純化水微生物方法學驗證方案(09年03月)

1、純化水微生物限度檢查方法驗證方案編碼：VP/QMV-T009-00頁碼： II /II該方案制定參與人：項目人員部門/崗位Dept./Position簽名Signature日期Date方案起草Prepared byQC/微生物檢測員 年 月 日 (Y) (M) (D)QA/驗證QA 年 月 日 (Y) (M) (D)方案審核Reviewed byQC/經(jīng)理 年 月 日 (Y) (M) (D)QA/經(jīng)理 年 月 日 (Y) (M) (D)方案批準Approved by受權人 年 月 日 (Y) (M) (D)頒發(fā)部門Issued byQC生效日期Effective Date 年 月 日 (Y)

2、(M) (D)分發(fā)部門Distributed to QC、QA制作備份：2份Copies prepared: 2 pcs目 錄1. 引言.012. 驗證小組及各部門職責.013. 檢驗依據(jù).014. 驗證準備.015. 操作方法.026. 結(jié)果判斷.047. 結(jié)果統(tǒng)計.048. 結(jié)果評定與結(jié)論.04附表1：設備確認記錄05附表2：試驗器材確認記錄05附表3：試驗用菌種確認記錄.06附表4：培養(yǎng)基確認記錄.06附表5：試劑確認記錄.07附表6：器皿確認記錄.07附表7：細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)計數(shù)驗證結(jié)果原始記錄.08純化水微生物限度檢查方法驗證方案編碼：VP/QMV-T009-00頁碼： 4/

3、81.1概述不同檢品、不同的儀器或材料等均可能對檢驗結(jié)果產(chǎn)生影響，當檢品有抑菌性時，會掩蓋檢品已受污染的事實或造成低于實際污染水平的檢測結(jié)果；選用不適當?shù)呐囵B(yǎng)基，其促生長能力不符合要求，也會造成類似的后果。為了使微生物限度檢驗方法的結(jié)果準確可靠，需要對檢品的具體檢驗方法進行驗證，以證明其對檢品的適用性。1.1OverviewDifferent samples, equipments and different materials ，as well as inappropriate media that the Growth-promoting capacity does not meet th

4、e requirements may have an impact on the test results, when the samples have antimicrobial activity,it will cover up the fact that inspected products have been contaminated or cause the pollution levels lower than the actual; To make the results of bioburden testing accurate and reliable，the methods

5、 need to be validated ，ensuring its applicability 1.2 目的建立純化水微生物限度檢查方法。1.2Objecive Establish the bioburden testing method for purified water.2. 驗證小組及各部門職責2. Verification team & Responsibilities of various departments2.1驗證小組1.負責驗證方案的審核；2.負責驗證的協(xié)調(diào)工作，以保證本驗證方案規(guī)定項目的順利實施。2.1 Responsibilities of Verific

6、ation team1. Review the verification program.2. Coordination of the validation work, to ensure the smooth implementation of projects2.2質(zhì)檢部1.負責驗證所需的標準品、樣品、試劑、試液等的準備；2.負責取樣及對樣品的驗證；3.負責驗證方案的起草；4.參與驗證過程中OOS的調(diào)查。2.2QC 1.Prepare the samples, reagents, test solution, Standards etc. required for the verifica

7、tion word, 2.3 設備動力部1.對儀器、儀表、量具等進行校正。2.4質(zhì)保部1.負責驗證過程監(jiān)控管理工作；2.參與驗證過程中OOS的調(diào)查。2.5 受權人1.批準驗證方案；2.負責批準放行驗證過程中出現(xiàn)的OOS。2.6驗證小組成員組 長：曹成龍組 員：鄭定、馬立如、周超、彭中華、彭艷妃、張淑珍、郭清2.7驗證時間安排時 間工作內(nèi)容2009.03.012009.03.03方案起草、審批2009.03.042009.03.09標準確認、檢驗方法確認2009.03.14完成報告3、檢驗依據(jù)中國藥典2005年版 “微生物限度檢查法”4、驗證準備4.1樣品名稱：純化水4.2實驗用培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂

8、培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（均由中國藥品生物制品檢定所提供）。4.3稀釋液、沖洗液：0.9%無菌氯化鈉溶液；pH7.0氯化鈉-蛋白胨溶液。4.4檢查所涉及的設備是否符合實驗要求，確認結(jié)果填寫在附表1儀器確認記錄中。設備應經(jīng)驗證,在校準有效期內(nèi)。4.5檢查所涉用試驗器材，確認結(jié)果填寫在附表2試驗器材確認記錄中，試驗器材應完整，潔凈，無破損，配件齊全。 4.6檢查所涉及的試驗用菌種是否符合實驗要求，確認結(jié)果填寫在附表3試驗用菌種確認記錄中。菌種形態(tài)特征應良好、菌種代數(shù)不得超過第五代。4.7檢查所涉及的培養(yǎng)基是否符合實驗要求，確認結(jié)果填寫在附表4培養(yǎng)基確認記錄。培養(yǎng)基應在有效期內(nèi)。4.8檢查所涉用試

9、劑是否符合實驗要求，確認結(jié)果填寫在附表5試劑確認記錄中。試劑級別為AR級，并應在有效期內(nèi)。4.9檢查所涉用器皿是否符合實驗要求。確認結(jié)果填寫在附表6器皿確認記錄中。一般玻璃器皿要求潔凈，無破損，量器要進行校正。4.10驗證用培養(yǎng)基、緩沖液、過濾器、剪刀、鑷子應至121濕熱滅菌30分鐘，驗證用平皿、刻度吸管應至200干熱2小時。5、操作方法5.1 菌液制備：取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌經(jīng)32.5±2.5培養(yǎng)1824小時的新鮮營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)物、白色念珠菌經(jīng)25.5±2.5培養(yǎng)2448小時新鮮改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)物，分別加入0.9%無菌氯化鈉溶液10ml洗下菌

10、苔轉(zhuǎn)移至空試管中作為菌懸液原液，與細菌濁度標準管進行比較，得原液估計濃度，再按比濁結(jié)果，用0.9%無菌氯化鈉溶液進行10倍梯度稀釋至濃度小于100cfu/ml。取黑曲霉菌經(jīng)25.5±2.5培養(yǎng)57天新鮮改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，加入0.9%無菌氯化鈉溶液10ml洗下孢子吸出，轉(zhuǎn)移至空試管中作為菌懸液原液，用0.9%無菌氯化鈉溶液進行10倍梯度稀釋至濃度小于100cfu/ml。5.2菌液計數(shù)：分別取上述3種細菌菌液1ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液作平行2皿。注入約45營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約18ml，于3035培養(yǎng)。分別取上述2種真菌菌液1ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入約45oC玫瑰紅

11、鈉瓊脂培養(yǎng)基約18ml，于2328培養(yǎng)。5.3取樣方法：按取水標準取原料廠區(qū)純化水站、制劑廠區(qū)純化水站、107車間純化各一個純化水點為代表做方法學驗證，連續(xù)做三天，具體取水方法如下表：取樣位置 原料廠區(qū)純化水站制劑廠區(qū)純化水站107車間純化水取樣點PWA-02總回水PWB-02總回水PWA-14總回水取樣時間2009年03月04日2009年03月06日取樣量 每個點每天取1瓶，100ml/瓶。5.4薄膜過濾：5.4.1試驗組：取2ml供試液和1ml驗證用菌液（含50100CFU試驗菌）置50ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，用封閉式薄膜過濾器濾干，平行制備2張膜，將濾膜菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊

12、脂培養(yǎng)基或玫瑰紅瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2472小時，測定菌數(shù)。5.4.2供試品組：取2ml供試液置50ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，用封閉式薄膜過濾器濾干，平行制備2張膜，將濾膜菌面朝上分別貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2472小時，測定菌數(shù)。 5.4.3菌液組：測定所加的試驗菌數(shù)。 5.4.4稀釋劑對照組：用相應的稀釋液替代供試品，按試驗組的制備方法和菌落計數(shù)法測定菌數(shù)。6、結(jié)果判斷：稀釋劑對照組的菌回收率均應不低于70%。若試驗組的菌回收率均不低于70%，則可按該菌落計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌或酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收

13、率低于70%，應建立新的方法，消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。注：試驗組回收率（%）=（試驗組平均菌落數(shù)供試品對照組平均菌落數(shù)）÷菌液組平均菌落數(shù)×100%稀釋劑對照組回收率（%）=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)÷菌液組平均菌落數(shù)×100%7、結(jié)果統(tǒng)計 實驗結(jié)果填寫在附表7細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)計數(shù)驗證結(jié)果原始記錄。8、結(jié)果評定與結(jié)論綜合評定內(nèi)容包括以下方面：確認試驗是否有遺漏；是否需要進一步補充試驗；確認記錄是否完整；樣品預處理方式、檢驗用器具、材料和培養(yǎng)條件等是否合理；驗證過程是否準確、有效、可靠并具有較好的重現(xiàn)性，驗證過程中是否有OOS，OOS的處理是

14、否按要求處理，試驗結(jié)果是否符合要求。純化水微生物限度檢查方法驗證編碼：R/QMV-T009-00頁碼： 7/8附表1 設備確認結(jié)果儀器名稱型 號校準有效期至生產(chǎn)廠家及出廠編號驗證編號霉菌培養(yǎng)箱MJ-250-I上海圣欣科學儀器有限公司（040342）生化培養(yǎng)箱LRH-250上海圣欣科學儀器有限公司（ZB1007）生化培養(yǎng)箱LRH-250上海圣欣科學儀器有限公司（040873）電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162上海一恒科技有限公司（035184）脈動真空滅菌柜GX1.D山東新華醫(yī)療器械股份有限公司（0807002）非標干熱滅菌箱GM100-I常州市震華干燥設備有限公司（0807001）立式壓力蒸汽消毒

15、器628D鐵嶺市醫(yī)療器械總廠（297）電子天平PB602-N梅特勒-托利多儀器有限公司（1201130089）檢查人/日期： 復核人/日期：附表2 試驗器材名稱型 號來 源檢查項目及標準檢查結(jié)果封閉式無菌檢查薄膜過濾器STV2、STV3型浙江寧海白石藥檢儀器廠完整，潔凈，無破損微孔濾膜孔徑0.45m，直徑50mm上海亞東核級樹脂有限公司完整，無破損光學顯微鏡YS100Nikon各配件應齊全，無損壞檢查人/日期： 復核人/日期：附表3 試驗用菌種確認結(jié)果菌種名稱來 源菌種代數(shù)（不得超過第五代）形態(tài)特征檢查結(jié)果金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003中國藥品生物制品檢定所枯草芽孢桿菌CMCC（B）6

16、3501中國藥品生物制品檢定所大腸埃希菌CMCC（B）44102中國藥品生物制品檢定所白色念珠菌CMCC（F）98001中國藥品生物制品檢定所黑曲霉CMCC（F）98003中國藥品生物制品檢定所檢查人/日期： 復核人/日期：附表4 培養(yǎng)基確認結(jié)果培養(yǎng)基名稱批號有效期至來 源檢查項目及標準檢查結(jié)果營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中國藥品生物制品檢定所應在有效期內(nèi)玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中國藥品生物制品檢定所應在有效期內(nèi)檢查人/日期： 復核人/日期：附表5 試劑確認結(jié)果試劑名稱規(guī)格批 號有效期至來 源檢查項目及標準檢查結(jié)果氯化鈉500g/瓶廣州化學試劑廠1.應為AR級試劑2.應在有效期內(nèi)磷酸二氫鉀500g/瓶廣州化學試劑

17、廠1.應為AR級試劑2.應在有效期內(nèi)磷酸氫二鈉500g/瓶廣州化學試劑廠1.應為AR級試劑2.應在有效期內(nèi)蛋白胨250g/瓶廣州化學試劑廠應在有效期內(nèi)氫氧化鈉500g/瓶廣州化學試劑廠1.應為AR級試劑2.應在有效期內(nèi)新潔爾滅溶液500ml/瓶江門市恒健藥業(yè)有限公司應在有效期內(nèi)檢查人/日期： 復核人/日期：附表6器皿確認結(jié)果容器名稱規(guī)格型號檢查項目及標準檢查結(jié)果培養(yǎng)皿9cm潔凈，無破損錐形瓶500ml、250ml、100ml潔凈，無破損燒杯5000ml、1000ml、100ml潔凈，無破損試管18mm×180mm、30 mm×200mm潔凈，無破損刻度吸管10 ml 、5

18、ml、2 ml潔凈，無破損量杯、量筒1000ml 、100ml、50ml潔凈，無破損，應校正檢查人/日期： 復核人/日期：純化水微生物限度檢查方法驗證編碼：R/QMV-T009-00頁碼： 9/8附表7細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)計數(shù)驗證結(jié)果原始記錄檢品名稱： 驗證日期：試驗菌種取樣點試驗組（檢品+驗證加數(shù)）菌液組（驗證加菌數(shù)）供試品組（檢品本底菌數(shù)）稀釋劑對照組（稀釋劑+驗證加菌數(shù)）試驗組菌回收率%稀釋劑對照組菌回收率%皿1皿2平均皿1皿2平均皿1皿2平均皿1皿2平均金黃色葡萄球菌原料廠區(qū)純化水站總回水（PWA-02）制劑廠區(qū)純化水站總回水（PWB-02）107車間純化水站總回水（PWA-14）大腸埃希菌原料廠區(qū)純化水站總回水（PWA-02）/制劑廠區(qū)純化水站總回水（PWB-02）/107車間純化水站總回水（PWA-14）/枯草芽孢桿菌原料廠區(qū)純化水站總回水（PWA-02）/制劑廠區(qū)純化水站總回水（PWB-