植物組織培養(yǎng)復習大綱

1、緒論（一）植物組織培養(yǎng)的基本概念植物組織培養(yǎng)（plant tissue culture）： 在無菌條件下，利用人工培養(yǎng)基，對植物材料（器官、組織、細胞或原生質(zhì)體等）的離體培養(yǎng)。 外植體 （explant）： 接入培養(yǎng)基，以進行離體培養(yǎng)的植物材料。 接種 （inoculate）： 在無菌條件下，將外植體接入培養(yǎng)基，以進行培養(yǎng)的操作。 初代培養(yǎng) ： 對從植物體上分離下來的外植體，進行的最初培養(yǎng)，其目的是建立無菌培養(yǎng)系。繼代培養(yǎng)： 將初代培養(yǎng)誘導產(chǎn)生的培養(yǎng)物，重新分割，轉(zhuǎn)到新鮮培養(yǎng)基上，繼續(xù)進行的培養(yǎng)。 脫分化 （dedifferentiation）： 細胞由成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程。 愈傷組織

2、 （callus）： 無定形、具有分生能力而無特定功能的一團無序生長的薄壁細胞。 植物細胞全能性 （plant cell totipotency）： 任何具有完整細胞核的植物細胞，都擁有形成一個完整植株所必須的全部遺傳信息，和發(fā)育成完整植株的潛在能力。 （二）植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史1、探索階段（20世紀初20世紀30年代中）20世紀初，德國植物生理學家Haberlandt： 小野芝麻和鳳眼蘭柵欄組織的單個細胞 虎眼萬年青屬的表皮細胞的單個細胞 ； Knop蔗糖； 細胞生長、胞壁加厚、淀粉形成； 細胞分裂： ？ 高度分化的細胞； 未加植物生長物質(zhì)的簡單培養(yǎng)基。 植物組織培養(yǎng)的先驅(qū)者植物組織培養(yǎng)的

3、先驅(qū)者2、奠基階段（20世紀30年代中50年代末）20世紀30年代中，對植物生長的兩個重要發(fā)現(xiàn)： B族維生素； 生長素。1934年，美國科學家White：番茄根尖； 培養(yǎng)基（原來）：無機鹽酵母浸出液蔗糖；（后來）：無機鹽B族維生素（吡哆醇、硫胺素、煙酸）蔗糖；建立了第一個活躍生長的無性系；White培養(yǎng)基。1934年，法國科學家Gautheret：山毛柳和黑楊等的形成層組織； Knop 鹽酸半胱氨酸葡萄糖；（胡蘿卜根形成層）B族維生素生長素；首次獲得連續(xù)生長的組織培養(yǎng)物。1934年，Nobecourt ： 胡蘿卜；也建立了類似的連續(xù)生長的組織培養(yǎng)物。Gautheret、White和Nobeco

4、urt：植物組織培養(yǎng)的奠基人20世紀40年代50年代初，Skoog（1944）；Skoog和崔徵（1951）：腺嘌呤不但可以促進愈傷組織的生長，而且還能解除培養(yǎng)基中生長素的對芽形成的抑制作用，誘導芽的形成。確立了：腺嘌呤與生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。導致了激動素的發(fā)現(xiàn)以及利用激動素和生長素在植物組織培養(yǎng)中控制器官分化研究工作的開展。1941年，Overbeek et al：將椰子汁加入培養(yǎng)基：曼陀羅的心型期幼胚離體培養(yǎng)成熟。1952年，Morel和Martin：對已被病毒侵染的大麗花莖尖分生組織進行離體培養(yǎng)：獲得脫毒植株.1953年，Muir：將萬壽菊和煙草的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體

5、培養(yǎng)基中，于搖床上振蕩，使組織散碎，形成由單細胞和細胞聚集體組成的細胞懸浮液，再經(jīng)繼代培養(yǎng)：獲得了單細胞培養(yǎng)的初步成功；還用機械方法由細胞懸浮液和易散碎的愈傷組織中分離得到單細胞，將其置于鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養(yǎng)：細胞發(fā)生了分裂。此即“看護培養(yǎng)”技術。>1955年，Miller et al：從鯡魚中分離出一種首次為人所知的細胞分裂素，并將其定名為激動素（kinetin）?，F(xiàn)將具與激動素類似活性的天然的或合成的一類化合物統(tǒng)稱為細胞分裂素。>1957年，Skoog和Miller：提出了有關植物生長物質(zhì)控制器官形成的概念，指出在煙草髓組織培養(yǎng)中，根和莖的分化是生長素對細胞分裂素比率的

6、函數(shù)，通過改變培養(yǎng)基中這兩類植物生長物質(zhì)的相對濃度可以控制器官的分化：這一比率高時促進生根；這一比率低時促進莖芽的分化；二者濃度相等時，組織則傾向于以一種無結構的方式生長。>后來證明：植物生長物質(zhì)可調(diào)控器官發(fā)生的概念對于多數(shù)物種都可適用，只是由于在不同組織中這些植物生長物質(zhì)的內(nèi)生水平不同。因而，對于某一具體的形態(tài)發(fā)生過程來說，它們所要求的外源植物生長物質(zhì)的水平也會有所不同。>1958年，Steward et al：以胡蘿卜為材料，首次通過實驗證實了先驅(qū)者Haberlandt關于細胞全能性的設想，成為植物組織培養(yǎng)研究歷史中的一個里程碑。1958年，Reinert和Steward分別報

7、道：在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細胞胚。這是一種不同于通過芽和根的分化而形成植株的再生方式?，F(xiàn)在知道，很多物種都能形成體細胞胚。>3、迅速發(fā)展階段（20世紀60年代現(xiàn)在）（1）原生質(zhì)體培養(yǎng)取得重大突破：1960年，Cocking et al用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功；1971年，Takebe et al在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株，這不但在理論上證明了除生殖細胞和有壁體細胞以外，體細胞的原生質(zhì)體同樣具有全能性，而且在實踐上可為基因工程外源基因的導入提供理想的受體材料；1972年，Carlson et al通過兩個煙草物種之間原生質(zhì)體的融合，獲得了第一個體細胞雜種。（

8、2）花藥培養(yǎng)取得顯著成績：1964 年，Guha and Maheshwari 報道，在毛曼陀羅中通過花藥離體培養(yǎng)由小孢子直接發(fā)育成胚； 1967年，Bourgin and Nitsch通過花藥培養(yǎng)獲得了完整的煙草植株。（3）微繁技術得到廣泛應用：1960年，Morel建立了一個離體營養(yǎng)繁殖蘭花的方法，繁殖系數(shù)極高。由于這一方法具巨大的實用價值，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起“蘭花工業(yè)”。在其它許多觀賞植物和經(jīng)濟植物中，微繁也達到了工廠化的生產(chǎn)規(guī)模。1962年，Murashinge和Skoog在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被廣泛使用的MS培養(yǎng)基。 （三）植物組織培養(yǎng)與其它生命科學的關系1、植物組

9、織培養(yǎng)是植物基因工程不可或缺的組成部分。無論是轉(zhuǎn)基因受體的提供，還是轉(zhuǎn)化細胞的篩選和再生，都需組織培養(yǎng)技術作為支撐。>2、植物組織培養(yǎng)是生物制品的有效生產(chǎn)途徑。有些極其昂貴的生物制品，例如抗癌首選藥物紫杉醇等，可以用大規(guī)模培養(yǎng)植物細胞來直接生產(chǎn)。國內(nèi)在紅豆杉組織培養(yǎng)中獲得高產(chǎn)細胞系，每L細胞培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量可達0.25 mg。3、在植物雜交育種中，采用花藥培養(yǎng)技術不但可以縮短雜合體純合化所需的時間，而且還可節(jié)省土地面積。>4、在遠緣雜交中，通過原生質(zhì)體融合可克服受精前障礙；通過幼齡合子胚培養(yǎng)可克服受精后障礙；通過原生質(zhì)體融合可獲得細胞質(zhì)雜種。>5、對于無藥可治的病毒病，可

10、通過莖尖培養(yǎng)消除病毒。已經(jīng)取得成功的有馬鈴薯、草莓、香蕉、葡萄等。>6、通過離體誘導不定芽或促進腋芽生枝，可進行很多名貴花卉等重要園藝植物的快速繁殖。一個單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個植株。例如：一株葡萄一年繁殖到3萬多株，一株蘭花一年繁殖到400萬株。>7、應用在細胞水平上進行突變體選擇的技術，可在一定程度上使高等植物的育種程序微生物化，從而大大提高選擇效率，節(jié)省時間和土地面積，且不受季節(jié)的限制。例如：中國林科院通過逐步加大培養(yǎng)基中鹽的濃度，直接獲得耐鹽的楊樹株系。>8、愈傷組織培養(yǎng)等可產(chǎn)生體細胞無性系變異，為不同的育種目標提供（除有性雜交、理化誘變外的第三類）可利用的變異

11、。>9、特別在營養(yǎng)繁殖植物中，通過莖尖分生組織等離體材料的超低溫保存，不但可大大節(jié)省空間，而且可使其免受病蟲侵襲，且便于無毒種質(zhì)的國際交流。>二、實驗室的基本分區(qū)及設備（一）概述如果新建實驗室，那么最好應選擇在光線充足、通風良好、空氣清新、環(huán)境清潔、水電齊備、交通便利的地方，注意避開各種污染源。也可因地制宜利用現(xiàn)有房舍，按照相關要求改建而成。實驗室的大小可根據(jù)各自的工作性質(zhì)和生產(chǎn)規(guī)模來設計，面積可大可小。如用于科研和小規(guī)模生產(chǎn)的，面積可較小；如為大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的，面積應較大，其常被稱為“組培工廠”。一個大型的植物組織培養(yǎng)實驗室可設置：洗滌室、藥品室、稱量室、培養(yǎng)基配制室、滅菌室、

12、接種室、培養(yǎng)室、觀察記錄室、貯藏室，另外還可配置一定面積的煉苗溫室。小型植物組織培養(yǎng)實驗室可將上述同類分區(qū)加以合并。如果條件允許，那么其可分為準備室、接種室、培養(yǎng)室、煉苗室等區(qū)室。一般按照自然工作程序，將上述各區(qū)室依次安排成一條連續(xù)的生產(chǎn)線。 洗滌室：用于玻璃器皿、實驗用具的清洗干燥；培養(yǎng)材料清洗及預處理也可在本室完成。 藥品室：用于存放各種藥品試劑。要求：干燥、通風，避免光照。 稱量室：進行化學藥品的稱量。要求：干燥、密閉、無直射光照，避免腐蝕性藥品與水汽直接接觸。 培養(yǎng)基配制室：主要進行貯備液和植物生長物質(zhì)原液的配制以及培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎及滅菌前的暫時存放。 滅菌室：主要用于培養(yǎng)基和

13、器皿的滅菌以及蒸餾水的制備。 接種室：主要進行植物材料的表面滅菌、分離切割及轉(zhuǎn)接等。面積：宜小不宜大，一般小的接種室為57m2。要求：地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉門，以減少開關門時的空氣擾動。在適當位置吊裝12盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。接種室外應設有緩沖間，面積以1m2為宜。進入接種室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進出時將雜菌帶入接種室。緩沖間最好也裝一盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。 培養(yǎng)室：培養(yǎng)植物材料的場所。室內(nèi)的培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設5層，最低一層離地高約10cm，其它每層間隔30cm左右

14、，整個培養(yǎng)架高約1.7m左右。培養(yǎng)架長度都是根據(jù)日光燈的長度而設計的，寬度一般為60cm。培養(yǎng)室內(nèi)各因子設置（培養(yǎng)的物理條件）：培養(yǎng)室中對培養(yǎng)影響最大的因子是溫度。為適合大多數(shù)植物生長，一般通過冷熱可控空調(diào)，通常將溫度設定為25±2 。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，因此最好不同種類有不同溫度的培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也應維持恒定，一般相對濕度以保持在70%80%為宜，可通過加濕器、除濕器來調(diào)節(jié)。光照強度：對多數(shù)植物來說，10004000 lx的光強即能滿足其生長的需要。光周期：可通過定時開關控制。一般設為每天光照1016 h。通常短日照植物需要短日照條件，長日照植物需要長日照

15、條件。也有一些培養(yǎng)類型需要連續(xù)黑暗。黑暗條件：利于愈傷組織的誘導和增殖、再生器官原基的分化等；光照條件：利于器官增殖發(fā)育等。光質(zhì)：對愈傷組織的誘導、培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。例如：百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織；但在藍光下培養(yǎng)，十幾周后才出現(xiàn)愈傷組織。而唐菖蒲子球塊接種15 d后，在藍光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛；而白光下幼苗纖細。對于楊樹愈傷組織生長：紅光促進；藍光阻礙?，F(xiàn)代組培實驗室大多設計為采用天然太陽光照作為主要能源。這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽光生長良好，煉苗容易成活。在陰雨天可用燈光作補充。 觀察、記錄室：用于對培養(yǎng)物的生長情況

16、及實驗結果進行觀察記錄。 貯藏室：用于暫時不用的器皿和用具等的存放。 煉苗室：用于試管苗的煉苗和移栽。（二）基本分區(qū)及其設備1、準備室及其設備主要用于：器皿洗滌、干燥、貯存；試劑貯存、稱量、配制；培養(yǎng)基配制、分裝、滅菌等。主要設備有：洗滌池、烘箱、藥品柜、冰箱、工作臺、天平、蒸餾水發(fā)生器等制水設備、貯物柜、三角瓶、電熱磁攪拌器、 pH計、電爐、微波爐等加熱設備（熔化瓊脂等）、恒溫水浴、培養(yǎng)基分裝器、培養(yǎng)容器等各種所需器皿及用具、封口材料、醫(yī)用小推車等運輸工具、高壓蒸汽滅菌鍋（小型手提式或中型立式或大型臥式）、吸氣機或真空泵（輔助過濾滅菌）、細菌過濾器、離心機、血球計數(shù)器、顯微鏡等。注意要點：電

17、子分析天平和托盤天平：電子分析天平用于稱取大量元素、微量元素、維生素、植物生長物質(zhì)等微量藥品，精確度為0.0001g；托盤天平用于稱取用量較大的糖和瓊脂等，精確度為0.1g。天平應放置在干燥、不受震動的天平操作臺上。>注意要點：pH計：組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基pH值的準確度是十分重要的，應當使用pH計測定。若無pH計，也可使用pH試紙進行粗測。首次使用pH計前，應用標準液調(diào)節(jié)定位，然后固定。測量pH值時，待測液必須充分攪拌均勻。如果培養(yǎng)基溫度過高，測量時要調(diào)整pH值計上的溫度扭，使之與培養(yǎng)基溫度相當。>注意要點：高壓蒸汽滅菌鍋：用于耐熱培養(yǎng)基、蒸餾水和接種器械等的滅菌消毒。工作原理：在密閉

18、的蒸鍋內(nèi)0.1 MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。使用方法：首先檢查滅菌鍋內(nèi)是否有水，而且水剛好淹過加熱器，然后放入滅菌材料，對稱擰緊滅菌鍋上的螺絲，關閉放氣閥，再通電。待壓力上升到0.05 MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。三次放氣后，關閥再通電，壓力表上升達0.10.15 Mpa時，維持20 min后，斷電，待壓力降至零時，打開放氣閥，取出滅菌材料。注意要點： 對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培基質(zhì)、接種用具，可以延長滅菌時間或提高壓力；對一些布制品，在洗凈晾干后，用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20

19、30min；而對培養(yǎng)基，要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長時間； 高壓滅菌前、后的培養(yǎng)基，pH值下降0.20.3單位。因此，調(diào)pH值時，可適當調(diào)高0.20.3個單位；烘箱：可用于干燥洗凈的玻璃器皿，可用于干熱滅菌，也可用于烘干鮮物質(zhì)以測定干物重。用于干燥器皿，需保持80100 ；用于干熱滅菌，需保持150 ，達13 h；用于烘干物質(zhì)，需保持80 ，烘干至完全干燥為止。注意要點：培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿現(xiàn)逐漸被塑料器皿所代替。塑料容器具有質(zhì)輕、不易破碎、成本低等優(yōu)點。 瓶口封塞可用多種方法，要具有一定的通氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和

20、雜菌污染?，F(xiàn)在多采用聚丙烯塑料薄膜作為封口，為了增加通氣性，可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙，也可采用專用的封口膜。2、接種室（附緩沖間）及其設備緩沖間界于準備室與接種室之間。該室主要用于操作人員進入接種室之前在此更衣?lián)Q鞋、洗手等。主要設備有：紫外線滅菌燈、擱物架、洗手池、衣帽架、鞋柜等。接種室主要用于植物材料的消毒、無菌清洗、接種、無菌培養(yǎng)物的繼代接種等。主要設備有：紫外線滅菌燈、擱物架（貯放滅過菌待接種的培養(yǎng)容器等）、超凈工作臺、酒精燈、酒精缸（用于浸泡接種用具）、酒精噴壺（用于消毒滅菌）、接種用具（包括用于接種切割等的無菌器皿）、接種用具滅菌器、滅菌劑及滅菌所需助劑、器皿、廢物缸、鬧鐘、醫(yī)用

21、小推車等運輸工具、雙筒顯微解剖鏡、空調(diào)等。注意要點：超凈工作臺：使用前，將超凈工作臺的排風和殺菌按鈕開啟，滅菌15 min后，關閉殺菌按鈕，打開照明按鈕，即可在上面進行操作。解剖鏡：種類較多，用于分離莖尖，采用雙筒實體解剖鏡。解剖鏡上帶有照相裝置，根據(jù)需要隨時對所需材料進行攝影記錄。解剖刀：切割較小材料和分離莖尖分生組織時，可用解剖刀。刀片要經(jīng)常調(diào)換，使之保持鋒利狀態(tài)，否則切割時會造成擠壓，引起周圍細胞組織大量死亡，影響培養(yǎng)效果。3、培養(yǎng)室及其設備主要設備有：分層培養(yǎng)架與日光燈管（每層40 W日光燈12盞，架長約126 cm）、定時開關（控制光周期）、空調(diào)、加除濕器、搖床（平動式，或旋轉(zhuǎn)式；或

22、溫光可控式：進行細胞懸浮培養(yǎng)）、培養(yǎng)箱（恒溫培養(yǎng)箱；光照培養(yǎng)箱）等。>注意要點：搖床：在懸浮培養(yǎng)中，可改善液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)材料的通氣狀況，例如：從疏松愈傷組織中獲得單細胞或小細胞團。但要注意設定適合的溫度及轉(zhuǎn)速。>4、煉苗室及其設備主要用于試管培養(yǎng)苗到自然生長苗狀態(tài)的適應鍛煉。主要設備有：分層架、光源（自然光或人造光）、溫控設備等。>三、培養(yǎng)基（一）概述擬定植物組織培養(yǎng)方案：查閱相關文獻，根據(jù)已成功培養(yǎng)的相近植物資料，結合將要研究的植物的情況，制定出切實可行的培養(yǎng)方案。其中，確定各種合適的培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)最重要的內(nèi)容，是決定培養(yǎng)成敗的關鍵因素。沒有一種現(xiàn)成的培養(yǎng)基能適合

23、一切類型的植物組織、器官等的離體培養(yǎng)。因此在建立一個新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須研制出一種能滿足該待培養(yǎng)材料所需的培養(yǎng)基。一些早期的植物組織培養(yǎng)基，如Gautheret（1939）提出的愈傷組織培養(yǎng)基和White（1943）提出的根培養(yǎng)基，都是由先前用于整體植物栽培的營養(yǎng)液發(fā)展而來的。而以后幾乎所有的培養(yǎng)基，都是建立在White培養(yǎng)基和Gautheret培養(yǎng)基的基礎之上的。1、常用的基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基：MS、White、B5、Nitsh、 改良MS、Heller、Miller、N6、SH等。完全培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基的基礎上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質(zhì)而成，例如：加植物生長物質(zhì)、其它復雜有機

24、物等。>2、常用基本培養(yǎng)基的特點（1）MS培養(yǎng)基 它是1962年 由Murashige and Skoog 為培養(yǎng)煙草細胞而設計的。 特點：無機鹽濃度高，具有高含量的氮、鉀，尤其是銨鹽和硝酸鹽的含量很大，能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的需求。有加速愈傷組織等培養(yǎng)物生長的作用，當培養(yǎng)物長時間不轉(zhuǎn)移時，仍可維持其生存。>（2）White培養(yǎng)基 它是1943 年由White 為培養(yǎng)番茄根尖而設計的。 1963 年又作了改良，稱作White 改良培養(yǎng)基，提高了MnSO4 濃度，增加了硼素。 特點：無機機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。>（3）B5培養(yǎng)基 它是1968 年由Gamborg

25、et al 為培養(yǎng)大豆根細胞而設計的。 特點：含有較低的銨鹽、較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。適合于某些雙子葉植物，特別是木本植物的生長。>（4）N6培養(yǎng)基 它是1974 年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計的。 特點：成分較簡單，KNO3 和（NH4 ）2SO4 含量高。 廣泛應用于小麥、水稻及其它植物的花粉、花藥培養(yǎng)。 >各種常用基本培養(yǎng)基之間在組分上的主要差別在于所含各種離子數(shù)量上的不同。目前，MS培養(yǎng)基是一種最常用的植物離體培養(yǎng)基。 >配制培養(yǎng)基的化學藥品的純度：盡量選用分析純，有時化學純也可代用。配制培養(yǎng)基對水的要求：在研究工作中，一般需用重蒸水或蒸餾水，也可用去離

26、子水；在工廠化大量生產(chǎn)時，可試用對植物無毒害、水質(zhì)軟（配制培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后不產(chǎn)生沉淀）的水源。 >國際植物生理學會建議：在植物組織培養(yǎng)的文獻中采用摩爾值（mol/L及其派生單位）作為培養(yǎng)基中化學物質(zhì)的計量單位，以便對不同的培養(yǎng)基進行比較。在實際工作中，也常用mg/L為單位。在需要時，可以進行兩者間的換算。 >（二）培養(yǎng)基的組成無機營養(yǎng)成分、有機營養(yǎng)成分、植物生長物質(zhì)、其它成分、瓊脂及其它固化劑、pH1、無機營養(yǎng)成分除了碳、氫、氧之外，還有氮、磷、鉀、鈣、硫、鎂、（硅）、（氯）、硼、銅、鐵、鋅、錳、（鎳）、鉬、（鈉）等12（19）種元素。氮、磷、鉀、鈣、硫、鎂的需要量較大（0.5

27、mmol/L），被稱為大量元素；硼、銅、鐵、鋅、錳、鉬的需要量較小（0.5 mmol/L），被稱為微量元素。 >氮是生命不可缺少的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時，常以NO3和NH4兩種形式供應。多數(shù)培養(yǎng)基既含NO3又含NH4。NH4對植物生長較為有利。供應N的物質(zhì)有KNO3、NH4NO3等。有時，也添加氨基酸來補充氮素。 >在植物組織培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進對氮的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有KH2PO4或NaH2PO4等。 >鉀與碳水化合物合成和轉(zhuǎn)移及氮素代謝等有密切關系。在制備培養(yǎng)基時，常以KCl、KNO3等鹽類提供。 >

28、;Mg、S和Ca：Mg和S常以MgSO4·7H20提供，用量為13mg/L。Ca常以CaCl2·2H2O提供。 >現(xiàn)在多數(shù)培養(yǎng)基中，鐵是以一種螯合形式（Fe·EDTA）提供的，其在培養(yǎng)基的pH值升至7.68.0時，仍可被植物組織所利用。 在單獨使用時，硝酸鹽會使培養(yǎng)基的pH值向堿性方向漂移；若硝酸鹽與少量銨鹽一起使用，則這種漂移即可被阻止。因此，多種培養(yǎng)基既含有硝酸鹽，也含有銨鹽。 >2、有機營養(yǎng)成分（1）含氮物質(zhì)一般認為，硫胺素（VB1）是必需的。在其它各種維生素中，已知煙酸（VB3）、泛酸鈣（VB5）和吡哆醇（VB6）、肌醇都能改善所培養(yǎng)植物組織的

29、生長狀況。維生素大多溶于水。而葉酸需先用少量稀堿水溶解，然后加水定容。 >有時還用一些營養(yǎng)成分不明的混合物：水解酪蛋白（CH）、椰子汁（CM）、酵母浸出液（YE）（2）碳源不但起碳源作用，也起能源作用，還起滲透壓穩(wěn)定劑的作用?？捎闷咸烟?、果糖、蔗糖等，此外，還有山梨醇、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、淀粉。最常用的是蔗糖，濃度為25%。在誘導花藥愈傷組織時，所用蔗糖濃度可適當提高。 >3、植物生長物質(zhì)（1）生長素在植物離體培養(yǎng)中，生長素類一般用于誘導不定根的形成，也用于誘導愈傷組織的形成，但更用于與細胞分裂素適量配合，共同誘導不定芽的形成，促進側(cè)芽的生長，誘導某些植物胚狀體的形成。

30、由于吲哚乙酸（IAA）等天然激素易受體內(nèi)酶的分解，而且易受外界光的氧化，以及高溫等的破壞，因此在植物離體培養(yǎng)基中，常用人工合成的類似物替代。這類類似物主要有：吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。其作用活性由強到弱的順序如下：2，4-DNAAIBAIAA。一般在相同用量時，如果以IAA的相對活性為1，那么NAA約為34，而2，4-D則約為1020。IBA和NAA廣泛用于誘導生根，并與細胞分裂素一起使用能互作促進莖芽的增殖；2，4-D有抑制不定芽形成的副作用，適宜的用量范圍較窄，過量使用常有毒害。一般用于啟動離體培養(yǎng)植物體細胞脫分化、愈傷組織的誘導和生長，而誘

31、導分化階段往往不用2，4-D，多用NAA、IBA或IAA等。一般生長素的使用濃度為0.055.0 mg/L；常配成1 mg/mL的貯備液存于冰箱中備用。（2）細胞分裂素在植物離體培養(yǎng)中，細胞分裂素類主要用于促進細胞分裂與增大，使莖增粗，而抑制莖伸長；一般在細胞分裂素與生長素比值較高時，誘導不定芽的分化，促進側(cè)芽的分化。 常用的細胞分裂素類植物生長物質(zhì)有：6-芐基腺嘌呤（6-苯甲基氨基嘌呤，6-BA，BA）、糠基腺嘌呤（呋喃甲基氨基嘌呤，激動素，KT，K）、2-異戊烯基腺嘌呤（2ip）、玉米素（ZT）、噻重氮苯基脲（TDZ)等。一般細胞分裂素的使用濃度為0.055.0 mg/L；常配成1 mg/

32、mL的貯備液存于冰箱中備用。（3）赤霉素赤霉素類植物生長物質(zhì)（GA）主要用于：促進幼苗莖的伸長生長，破除種子、塊莖、鱗莖等的休眠，使之提前萌發(fā)。在組織培養(yǎng)中所用的是GA3。GA3被用于促進植株節(jié)間伸長、刺激在培養(yǎng)中形成的體細胞胚正常發(fā)育成植株等。 >GA不耐熱，在高壓滅菌后約有70100%失效。因此，應采用過濾除菌法加入培養(yǎng)基。GA3在水中不穩(wěn)定，因此要用95%乙醇配制貯備液。常配成1mg/mL的貯備液存于冰箱中備用。 4、其它成分（1）活性炭在培養(yǎng)基中添加活性炭可以防止植物組織自身的酚類物質(zhì)排泌和變褐老化，對形態(tài)發(fā)生和器官形成有良好效應。一般認為，活性炭主要吸附非極性物質(zhì)及色素等大分子

33、，可以減少一些有害物質(zhì)的影響，但是其吸附的選擇性很差。溫度低時吸附力增強，溫度高時吸附力減弱，甚至會解吸附。 >通常使用濃度為0.510 g/L。加入活性炭后使培養(yǎng)基變黑，對一些植物誘導生根有利。大量活性炭的加入會削弱瓊脂的凝固能力，因此需要多加一些瓊脂。很細的活性炭容易沉淀，因此通常在瓊脂將要凝固時，需輕輕搖動培養(yǎng)瓶，以使其均勻分布于培養(yǎng)基中。 >（2）硝酸銀硝酸銀在某些植物組織培養(yǎng)中，主要被用于：促進愈傷組織器官發(fā)生或體細胞胚發(fā)生、克服試管苗玻璃化及早衰和落葉等。硝酸銀的用量一般為110 mg/L；滅菌方法為過濾除菌。注意：不要將培養(yǎng)物過長時間（長于原基形成所需時間）培養(yǎng)在含硝

34、酸銀的培養(yǎng)基上。否則，其會導致再生植株畸形。 >（3）抗生素加入抗生素的主要目的是：防止菌類污染，抑制菌類生長?？股乜梢环N單獨使用，也可兩種混合使用。但是，抗生素對植物組織的生長也有抑制作用，并且不同植物組織對不同抗生素的敏感程度不一。常用的抗生素有：青霉素、鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素、慶大霉素等；用量一般為520 mg/L；大部分抗生素要求過濾滅菌。 >5、瓊脂及其它固化劑瓊脂是一種由海藻得來的多糖類物質(zhì)，40 凝固；一般使用濃度0.7%1%。 一般來說，在pH值高于6.5時，瓊脂固化培養(yǎng)基會變硬；在pH值低于5時，瓊脂固化培養(yǎng)基不能很好地凝固。 此外，其它固化劑

35、還有：Gelrite 和Agarose （瓊脂糖）等。 >6、pH常用0.1 N氫氧化鉀（或0.1 N氫氧化鈉）和0.1 N鹽酸加以調(diào)整。一般將培養(yǎng)基的pH值調(diào)整到5.8左右。調(diào)好pH值的培養(yǎng)基，經(jīng)過高壓滅菌之后，常會使pH值下降0.20.3，同時使培養(yǎng)基滲透壓上升一些。 >（三）培養(yǎng)基的研制1、試驗設計一般方法通常，培養(yǎng)基研制的一般試驗方法：（1）預備性試驗一般預備性試驗規(guī)模比較小，條件要求等不必面面俱到。 在某些因素作用不明的情況下，可多做一些預備性試驗，這樣能加快試驗研究進展。 >（2）單因素試驗 在單因素試驗中，其它各個因素都基本確定，并維持在一定水平上，只變動一個因

36、素，以研究這一因素有無影響以及影響程度。 （3）雙因素試驗在試驗中含有兩個影響因素的叫雙因素試驗。其常用于研究生長素與細胞分裂素的濃度配比。在因素水平較少的情況下，進行雙因素多水平組合，可以較快地篩選出一組最佳濃度組合。（4）多因素實驗在試驗中含有兩個以上因素者為多因素試驗。在試驗中，可以同時研究多種因素不同水平對試驗結果的影響。例如：在研究培養(yǎng)基中細胞分裂素、生長素、糖和其它成分的合適加用量時，即需采用多因素試驗設計，這樣可收到事半功倍的效果。多因素試驗，一般應用正交實驗來具體設計各試驗因素各處理水平的安排。（5）逐步添加或逐步排除試驗逐步添加是為了使試驗取得更多結果；而逐步排除是為了縮小范

37、圍，更快找到最有影響的因子，或是為了降低生產(chǎn)成本或利于推廣，盡力使培養(yǎng)基簡化。例如：在植物組織分化與再生的研究中，在沒有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機營養(yǎng)成分；而在取得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐步排除一些成分。2、試驗設計具體方案（1）在建立一個新的離體培養(yǎng)體系時，為了能較快地研制出一種合適的培養(yǎng)基，最好先以一種已被廣泛采用的基本培養(yǎng)基（例如：MS）為基礎，以文獻中相關研究結果為參考，進行試驗設計。進行試驗設計，必須遵循兩個基本原則： 重復基本試驗（樣本含量） 隨機化配置試材（均一性）（2）在試驗設計時，一般最先考慮的是植物植物生長物質(zhì)，尤其是生長素，或（和）細胞分裂素（試驗因素）

38、。對于一個或兩個試驗因素的研究，可采用完全試驗方案。完全試驗方案具均衡完全的特點，各個因素的每個水平都相互搭配，構成了所有可能的處理組合。例如：研究NAA和BA的最佳濃度組合，每個因素各設5個濃度水平(0，0.5，2.5，5，10 mmolL)，這兩個因素的各種濃度的所有的組合，就構成了一個具有25個處理的完全試驗方案。然而，在完全試驗方案中，試驗因素越多，處理數(shù)越多，試驗就越復雜，消耗的精力、物力等就越多。 對于兩個以上試驗因素的研究，一般采用正交設計方案。采用正交設計試驗，可以通過較少的試驗處理數(shù)量，獲得較多的試驗結果信息。采用正交設計試驗，一般需借助于正交表。例如：采用正交設計表L9（3

39、4）可安排3個因素各3個水平的試驗，進行9個不同搭配的試驗，但其結果實際上相當于進行了完全試驗的27個處理的試驗。*正交表正交表是一套規(guī)則的設計表格，L為正交表代號；n為試驗次數(shù)（處理組合數(shù)）；t為水平數(shù)；c為列數(shù)，即最多可能安排的因素個數(shù)。一般式表示為： Ln（tc）。例如：L9（34）表示：最多可觀測4個因素，每個因素均為3個水平，設置9個試驗處理組合。一個正交表中也可以各列的水平數(shù)不相等，其被稱為混合型正交表，如L8（4×24），在此表的5列中，有1列為4個水平，4列為2個水平。正交表具有以下兩項性質(zhì)： （1）每一列中，不同的數(shù)字出現(xiàn)的次數(shù)相等。例如：在兩水平正交表中，任何一列

40、都有數(shù)碼“1”與“2”，且任何一列中它們出現(xiàn)的次數(shù)是相等的；例如：在三水平正交表中，任何一列都有“1”、“2”、“3”，且在任一列的出現(xiàn)數(shù)均相等。 >（2）任意兩列中數(shù)字的排列方式齊全而且均衡。例如：在兩水平正交表中，任何兩列（同一橫行內(nèi)）有序?qū)ψ庸灿?種：1，1；1，2；2，1；2，2；每種對數(shù)出現(xiàn)次數(shù)相等。在三水平情況下，任何兩列（同一橫行內(nèi)）有序?qū)灿?種：1，1；1，2；1，3；2，1；2，2；2，3；3，1；3，2；3，3；且每對出現(xiàn)數(shù)也均相等。以上兩點充分地體現(xiàn)了正交表的兩大優(yōu)越性，即： 均勻分散性； 整齊可比性。通俗地說，每個因素的每個水平與另一個因素各水平各碰一次，這就是

41、正交性。 交互作用表：一般每張正交表后都附有相應的交互作用表，它專門用來安排交互作用試驗。 >（3）在試驗設計中，必須考慮同時設置試驗處理組與對照組（試驗水平）。而試驗處理組與對照組中的試驗個體（試材）在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，須盡可能地完全一致，以使試驗處理結果的差異僅來源于試驗因素。 >（4）試驗處理組與對照組中的試驗個體須達一定數(shù)量（樣本含量），即試驗設計都要設有一定數(shù)量的重復，以取得可靠的可供生物統(tǒng)計分析的試驗結果。一般地隨試驗規(guī)模和要求不同而異，大多每個處理10個培養(yǎng)容器，每個容器至少3個外植體。（5）確定可供對試驗結果進行全面正確評價的觀測指標；并應盡量選擇

42、非百分率型的觀測指標。（6）確定進行連續(xù)動態(tài)觀測的合適觀測方法以及合適間隔時間。 >（四）培養(yǎng)基的制備1、貯備液的配制與保存為簡便起見，將培養(yǎng)基配方中的藥品一次稱量以供一段時間使用，即配制一些濃溶液，用時只需稀釋即可。這種濃溶液就是貯備液。貯備液要根據(jù)藥劑的化學性質(zhì)分別配制，一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質(zhì)等。在配制大量元素無機鹽貯備液時，要防止在混合各種鹽類時產(chǎn)生沉淀；在配制微量元素貯備液時，也要注意藥品的添加順序，以免產(chǎn)生沉淀。一般大量元素的貯備液比使用液濃度高1020倍；微量元素等的貯備液比使用液濃度高100200倍。鐵鹽容易發(fā)生沉淀，需要單獨配制。貯備液的濃度過高，以及

43、不恰當混合，會引起沉淀，影響使用效果。 以MS培養(yǎng)基為例，配制貯備液如下：一般按照上述表格所列各種試劑順序，依次稱量，分別溶解在少量蒸餾水中，然后依次加在一起，最后定容至規(guī)定的體積，得到貯備液（母液）I、II、III和IV。在配制貯備液III（鐵鹽）時，按量稱取兩種試劑，分別置于近半量的蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之溶解，然后將兩種溶液混合，調(diào)整pH至5.8，最后加蒸餾水定容至終體積，將其貯存于棕色玻璃試劑瓶中。 >以MS培養(yǎng)基為例，配制貯備液如下：植物生長物質(zhì)大多不溶于或難溶于水。IAA、NAA、IBA、2,4-D等生長素類和GA3,需要先用少量95%乙醇助溶，然后再用蒸餾水定容至所需要

44、的體積；KT、BA等細胞分裂素類則可用少量1 mol/L的HCl加熱溶解，然后再用蒸餾水定容至所需要的體積。 >以MS培養(yǎng)基為例，配制貯備液如下：各種植物生長物質(zhì)的貯備液應分別配制。其貯備液濃度可為1 mmol/L，或1 mg/mL。配制好的貯備液應分別貼上標簽，注明貯備液種類、倍數(shù)、配制日期，并在記錄本上詳細記載配制及稱取量，以便工作準確及日后檢查。所有貯備液應置冰箱4 保存。在取用貯備液時，應先輕輕搖動貯備液試劑瓶，檢查有無沉淀懸浮物或微生物污染，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，立即將其淘汰，重新配制。2、培養(yǎng)基的配制（1）稱取規(guī)定數(shù)量的瓊脂和蔗糖，加蒸餾水直到培養(yǎng)基最終體積的3/4，在恒溫水浴中或其它加

45、熱設備上加熱使之溶解，注意適時攪拌，以免沸騰溢出或者燒焦結底。但在配制液體培養(yǎng)基時則無須加熱，因為蔗糖甚至在微溫水中也能溶解。（2）分別加入一定量的各種貯備液，包括植物生長物質(zhì)和其它特殊補加物。 >（3）加水至培養(yǎng)基最終體積。（4）充分混合之后，用0.1 N氫氧化鉀（或氫氧化鈉）和（或）0.1 N鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至所需值，一般為5.8（借助pH計或者精密pH試紙）。（5）將培養(yǎng)基分裝到所選用的培養(yǎng)容器中，最多不要超過其最大容量的1/3（例如：150 mL的培養(yǎng)瓶，最多裝入50 mL培養(yǎng)基）。>在分裝時，注意不要將培養(yǎng)基粘附到培養(yǎng)瓶口或瓶口接近的內(nèi)壁上，以免日后引起污染。（6）以

46、棉塞（它可以阻止微生物污染，也允許培養(yǎng)容器內(nèi)外氣體自由交換）或其它合適的塞或蓋等封嚴瓶口，或外加包頭紙（牛皮紙或鋁箔等）或包扎其它覆蓋物。（7）在121 （1.06 kg/cm2）高壓滅菌20 min。 （8）待滅菌完成后，將分裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器從高壓滅菌裝置中取出，使其在室溫下冷卻，暫置合適柜架，以待接種。如果由于特殊原因必須在培養(yǎng)基高壓滅菌之后再加入不耐熱的生長素等，那么應先調(diào)好這些生長素等的pH，經(jīng)微孔（0.22或0.45m）過濾滅菌后，再在超凈臺上將其加入溫度適宜、尚未開始凝固的培養(yǎng)基中，搖動混勻，冷卻備用。 為此，每個培養(yǎng)容器中培養(yǎng)基的分裝量應該精確相同，以使每個容器中培養(yǎng)基所含經(jīng)

47、過濾滅菌藥品溶液的量準確可比。配制好滅過菌的培養(yǎng)基一般應盡快用完，最好不要超過10 d。 >四、一般技術與常見問題及其對策（一）外植體的選擇1、選擇優(yōu)良的基因型；2、選擇適當?shù)牟课恢参锝M織培養(yǎng)的外植體材料，可包括植物體的各個部位，如莖尖、節(jié)間、鱗莖、葉、子葉、根、花瓣、花藥和胚珠等。（1）莖尖：莖尖不僅生長速度快，繁殖率高，不容易發(fā)生變異，而且莖尖培養(yǎng)是獲得脫毒苗的有效途徑。（2）節(jié)間：新梢節(jié)間部位不僅滅菌容易，而且脫分化和再分化能力較強 。 （3）葉 和葉柄：葉片和葉柄取材容易，新出的葉片雜菌較少 。 （4）鱗片： 水仙、百合、蔥、蒜、風信子等鱗莖類植物常以鱗片為材料。 （5）其它：種

48、子、根、塊莖、塊根、花粉等也可以作為植物組織培養(yǎng)的材料。 3、選取適當?shù)拇笮?在微繁時，一般葉片、花瓣等外植體，以面積5 mm見方 為宜，其它培養(yǎng)材料的大小常取510 mm 。 如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應更小。 材料太大，材料太老，滅菌不易徹底，污染率高； 材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。4、選擇適當?shù)臅r期對大多數(shù)植物而言，應在其開始生長或生長旺季采樣。 此時材料內(nèi)源激素含量高，容易分化，不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高。5、外植體來源要豐富、易得；6、外植體要易于滅菌選擇帶雜菌少的幼嫩器官或組織，以降低初代培養(yǎng)的污染率。（二）外植體的滅菌在材料接種培養(yǎng)前，必須要進行滅

49、菌處理。滅菌：一方面要求將材料表面上的各種微生物殺滅，同時又不能損傷，或只輕微損傷組織材料，而不影響其生長。1、 常用的滅菌劑 理想的滅菌劑：應具有消毒效果好，易被無菌水沖洗掉或能自行分解，對材料損傷小，對人體及其它生物無害，來源廣泛，價格低廉。（1）酒精：以70%75%酒精，滅菌效果最好。（2）升汞：又稱氯化汞。 2、 滅菌方法（外植體類型） （1）莖尖、莖段及葉片等的滅菌滅菌時先用70%酒精浸泡1030 s，以無菌水沖洗23次，然后按材料的老、嫩，和枝條的堅實程度，分別采用2%次氯酸鈉浸泡1015 min，或用0.1%升汞浸泡510 min。（2）果實及種子的滅菌先用自來水沖洗1020 m

50、in，再用酒精迅速漂洗一下。果實用2%次氯酸鈉浸10 min，后用無菌水沖洗23次；種子則先用10%次氯酸鈉浸泡2030 min，難以滅菌的可用0.1%升汞滅菌510 min。對于種皮太硬的種子，也可預先去掉種皮，再用4%次氯酸鈉浸泡810 min。 （3）花藥的滅菌 將整個花蕾或幼穗用70% 酒精浸泡數(shù)秒鐘，然后用無菌水沖洗23 次， 再在漂白粉中浸泡10 min ，最后用無菌水沖洗23 次。 >（4）根及地下部器官的滅菌 先用自來水沖洗、軟毛刷刷洗，用刀切去損傷及污染嚴重部位， 再用酒精漂洗后，置于0.1% 升汞中浸510 min ， 或2% 次氯酸鈉中浸1015 min ， 最后用

51、無菌水沖洗3 次。2、 滅菌方法（分類及原則） （1）方法分類 物理方法干熱（烘箱烘烤，或火焰灼燒）；濕熱（蒸煮，或高壓蒸煮）；過濾（抽濾，或注射過濾）；輻射處理（紫外線等）；微波處理（微波爐等）等。 化學方法滅菌劑（乙醇、升汞HgCl2、次氯酸鈉、次氯酸鈣等溶液）浸泡；高錳酸鉀熏蒸等。 （2）一般原則 培養(yǎng)基用濕熱滅菌（121，20min）； 無菌水、栽培基質(zhì)、紗布棉花、工作服等用濕熱滅菌（121 ，或20 min）； 不耐熱物質(zhì)（例如IAA、GA3等）用過濾除菌（濾膜孔徑0.45或0.22m）； 耐熱用具用干熱滅菌（烘箱160180 ，90 min）； 注射過濾器具等耐熱塑料制品先用高壓蒸

52、煮濕熱滅菌，再用70%乙醇滅菌劑浸泡滅菌； 接種用具先用高壓蒸煮濕熱滅菌，再用95%乙醇浸泡火焰灼燒干熱滅菌； 緩沖間和接種室用高錳酸鉀熏蒸、紫外燈照射滅菌；由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2 m為宜。 超凈臺用紫外燈照射工作空間及用70%乙醇滅菌劑噴、擦工作臺面滅菌。（三）外植體的接種1、無菌操作規(guī)程無菌操作質(zhì)量的高低決定了組織培養(yǎng)的成敗。組培的工序中無菌操作的環(huán)節(jié)很多，材料切割、莖尖剝離、材料轉(zhuǎn)接、封口等各個環(huán)節(jié)均要求規(guī)范、準確、迅速，任何一步做不好，就會導致失敗。2、材料的分離、切割和接種較大的材料，肉眼觀察即可操作分離；較小的

53、材料，需要在解剖鏡下放大操作。分離工具要鋒利，切割動作要快，培養(yǎng)材料在培養(yǎng)容器內(nèi)的分布要均勻，以保證必要的營養(yǎng)面積和光照條件。將莖段基部插入固體培養(yǎng)基中，將莖尖下端置于培養(yǎng)基表面，將葉片葉背接觸培養(yǎng)基。接完，標記：材料、處理、接種日期等。 （四）污染及其對策污染是指在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基或培養(yǎng)材料上滋生真菌、細菌等微生物，使培養(yǎng)材料不能正常生長和發(fā)育的現(xiàn)象。常見的污染病原主要是細菌和真菌兩大類：細菌污染常在接種12 d后表現(xiàn)，培養(yǎng)基表面出現(xiàn)黏液狀菌斑；真菌污染一般在接種3 d以后才表現(xiàn)，主要癥狀是培養(yǎng)基上出現(xiàn)絨毛狀菌絲，然后形成不同顏色的孢子層。1、污染原因造成污染的原因也很多，主要有： 培養(yǎng)基

54、及各種使用器具滅菌不徹底； 外植體滅菌不徹底； 接種時未嚴格無菌操作； 接種和培養(yǎng)環(huán)境不清潔； 培養(yǎng)容器破損。2、污染的對策（1）滅菌要徹底在組培生產(chǎn)中，各種培養(yǎng)基，以及接種過程中使用的各種器具都要嚴格滅菌。 （2）選擇適當?shù)耐庵搀w要認真地選擇外植體，減少外植體上的帶菌量。 （3）外植體滅菌對于外生菌：可以通過表面滅菌方法殺滅；對于內(nèi)生菌：首先將欲取材的植株或枝條放在溫室或無菌培養(yǎng)室內(nèi)預培養(yǎng)，再在培養(yǎng)液中添加一些抗生素或滅菌劑。（4）環(huán)境滅菌對接種室和培養(yǎng)室，可采用紫外燈照射滅菌，或噴滅菌劑滅菌。 （5）嚴格無菌操作（五）褐變及其對策褐變，是指在組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，

55、致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，培養(yǎng)材料也隨之慢慢變褐而死亡的現(xiàn)象。1 、褐變的原因 當外植體切割后，切口附近細胞的分割效應被打破，酚類化合物被多酚氧化酶氧化形成褐色的醌類化合物，醌類化合物又會在酪氨酸酶的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進一步引起其它酶系統(tǒng)失活，導致組織代謝紊亂，生長受阻，最終逐漸死亡。 >2、影響褐變的因素（1）植物基因型一般木本植物的酚類化合物含量，比草本植物高，更易發(fā)生褐變現(xiàn)象。 （2）外植體的生理狀態(tài)一般外植體的老化程度越高，其木質(zhì)素的含量也越高，也就越容易褐變。切口越大，酚類物質(zhì)的被氧化面也越大，褐變程度就會更嚴重。（3）取材時間和部位冬、春季取材，褐變死亡率

56、最低；夏季取材，很容易褐變。在取材部位上，幼嫩莖尖，比其它部位褐變程度低。（4）培養(yǎng)基在初代培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中無機鹽濃度過高，易引起酚類物質(zhì)大量產(chǎn)生，導致褐變。BA和KT，不僅促進酚類化合物合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增加褐變；而生長素類，例如：NAA和2,4-D可延緩多酚合成，減輕褐變。（5）光照將接種后的初代培養(yǎng)材料，在黑暗條件下培養(yǎng)，對抑制褐變發(fā)生有一定效果。（6）溫度高溫能促進酚氧化，培養(yǎng)溫度越高，褐變越嚴重；而低溫可抑制酚類化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，從而減輕褐變。（7）培養(yǎng)時間 材料培養(yǎng)時間過長，易引起褐變物的積累，加重對培養(yǎng)材料的傷害。 >3、褐變的對策（1）選擇適當?shù)耐庵搀w選擇適當?shù)耐庵搀w，是克服褐變的重要手段。避免在夏季高溫季節(jié)取材；選擇幼苗、褐變程度輕的品種和部位，作為外植體。 （2）外植體預處理先用流水沖洗外植體，然后置于5 左右的冰箱中，低溫處理1214 h。 （3）篩選合適的培養(yǎng)