土壤腐殖質(zhì)的提取、分離與純化綜述

1、土壤腐殖質(zhì)的提取、分離與純化綜述大車神摘要腐殖質(zhì)（humic substances; HS）是一類呈棕黑色或棕褐色、無定形、酸性、親水性、多分散的有機(jī)物質(zhì)，廣泛存在于土壤、水體(如河流、湖泊、海洋和地下水等)以及沉積物中，根據(jù)溶解性，腐殖質(zhì)可分為3類：腐殖酸(HA,又稱胡敏酸，只溶于堿不溶于酸)，富里酸(FA，又稱黃腐酸，既溶于酸又溶于堿)和胡敏素(Humin，又稱腐殖素、腐黑物，酸堿都不溶) 殖酸、富里酸廣泛存在于土壤、水體以及沉積物中，對有金屬離子、機(jī)污染物、及水處理過程中消毒副產(chǎn)物的形成有重要的影響。本文通過查閱文獻(xiàn)，總結(jié)目前學(xué)者對于腐殖酸的提取、分離與純化的相關(guān)技術(shù)進(jìn)行闡述?！娟P(guān)鍵詞】

2、腐殖酸、富里酸、胡敏酸、胡敏素、分離提純一、概述土壤是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ),是人類不可缺少、不可再生的自然資源1,2。土壤有機(jī)質(zhì)是土壤的重要組成部分,在土壤肥力、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面都具有重要作用。其主要成分包括有機(jī)質(zhì)及其他有機(jī)物，其中腐殖質(zhì)類物質(zhì)占有機(jī)質(zhì)總量的85%95%。腐殖質(zhì)（humic substances; HS）是一類呈棕黑色或棕褐色、無定形、酸性、親水性、多分散的有機(jī)物質(zhì)，廣泛存在于土壤、水體(如河流、湖泊、海洋和地下水等)以及沉積物中3。根據(jù)溶解性，腐殖質(zhì)可分為3類：腐殖酸(HA,又稱胡敏酸，只溶于堿不溶于酸)，富里酸(FA，又稱黃腐酸，既溶于酸又溶于堿)和胡敏素(

3、Humin，又稱腐殖素、腐黑物，酸堿都不溶)4,5，其中可提取腐殖質(zhì)(HA+ FA)組成復(fù)雜，存在氨基、羥基、醌基、羰基和甲氧基等多種基團(tuán)，能夠?qū)λw中各種機(jī)污染物和重金屬的遷移轉(zhuǎn)化進(jìn)行影響和控制6-8。富里酸( Fulvicacid，簡稱 FA)屬于腐植酸的一種，別名為黃腐殖酸，是土壤腐植質(zhì)的組成成分之一。顏色較淺，多呈黃色。主要由碳、氫、氧和氮等元素構(gòu)成，碳?xì)浔戎递^低，分子式為C14H12O89,10。溶解能力強(qiáng)，移動性大，對某些土壤的淋溶和沉積起很大作用，可以改善土壤環(huán)境。特性為低分子量和高生物活性。由于低分子量的特性，它能很好的粘貼及融合礦物質(zhì)和元素到它的分子結(jié)構(gòu)中，擁有很好的溶解性和

4、流動性。胡敏酸（Humic Acid，HA），由芳香核和脂肪族側(cè)鏈組成，含有羧基、羥基、酮基、醌基等活性官能團(tuán)，具有較大的吸附表面積 ，是存在于土壤環(huán)境中的一類重要的非均質(zhì)有機(jī)物。HA容易與有機(jī)污染物發(fā)生相互作用，影響環(huán)境中有機(jī)污染物的毒性、生物降解、遷移轉(zhuǎn)化。提取土壤中的HA，對分析HA理化性質(zhì) 和明確HA環(huán)境作用，具有重要的意義。研究表明，腐殖質(zhì)的主要元素有碳、氫、氧、氮、硫和磷。對于賦存于同一介質(zhì)中的腐殖酸，胡敏酸碳含量略高于富里酸，氧含量略低于富里酸，但元素組成沒有太大差別11。進(jìn)一步研究揭示腐殖質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與元素組成，是人類認(rèn)識世界的一部分。土壤的形成與有機(jī)質(zhì)腐殖化過程密切相關(guān)，巖石

5、經(jīng)過物理化學(xué)風(fēng)化后，風(fēng)化殘積物中的Fe、Al元素的溶解遷移與沉淀固定受腐殖質(zhì)的控制。腐殖質(zhì)在土壤中可呈游離的酸和鹽類狀態(tài)存在，但大部分呈凝膠狀與礦質(zhì)粘粒緊密 結(jié)合，成為重要的礦物膠體物質(zhì)，從而增加土壤團(tuán)粒的水穩(wěn)性和持水性。腐殖質(zhì)還可通過增加植物根部細(xì)胞膜的滲透性、激活土壤呼吸、促進(jìn)ATP的合成與三羧酸循環(huán)以及光和作用等途徑來增加作物的生產(chǎn)。腐殖質(zhì)能夠提高化肥的利用效率，同時減輕化肥對土壤理化性狀產(chǎn)生的不良影響12。因此，腐殖質(zhì)的研究對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和土地利用非常重要。腐殖質(zhì)與疏水有機(jī)污染物（HOC）的相互作用，能夠增加土壤中該類物質(zhì)的溶解性與遷移率，從而增加地下水被污染的風(fēng)險。分配系數(shù)(KOC)被用

6、來定量描述有機(jī)污染物在液相與固相時的分配行為。特定體系下某一污染物的分配系數(shù)大小與其正辛醇水分配系數(shù)（KOW）和體系固相有機(jī)質(zhì)含量相關(guān)。雖然分配模型已經(jīng)成功的解釋了一系列有機(jī)污染物在水土相的分配行為，但是很多污染物在不同來源的土壤樣品中分配系數(shù)存在顯著差異。這種差異可能是土壤有機(jī)質(zhì)不同和外在因素不同所致。Rutherford等13的研究發(fā)現(xiàn)對于官能團(tuán)含量不同的腐殖質(zhì)組分與有機(jī)污染物分配系數(shù)之間關(guān)系，值得做進(jìn)一步的研究。二、腐殖酸的提取與純化1.2. 1、腐殖酸的提?。河捎谌鄙贅?biāo)準(zhǔn)方法，在以往的研究中，土壤腐殖質(zhì)的提取方法各有不同，提取劑、提取液劑量、提取次數(shù)的選擇各有特點，使得研究的數(shù)據(jù)可比性

7、較低。為了使腐殖質(zhì)的研究數(shù)據(jù)更具可比性，國際腐殖質(zhì)協(xié)會提出了一個參考方法，其提取土壤胡敏酸、富里酸和胡敏素，具體操作可分為三步：前處理過程稱取100g土樣于2L燒杯中，加入配置好的1L 0.05mol/L的HCl，在25條件下間歇攪拌18-24h，然后離心過濾(轉(zhuǎn)速:5000rpm，10min)，除去上清液，將沉淀物用去離子水清洗，反復(fù)離心至中性或呈弱酸性。此步驟是為了去處土壤中易溶于酸的雜質(zhì)和Fe元素等，以減少對以后步驟的干擾。堿溶過程向土壤樣品中加入1L0.1mol/L 的NaOH溶液，在25條件下持續(xù)攪拌24h。然后離心過濾(轉(zhuǎn)速:15000rpm,15-20min)，這一過程至少進(jìn)行兩

8、次，以保證沉淀物與上浮物完全分離。此時HA和FA均溶于堿液中。殘渣主要為不溶于堿的腐黑物等。酸析過程棄去殘渣，將所有的上清液收集到一個潔凈的玻璃燒杯中。向燒杯中加入6mol/L 的HCl直至pH為1-2，此時HA由于不溶于酸，成絮狀沉淀。FA溶解于酸液中。靜置幾小時后離心(5000甲m,10min)分離,即可得到黑色的固態(tài)HA和亮橙色的FA酸溶液。這個方法被廣大研究學(xué)者普遍采用，通常稱為“稀堿法”3. 2、關(guān)于“稀堿”的選用研究：4.關(guān)于提堿性取劑NAOH的選用，有學(xué)者做過不同提取劑的提取效果的研究。堿性提取劑有NaON和KOH，絡(luò)合劑有堿性Na2P2O7和EDTA，有機(jī)提取劑有丙酮、二甲亞砜

9、（DMAO）等。其中利用NaOH溶液提取土壤腐殖質(zhì)是最古老、常用而有效的方法。Na+能夠取代腐殖質(zhì)的負(fù)電點位上的多價離子（如Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+）,以及高pH值促使腐殖質(zhì)的很多酸性官能團(tuán)解離,從而大大改變腐殖質(zhì)的溶解狀態(tài),同時多價金屬陽離子與OH-結(jié)合生成不溶氫氧化物沉淀而被除去14。Eloff等15比較了NaOH、丙酮、二氧雜環(huán)己烷等六種試劑提取效率表明，NaOH溶液從四種非洲細(xì)沙土中提取的腐殖質(zhì)含量是丙酮等有機(jī)試劑提取量的幾十倍， 是EDTA與硼酸混合液提取量的兩倍多.通過凝膠色譜研究表明，NaOH溶液提取的腐殖質(zhì)分子量最大，Na4P2O7提取物次之，偶極非質(zhì)子溶劑（DM

10、SO、DMF、acetone）提取的腐殖質(zhì)分子量最小，而且腐殖化程度較低。有研究還對比了NaOH與KOH的提取效率16，采用KOH溶液提取腐殖質(zhì)也能獲得較高的效率，可是KOH來源少，成本高，且離子半徑大，但其滲透能力較之低，因此在研究中運用很少見。3、提取劑用量：在國際腐殖質(zhì)協(xié)會推出參考方法之前，采用NaOH溶液浸提腐殖質(zhì)，其濃度沒有統(tǒng)一。2000年，Rosa等17的研究指出，不同堿液提取的腐殖質(zhì)量的大小順序為：0.1mol/L NaOH0.5mol/L NaOH1.0mol/L NaOH，且經(jīng)過240min后，腐殖質(zhì)提取量已經(jīng)達(dá)到最大值。馬連剛、肖保華18使用同樣的方法進(jìn)行驗證，得到不同的結(jié)

11、果，其模擬實驗結(jié)果為：等量堿液一次提取的有機(jī)質(zhì)量的大小順序為：0.1 mol/L NaOH，0.5 mol/L NaOH1.0 mol/L NaOH，且 0.1 mol/L NaOH溶液與土壤作用240min后，泥水混溶，無分層現(xiàn)象，經(jīng)過24h靜置，才出現(xiàn)薄層上清液。這可能與土壤性質(zhì)有關(guān)，Rosa等所用泥炭土的有機(jī)質(zhì)含量高，而后者所用的黃壤是一種高度脫硅富鋁土，其有機(jī)質(zhì)含量較低（約45），而鐵鋁含量高，在堿性條件下。能夠產(chǎn)生大量膠體分散于泥水混合體系中，有機(jī)無機(jī)膠體混合在一起難以分離。因此，從不同的土壤或沉積物中提取腐殖質(zhì)，NaOH的濃度還是一個必須考慮的因素。正如腐殖質(zhì)協(xié)會在申明中說的那樣，

12、0.1mol/L NaOH溶液并不適合所有研究對象。4、提取方法的優(yōu)化：盡管稀堿法被學(xué)者廣泛使用，但是這種方法仍存在HA、FA提取率低、提取費時等缺點。因此，有學(xué)者對于提取方法進(jìn)行了一些優(yōu)化。Vanessa19提出了微波輔助提取HA的方法，但微波提取的溫度為105 會使HA某些性質(zhì)發(fā)生改變。Mauro20用超聲輔助提取HA，指出超聲輔助提取的HA與IHSS推薦方法提取的HA理化性質(zhì)接近，但是Mauro沒有對提取的條件進(jìn)行優(yōu)化。王冕21等在提取土壤中HA時也是采用IHSS推薦方法，并發(fā)現(xiàn)HA提取量與土壤pH之間沒有線性關(guān)系，而與土壤的有機(jī)質(zhì)呈正比關(guān)系。譙華等22，對土壤中提取胡敏酸的方法進(jìn)行了優(yōu)

13、化，引入超聲作為胡敏酸提取的輔助條件，采用批次試驗優(yōu)化了土壤中胡敏酸的提取方法。結(jié)果表明，基于胡敏酸提取回收率和精密度，在室溫下獲得的優(yōu)化提取方法為：液土比為8:1、提取次數(shù)為3次、NaOH溶液濃度為0.05 mol/L、超聲功率為120 W、超聲時間為30 min；在此優(yōu)化條件下，胡敏酸的回收率為94.73%1.50%，顯著大于IHSS推薦方法的回收率64.76%0.28%5、腐殖質(zhì)的純化：首先先介紹HISS提供的方法：向HA的沉淀物中加入0.5L HF-HCI混合溶液(0.1M HCI+0.3M HF，HF-HCI混酸體系被認(rèn)為能顯著降低腐殖酸中硅雜質(zhì))，然后在25下振蕩24h。然后在50

14、00rpm下離心10min去除上清液。換液離心三次，從而使HA含有較少灰分殘留。將滲析袋裝入陽離子交換樹脂，在HA溶液中振蕩24h，達(dá)到去除HA中雜質(zhì)陽離子的目的。然后離心，撇去上清液，得到純化后的HA樣品，經(jīng)真空冷凍干燥后得到粉狀產(chǎn)物，在-57下低溫保存?zhèn)溆?。將含有FA的亮橙色溶液流經(jīng)填有XAD-8樹脂的吸附柱，使FA被吸附在樹脂上。柱內(nèi)徑1cm，下端填入少量脫脂棉,樹脂填充長度以10-15cm為宜，設(shè)置流速為1.5-2ml/min，為達(dá)到完全吸附，可串聯(lián)多根吸附柱，待流出的清液呈淡黃色即可。然后用去離子水洗滌樹脂柱至流出液呈中性或弱酸性。再用0.IM NaOH溶液從樹脂中對FA進(jìn)行洗提，洗

15、脫出的暗褐色物質(zhì)即為富里酸。然后將滲析袋裝入陽離子交換樹脂在FA堿溶液中振蕩24h。在經(jīng)過陽離子交換之后，再將FA在45下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。最后使用真空冷凍干燥，得到純化后的FA粉末，在-57下低溫保存?zhèn)溆?。在腐殖酸提取過程中，粘土礦物可能以膠體形式混入，從而增加灰分含量，為了降低灰分含量，透析之前，常用混合酸（HCL/HF）進(jìn)行處理，經(jīng)過兩次混合酸處理后，灰分含量可達(dá)到可接受水平23。由于干擾物質(zhì)的復(fù)雜性，至今還沒有一個可普遍接受的分析過程來純化腐殖酸。三、腐殖質(zhì)分組腐殖質(zhì)分組是在三種腐殖酸的提取基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)分，但是目前國內(nèi)研究學(xué)者對這一方面的研究還很少。純化去除了大量的雜質(zhì)，但是所

16、獲得物質(zhì)本身的性質(zhì)差異還很大。就分子量而論，腐殖質(zhì)組分本身的差異是非常巨大的，水體富里酸的平均分子量范圍在6002000，胡敏酸分子量稍大（15005000）24，源于土壤、沉積物的腐殖質(zhì)平均分子量較大，不均勻分布在幾百到幾十萬之間。據(jù)腐殖質(zhì)分子量大小差異將腐殖質(zhì)做進(jìn)一步的劃分也非常有意義，分子量大小不同，其很多性質(zhì)，諸如溶解度、吸附特性及絡(luò)合能力等可能也不相同。因此，為了獲得比較均質(zhì)的腐殖質(zhì)組分，在排除無機(jī)離子與非腐殖質(zhì)類有機(jī)質(zhì)的干擾之外，還需要對腐殖質(zhì)進(jìn)行更細(xì)致的分組。目前， 腐殖質(zhì)的分組分離并不意味著要得到純粹同質(zhì)的化合物， 而是要獲得某些物理化學(xué)屬性取值比較狹窄的混合物25。腐殖質(zhì)進(jìn)一

17、步分組的技術(shù)有沉淀、電泳、排阻色譜和超濾。但是一個獨特的、通用的分組方法仍然在探尋中，由于其對于現(xiàn)在國內(nèi)普遍研究現(xiàn)狀沒有太大的實用意義，就不再做單獨介紹了。四、總結(jié)兩百多年來，經(jīng)過研究者的不懈努力，對腐殖質(zhì)有一定的了解，由于其本身的復(fù)雜性，研究仍然存在有很多問題：腐殖質(zhì)是高分子混合物 還是超分子體系，研究者至今還沒有統(tǒng)一的看法；腐殖質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，盡管研究者提出各種各樣的理論模型，但如今仍然是一個謎；腐殖質(zhì)的提取方法難以統(tǒng)一，不同提取方法所獲得的物質(zhì)或多或少存在差異，使得研究數(shù)據(jù)可比性較低，據(jù)此得出的結(jié)論爭議性較大。要充分揭示腐殖質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)屬性，關(guān)鍵在于如何對不同來源的腐殖質(zhì)進(jìn)行有效提取

18、、純化與分組，使得研究對象盡量簡單而均一。現(xiàn)有的土壤腐殖質(zhì)分離提純方法，基于腐殖質(zhì)溶解特性的不同，只能將腐殖質(zhì)分為胡敏酸、 富里酸及胡敏素三類。然而，這三類物質(zhì)本身并不是均質(zhì)的高分子化合物，而是成分復(fù)雜的有機(jī)混合物。盡管這一分類方法簡化了腐殖質(zhì)的研究，但研究結(jié)果仍然是一個非常概括性的描述。要獲取更加精確的信息，需對三類物質(zhì)進(jìn)行再分組，特別是按照分子量對HA、FA進(jìn)行再分組，獲得分子量分布范圍比較狹窄的亞組。 目前，排阻色譜和超濾技術(shù)作為腐殖質(zhì)化學(xué)與物理分離的兩種代表性新技術(shù)，色譜分離測定精度高，而超濾具有操作簡便、分離量大和對分離物質(zhì)無破壞等優(yōu)點，在腐殖質(zhì)研究中，兩者的結(jié)合將有助于深化理解土壤

19、腐殖質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)。隨著膜技術(shù)的不斷發(fā)展，可將分子進(jìn)一步的分離，最終將會獲得成分均一的腐殖質(zhì) 。參考文獻(xiàn)：1張晉京,竇森,李翠蘭.土壤腐殖質(zhì)分組研究J.土 壤 通 報 ,2004,12(6):7067 0 9 .2Qualls RG,Haines BL.1991.Geochem-istry of dissolved organic nutrients inwater percolating through a forestecosystem.Soil Sci Soc Am J,55:11121123 .3趙勁松,張旭東,袁星,等.土壤溶解性有機(jī)質(zhì)的特性與環(huán)境意義J.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,200

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