當(dāng)當(dāng)0 Kd 4條件下使用條件下使用,具有羧甲基具有羧甲基 。 3、離子交換凝膠：、離子交換凝膠： 分離大分子物質(zhì)分離大分子物質(zhì) 葡聚糖（葡聚糖（Sephadex） 聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAG） 瓊脂糖（瓊脂糖（Sepharose）三、操作注意點(diǎn)三、操作注意點(diǎn)（一）離子交換劑的選擇（一）離子交換劑的選擇 原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇

15、對(duì)原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇對(duì)被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差異大的交被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差異大的交換劑，以保證通過離子交換層析后能得到換劑，以保證通過離子交換層析后能得到比較滿意的結(jié)果。比較滿意的結(jié)果?？紤]因素：考慮因素：1.被分離物質(zhì)帶何種電荷。被分離物質(zhì)帶何種電荷。2.被分離物質(zhì)分子的大小，大分子物質(zhì)選用被分離物質(zhì)分子的大小，大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素。凝膠，其次選用纖維素。3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境。被分離物質(zhì)所處的環(huán)境。4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)。被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)。5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量。被分離物質(zhì)的大概數(shù)量。 根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件 ：

16、 強(qiáng)酸強(qiáng)堿：強(qiáng)酸強(qiáng)堿： 應(yīng)用廣泛應(yīng)用廣泛 弱弱 酸酸 型：只能在堿性型：只能在堿性pH范圍內(nèi)使用范圍內(nèi)使用 弱弱 堿堿 型：只能在酸性型：只能在酸性pH范圍內(nèi)使用范圍內(nèi)使用 (三三) 洗脫劑洗脫劑 原則：所用洗脫液比樣品具有更活潑原則：所用洗脫液比樣品具有更活潑的離子或基團(tuán)。的離子或基團(tuán)。 改變改變pH或離子強(qiáng)度或離子強(qiáng)度 ：降低被分離物降低被分離物與離子交換劑的結(jié)合力。與離子交換劑的結(jié)合力。 洗脫方式：梯度洗脫洗脫方式：梯度洗脫（二）（二）緩沖液的選擇緩沖液的選擇 原則：不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所帶電荷原則：不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所帶電荷應(yīng)與樣品一致，避免使樣品變性應(yīng)與樣品一致，避免使樣品變性四、應(yīng)用

17、四、應(yīng)用 分離蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、分離蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核酸及其他小分子帶電的物質(zhì)核酸及其他小分子帶電的物質(zhì)第三節(jié)第三節(jié) 親親 和和 層層 析析Affinity Chromatography一、概念：一、概念： 親和層析是利用生物大分子之間親和層析是利用生物大分子之間特有的專一親和力而達(dá)到分離純化的特有的專一親和力而達(dá)到分離純化的層析方法。層析方法。二、親和層析原理二、親和層析原理 親和層析是利用親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的介質(zhì)偶聯(lián)親和配基的介質(zhì)為固定相親和吸附目為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相得到分離純化的液相層析法層析法 配基（配基（Ligan

18、d）: 親和層析中能被某一親和層析中能被某一生物大分子生物大分子識(shí)別和可逆結(jié)識(shí)別和可逆結(jié)合合的生物專一性物質(zhì)。的生物專一性物質(zhì)。 基質(zhì)基質(zhì) (Matrix)載體載體: 親和層析中與配基共親和層析中與配基共價(jià)結(jié)合價(jià)結(jié)合使其固相化使其固相化的物質(zhì)。的物質(zhì)。配基配基基質(zhì)（載體）基質(zhì)（載體）吸附 (Adsorption) 解吸(Elution )親和作用中的相互作用力親和作用中的相互作用力1、靜電作用、靜電作用2、氫鍵、氫鍵3、疏水性相互作用、疏水性相互作用4、配位鍵、配位鍵5、弱共價(jià)鍵、弱共價(jià)鍵親和作用體系親和作用體系特異性特異性親和體系親和體系高特異性高特異性酶酶- -底物、產(chǎn)物、抑制劑底物、產(chǎn)物

19、、抑制劑抗原抗原- -單克隆抗體單克隆抗體荷爾蒙荷爾蒙- -受體蛋白受體蛋白核酸核酸- -互補(bǔ)堿基鏈段互補(bǔ)堿基鏈段群特異性群特異性免疫球蛋白免疫球蛋白-A-A蛋白、蛋白、G G蛋白蛋白酶酶- -輔酶輔酶酶、蛋白質(zhì)酶、蛋白質(zhì)- -過渡金屬離子（過渡金屬離子（CuCu2+2+,Zn,Zn2+2+) )凝集素凝集素- -糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體三、載體的選擇三、載體的選擇 應(yīng)具備的特性：應(yīng)具備的特性： 1.有豐富的可供活化的化學(xué)基團(tuán)，并在溫有豐富的可供活化的化學(xué)基團(tuán)，并在溫 和條件下能與配基共價(jià)結(jié)合。和條件下能與配基共價(jià)結(jié)合。 2.惰性的，無非專一性吸附或足夠小。惰性的，無非

20、專一性吸附或足夠小。 3.多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 4.良好的機(jī)械性能，具有好的液體流動(dòng)性。良好的機(jī)械性能，具有好的液體流動(dòng)性。 5.有較好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。有較好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性?？晒┻x擇的載體可供選擇的載體 1、瓊脂糖、瓊脂糖 商品名：商品名：Sepharose 型型 號(hào)：號(hào)：2B，4B，6B 型號(hào)含義：瓊脂糖濃度為型號(hào)含義：瓊脂糖濃度為2%，4%，6% 特特 點(diǎn)：點(diǎn)： 親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，網(wǎng)孔大，親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，網(wǎng)孔大，非專一性吸附小，只能以濕態(tài)保存，經(jīng)不非專一性吸附小，只能以濕態(tài)保存，經(jīng)不起有機(jī)溶劑處理。起有機(jī)溶劑處理。2、聚丙烯酰胺凝膠、聚丙烯酰胺凝膠商品名：商品

21、名：Bio-Gel p型型 號(hào)：號(hào)：P-100至至-300型號(hào)含義：排阻限度，型號(hào)含義：排阻限度，X1000相當(dāng)于允許進(jìn)相當(dāng)于允許進(jìn)入凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)的最大分子量入凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)的最大分子量 特特 點(diǎn)：干膠，理化性質(zhì)穩(wěn)定點(diǎn)：干膠，理化性質(zhì)穩(wěn)定,抗微生物侵襲抗微生物侵襲能力較大能力較大,適用于配基和親和物之間親和力適用于配基和親和物之間親和力比較弱的系統(tǒng)比較弱的系統(tǒng),應(yīng)避免在應(yīng)避免在pH2-11以外的溶液以外的溶液中長(zhǎng)期使用中長(zhǎng)期使用.3、葡聚糖凝膠、葡聚糖凝膠商品名商品名:Sephadex型型 號(hào)號(hào):G-100,150,200型號(hào)含義型號(hào)含義:每克干凝膠吸水量每克干凝膠吸水量X10特點(diǎn)特點(diǎn):理化

22、性質(zhì)穩(wěn)定理化性質(zhì)穩(wěn)定,耐熱耐堿不耐酸耐熱耐堿不耐酸,網(wǎng)孔小網(wǎng)孔小 1、小分子物質(zhì)：輔酶、輔基、小分子物質(zhì)：輔酶、輔基 2、大分子物質(zhì)：酶、抗體、大分子物質(zhì)：酶、抗體 3、純化酶的配基、純化酶的配基: 底物、酶活性中心、抑制劑、輔酶等；底物、酶活性中心、抑制劑、輔酶等； 4、純化抗原抗體的配基：互為配基、純化抗原抗體的配基：互為配基 5、純化核酸的配基：、純化核酸的配基： DNA和和RNA，蛋白質(zhì)和，蛋白質(zhì)和mRNA常用的配基：常用的配基：四、配基的選擇四、配基的選擇 應(yīng)具備的特性：應(yīng)具備的特性： 1.對(duì)于欲純化的生物樣品具有專一親和性對(duì)于欲純化的生物樣品具有專一親和性 2.必須具備能被修飾的功

23、能基團(tuán)必須具備能被修飾的功能基團(tuán)五、配基的固相化五、配基的固相化 固相化技術(shù)：固相化技術(shù)： 將配基以共價(jià)鍵連接于不溶于水的將配基以共價(jià)鍵連接于不溶于水的固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑。固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑。 過過 程：活程：活 化化、接接 臂臂 插入劑插入劑或或手臂手臂使小分子配基適使小分子配基適當(dāng)?shù)碾x開載體骨架當(dāng)?shù)碾x開載體骨架,克服克服載體載體空間位阻空間位阻的的影響影響六、親和層析六、親和層析（一）裝柱和平衡（一）裝柱和平衡（二）上樣、親和吸附（二）上樣、親和吸附 （三）（三）洗脫洗脫 1、非特異性洗脫非特異性洗脫: 改變緩沖液的改變緩沖液的pH、離、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)子強(qiáng)度、介電常數(shù)或

24、溫度使或溫度使物質(zhì)構(gòu)象改變物質(zhì)構(gòu)象改變，濃濃縮縮、洗脫洗脫后后立即中和稀釋或透析，使蛋白質(zhì)迅立即中和稀釋或透析，使蛋白質(zhì)迅速恢復(fù)到天然結(jié)構(gòu)。速恢復(fù)到天然結(jié)構(gòu)。 2、特異性洗脫：利用生物學(xué)特異只洗脫特異性洗脫：利用生物學(xué)特異只洗脫和配基專一結(jié)合的樣品，不洗脫由于非專一吸和配基專一結(jié)合的樣品，不洗脫由于非專一吸附上去的雜蛋白。附上去的雜蛋白。（四）再生（四）再生 親和層析柱使用后可用大量洗脫劑連親和層析柱使用后可用大量洗脫劑連續(xù)洗滌，然后再用平衡緩沖液平衡，經(jīng)處續(xù)洗滌，然后再用平衡緩沖液平衡，經(jīng)處理后的層析柱能再次使用。理后的層析柱能再次使用。七、親和層析的應(yīng)用七、親和層析的應(yīng)用 1.抗原和抗體抗

25、原和抗體 2.生物素和親和素生物素和親和素 3.維生素、激素維生素、激素 4.激素和受體蛋白激素和受體蛋白 5.凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白 6.輔酶輔酶 7.多核苷酸和核酸多核苷酸和核酸 8.氨基酸氨基酸 9.染料配體染料配體 10.分離細(xì)胞、病毒分離細(xì)胞、病毒 11.金屬螯合色譜金屬螯合色譜 12.共價(jià)色譜共價(jià)色譜 1、純化過程簡(jiǎn)單、迅速。、純化過程簡(jiǎn)單、迅速。 2、分離效率高。、分離效率高。 3、實(shí)驗(yàn)條件溫和。、實(shí)驗(yàn)條件溫和。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)： 1、針對(duì)某一分離對(duì)象就需要制備、針對(duì)某一分離對(duì)象就需要制備專一的吸附劑和建立相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件。專一的吸附劑和建立相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件。 2、配基的選擇及其與基

26、質(zhì)的共價(jià)、配基的選擇及其與基質(zhì)的共價(jià)結(jié)合需要煩瑣的操作步驟。結(jié)合需要煩瑣的操作步驟。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：第四節(jié)第四節(jié) 高效液相色譜高效液相色譜 高效液相色譜高效液相色譜(HPLC)是以液體是以液體為流動(dòng)相在高壓設(shè)備作用下高效快為流動(dòng)相在高壓設(shè)備作用下高效快速分離樣品的色譜技術(shù)。速分離樣品的色譜技術(shù)。 按照固定相不同可分為：按照固定相不同可分為：1、液液分配色譜、液液分配色譜2、吸附色譜、吸附色譜(液固色譜液固色譜)3、離子交換色譜、離子交換色譜4、排阻色譜、排阻色譜(凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜)5、親和色譜、親和色譜6、平板色譜、平板色譜(薄層色譜薄層色譜)等等高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜的比較高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜的比較1、高壓：高壓輸液、高壓：高壓輸液 150300Kg/cm22、高速：流速快，、高速：流速快，0.110ml/min,分析速度極快，分析速度極快，只需數(shù)分鐘完成一次分析，而經(jīng)典方法完成一次只需數(shù)分鐘完成一次分析，而經(jīng)典方法完成一次分析需數(shù)小時(shí)以上。分析需數(shù)小時(shí)以上。3、高效、高效、高高分辨：分辨：500塔板塔板/m,柱效很高柱效很高,在數(shù)分鐘在數(shù)