【3】蛋白印跡技術(shù)(分子醫(yī)學(xué)實驗)

1、分子生物學(xué)實驗實驗報告實驗名稱： 蛋白印跡技術(shù) 姓 名： 陳 杰 學(xué) 號： 3140104666 序 號： 25 同組同學(xué)： 唐陳曦 帶教教師： 劉偉 俞萍 實驗日期： 2015年9月29日 目錄1.原理31.1 Westen印跡技術(shù)31.2 RT-PCR41.3 聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳（2D-PAGE）52.操作步驟52.1 安裝垂直板型電泳裝置52.2 凝膠的制備52.3 轉(zhuǎn)膜62.4 封閉62.5 一抗反應(yīng)62.6 洗滌72.7 二抗反應(yīng)72.8 洗膜72.9 檢測73.實驗結(jié)果83.1 照片記錄83.2 數(shù)據(jù)處理84.討論101.原理1.1 Westen印跡技術(shù)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)又稱免疫印

2、跡技術(shù)和Western印跡技術(shù)(Western blotting)，是鑒別蛋白質(zhì)的分子雜交技術(shù)。Western blotting的原理是將經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜、尼龍膜或PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)。且能保持電泳分離的蛋白質(zhì)的相對位置不變（轉(zhuǎn)膜裝置和預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量蛋白的轉(zhuǎn)膜結(jié)果見圖8-2-55-2-7）。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的未標(biāo)記的一抗起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的二抗反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色、化學(xué)發(fā)光或放射自顯影，可以檢測電泳分離的某種特定蛋白成分的存在和含量。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測某種蛋白的表達(dá)

3、水平。Western blotting實驗過程主要有以下幾個步驟：1、SDS-PAGE分離待檢測的蛋白質(zhì)；2、轉(zhuǎn)膜：將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上；3、封閉：即利用非反應(yīng)活性物質(zhì)封閉固相載體膜上未吸附結(jié)合蛋白質(zhì)的區(qū)域；4、抗體結(jié)合：即利用相應(yīng)蛋白質(zhì)的抗體（一抗）與待測蛋白質(zhì)進行免疫結(jié)合，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)；5、底物顯色或放射自顯影檢測電泳分離的特異性目的蛋白的存在與否和含量。Western blotting的轉(zhuǎn)膜方式以電轉(zhuǎn)移最為常用，固相載體主要有：硝酸纖維素薄膜、尼龍膜和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。硝酸纖維素薄膜結(jié)合蛋白的能力為100ugcm2，綜合性能較好，以往

4、使用的人較多；尼龍膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力較強(480ug/cm2)，有很高的靈敏度，但結(jié)合背景較高；PVDF-膜具有較好的結(jié)合蛋白質(zhì)的能力（200ug/cm2），且能較牢固地結(jié)合蛋白質(zhì)，該膜的機械性能和化學(xué)特性強，不易卷曲或撕裂，在90%甲醇的脫色條件下也不會影響膜的結(jié)構(gòu)，結(jié)合在膜上的蛋門質(zhì)可以直接進行序列分析，具有較好的染色和檢測的兼容性。常用的二抗標(biāo)記物有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）等，辣根過氧化物酶最敏感的底物是3，3-二氨基聯(lián)苯胺，它在過氧化物酶所在部位被反應(yīng)轉(zhuǎn)變成棕色沉淀。在鈷或鎳離子存在下進行反應(yīng)可以加深沉淀的顏色并提高反應(yīng)的靈敏度。但是，使用辣根過氧化物酶不可能完全排

5、除背景顏色，因此須十分小心地觀察生色反應(yīng)，一旦特異性染色蛋白帶清晰可見，就應(yīng)盡快終止生色反應(yīng)。堿性磷酸酶可催化底物5-溴-4-氯-3-引哚磷酸氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)在原位轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色化合物。這是利用二抗標(biāo)記物進行的顯色反應(yīng)是最早的Western blotting檢測方法，現(xiàn)在主要用于免疫組化，在顯微鏡下觀察。該方法的靈敏度相對較低，可以檢測ng水平的目標(biāo)蛋白。ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑是基于Luminol的新一代增強型化學(xué)發(fā)光底物試劑，它由辣根過氧化物酶(HRP)催化發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，發(fā)出熒光，結(jié)果可以通過X光片壓片和其他顯影技術(shù)展現(xiàn)，或使用Luminometer檢測。溶液A主要成分為Lumin

6、ol及特制發(fā)光增強劑，溶液B主要成分為H2O2及特殊穩(wěn)定劑。發(fā)光液A和B在HRP的催化作用下Luminol與H2O2反應(yīng)生成一種過氧化物，過氧化物不穩(wěn)定隨即分解，形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體，當(dāng)后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)，就會產(chǎn)生熒光。在激發(fā)過程中不需要消耗HRP，HRP只是起催化作用，所以只要HRP沒有降解失活，是可以重復(fù)加發(fā)光液進行觀察的。ECL化學(xué)發(fā)光檢測靈敏度高，可以檢測pg水平的目標(biāo)蛋白。抗原一抗生物素標(biāo)記的二抗ECL發(fā)光試劑Western blotting 示意圖1.2 RT-PCRRT-PCR是一種在轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因的方法。首先提取組織或細(xì)胞中的總RNA，然后以RNA（主要是mR

7、NA）為模板，以與RNA 3端互補的引物或Oligo-dT在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA的第一條鏈。然后以cDNA 3端互補的引物以及與RNA 3端互補的引物組成引物對進行PCR擴增，最后通過電泳來檢測是否產(chǎn)生PCR的擴增區(qū)帶，判別目的基因是否表達(dá)。為了避免由于RNA的降解而導(dǎo)致陰性的實驗結(jié)果，在進行RT-PCR時要設(shè)立一個內(nèi)參照（管家基因的表達(dá)），以避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。同時內(nèi)參照可以對基因表達(dá)的變化起到半定量的作用。RT-PCR技術(shù)靈敏性高，常用于檢測細(xì)胞中是否表達(dá)了某種RNA，是基因表達(dá)檢測的方法之一。1.3 聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳（2D-PAGE）利用蛋白質(zhì)的等電點和分子量的

8、差異，通過雙向凝膠電泳的方法將各種蛋白質(zhì)分離開。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合了等電聚焦技術(shù)和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的雙重優(yōu)點。第一向電泳是等電聚焦，在細(xì)管中進行，蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點不同進行分離。而后將凝膠從管中取出，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行第二向電泳。在第二向電泳過程中，蛋白質(zhì)依據(jù)其分子量大小進行分離。由于雙向電泳具有很高的分辨率，它可以直接從細(xì)胞提取液中檢測某個蛋白 。2-DE是目前唯一種可以僅通過一次操作解析上千種蛋白質(zhì)的技術(shù)，是蛋白質(zhì)組研究中最早的支撐技術(shù)之一。在2-DE中，蛋白質(zhì)首先根據(jù)等電點的不同在一向等電聚焦電泳中分離。接著被轉(zhuǎn)移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，再根據(jù)

9、相對分子質(zhì)量大小不同被分離。用適當(dāng)?shù)娜旧夹g(shù)顯示被分離的蛋白。2.操作步驟2.1 安裝垂直板型電泳裝置將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干。把玻璃板在灌膠支架上固定好。固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板。2.2 凝膠的制備1. 分離膠的制備：在一個干凈的小燒杯中，按下表所列的試劑用量配置。根據(jù)室溫來調(diào)節(jié)TEMED的加入量。 12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠配制用量表30%stock acrylamide（凝膠貯液）4.0mL3mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.8（分離膠緩沖液）1.25mL10% SDS0.1mLddH2O4.0mL10% Ammonium persulfate0

10、.07mL2% TEMED0.6mL將所配置的凝膠液沿著凝膠的長玻璃片的內(nèi)面用1000uL取液槍加至長、短玻璃片的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品槽模板下緣約1cm。沿玻璃片內(nèi)壁加一層異丙醇（用于隔絕空氣，使膠面平整）。凝膠配置過程要迅速，加速劑TEMED要在注膠前再加入，否則會提前凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。2. 濃縮膠的制備：在另一干凈的小燒杯中，按表配置濃縮膠，應(yīng)根據(jù)室溫來調(diào)節(jié)TEMED的加入量。混勻后用細(xì)長頭的滴管或1000uL取液槍將凝膠溶液加到已聚合的分離膠上方，直至加滿，輕輕將“梳子”插入濃縮膠內(nèi)（插入“梳子”的目的是使膠液聚合后，在凝膠頂部形成數(shù)個相互隔開的凹槽）

11、。約30 min后凝膠聚合，再放置30min。小心拔去“梳子”，用窄條濾紙吸去樣品凹槽內(nèi)多余的水分。4.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠配制用量表30%stock acrylamide（凝膠貯液）0.75mL3mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.8（分離膠緩沖液）0.83mL10% SDS0.1mLddH2O3.0mL10% Ammonium persulfate0.05mL2% TEMED0.3mL2.3 轉(zhuǎn)膜戴上手套，取下電泳好的凝膠轉(zhuǎn)移到一盤去離子水中略為漂洗一下，立即放在3張轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕的Whatman 3MM濾紙上，將電泳完畢的凝膠放放在濾紙上面。蓋上1張經(jīng)甲醛激活的PVD

12、F膜（用刀片切除多余的濾紙和濾膜，使其大小均與凝膠完全吻合）排除氣泡后，蓋上另3張同樣處理的濾紙，排除氣泡。按照順序：負(fù)極3層濾紙-凝膠-膜-3層濾紙-正極。用塑料夾夾緊后放入轉(zhuǎn)移電泳裝置，將電泳槽擱置冰上。90V電壓1h。取下膜放入培養(yǎng)皿中加入立春紅預(yù)染1min初步觀察轉(zhuǎn)膜結(jié)果TBST淋洗保存。(轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜晾干后可在4冰箱中保存1周。）2.4 封閉電泳結(jié)束后取下PVDF膜，用TBST淋洗后加入封閉液，室溫?fù)u床輕搖1-3h，2.5 一抗反應(yīng)取出PVDF膜，用TBST淋洗，放入含1：10000稀釋的一抗溶液中（用TBST稀釋）室溫至少1h或者4過夜。2.6 洗滌回收一抗放置4保存（必要時

13、加入疊氮鈉防霉）用l×TBST漂洗PVDF膜3次，每次10min2.7 二抗反應(yīng)PVDF膜放入1：3000倍稀釋的HRP標(biāo)記的第二抗體溶液中（用TBST稀釋），置溫室搖床1h。2.8 洗膜1×TBST洗滌3次，每次10min2.9 檢測將PVDF膜上加ECL化學(xué)發(fā)光液（A、B準(zhǔn)備0.5mL等量混合，可直接加在PVDF膜上），反應(yīng)5min后在化學(xué)發(fā)光檢測儀上觀察并記錄實驗結(jié)果。3.實驗結(jié)果3.1 照片記錄3.2數(shù)據(jù)處理最后加ECL化學(xué)發(fā)光液（這一步是老師操作，為節(jié)約時間三組一起進行），其中第一組是我們組的可以觀察到我們組（25號 26號）的二號框中，左側(cè)部分約為右側(cè)部分粗細(xì)的

14、1.5倍，與濃度比1.5：1相符合。4.討論根據(jù)實驗結(jié)果，可以看到一號框與二號框內(nèi)總體結(jié)果較好，條帶粗細(xì)的比例與加樣濃度比例相符，其中三號框（別的組的條帶）幾乎沒有條帶，分析應(yīng)該有這幾種可能性：1、一抗和二抗失效；2、一抗與二抗不匹配；3、ECL液失效；4、抗體染色不充分；5、被測樣品中不含有目的蛋白質(zhì)或者目的蛋白質(zhì)含量太低；6、溶液中有二抗標(biāo)記物的抑制劑；7、抗體活力降低；8、轉(zhuǎn)膜時未充分接觸。由于實驗的材料三號框他們組和我們組所用材料是一樣的，所以排除了可能性1、2、3，又由于在實驗二（本次是實驗三）中他們組沒有出問題，所以排除了可能性5，則根據(jù)具體情況，我想可能性7和8的概率更大，應(yīng)該是抗體拿出來之后離開冰浴時間太久。可以更換抗體重新再做一次，判斷實驗結(jié)果?；蛘咧苯硬蛔儣l件重新操作，看是否是因為轉(zhuǎn)膜的問題。而四號框的情況，明顯有氣泡，另外就是條帶特別粗，又連在了一起，我想可能是加樣量很多或者是發(fā)光液加的過多?？墒窃囈辉囉肞BST洗膜20min，期間換2次液。再看是否變正常一點。而為了避免有氣泡，玻璃板一定要洗干凈，用酒精洗干凈之后再用雙蒸水沖，再晾干。配膠的時候沿管壁緩緩加入各個成分，混勻的時候用手輕輕搖勻，如果用槍吹打時要緩慢且不要打到頭。同時配膠時混勻要輕，盡量不產(chǎn)生氣泡，上膠時要快，槍也不打到底。特別是槍打到底的時候非常容易產(chǎn)生氣泡。加完分離膠后用雙蒸水封，