僅供參考~分子生物學(xué)復(fù)習(xí)

1、第二章 染色體與DNA（一）真核細(xì)胞染色體與原核細(xì)胞染色體的主要區(qū)別：比較項(xiàng)目真核細(xì)胞染色體原核細(xì)胞染色體數(shù)量多一般只有一條位置位于細(xì)胞核的核仁位于擬核組成方式真核染色體的DNA與蛋白質(zhì)完全融合在一起原核染色體外裹著稀疏的蛋白質(zhì)（二）原核生物與真核生物基因組的特點(diǎn)原核生物：1.結(jié)構(gòu)簡練；2.存在轉(zhuǎn)錄單元：多順反子；3.有重疊基因真核生物:1. 含有大量重復(fù)序列：不重復(fù)序列：只有一個(gè)或幾個(gè)拷貝，多為結(jié)構(gòu)基因，功能基因中度重復(fù)序列：重復(fù)101000個(gè)拷貝，rRNA、tRNA及一些結(jié)構(gòu)基因。高度重復(fù)序列：衛(wèi)星DNA、反向重復(fù)序列等，不轉(zhuǎn)錄。 2.功能DNA序列大多被非功能DNA所隔開（外顯子和內(nèi)含子

2、）3.存在C值矛盾（三） 染色體的組裝1.核小體的組成成分？由核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4各兩分子生成的八聚體和由200bp的DNA組成。 2.核小體是如何一步一步組裝成染色體的？整個(gè)過程中的壓縮情況如何？ 形成核小體后,其長度被壓縮了7倍形成螺線管后,DNA長度又被壓縮了6倍由螺線管形成超螺線管后,DNA的長度又被壓縮了40倍形成染色單體后,DNA的長度又被壓縮了5倍。因此由一條DNA長鏈,經(jīng)過多級螺旋化,可以使幾厘米長的DNA與組蛋白等物質(zhì)共同形成幾微米長的染色體,其長度總共被壓縮了800010000倍。 （四）DNA復(fù)制的幾個(gè)基本原則1.半保留復(fù)制：DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA雙

3、螺旋結(jié)構(gòu)解開而成為單鏈，各自作為模板，按照堿基互補(bǔ)原則，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。這樣子代細(xì)胞的DNA雙鏈，其中一股單鏈?zhǔn)菑挠H代完整地接受過來的，另一股單鏈則完全重新合成，兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都與親代DNA堿基序列一致2.半不連續(xù)復(fù)制：在DNA復(fù)制過程中，親代DNA分子中以3 5方向的母鏈作為模板指導(dǎo)新的鏈以5 3 方向連續(xù)合成，另一股以5 3 為方向的母鏈則指導(dǎo)新合成的鏈以 5 3方向合成10002000個(gè)核苷酸長度的許多不連續(xù)的片段（崗崎片段），這種復(fù)制方式稱之為半不連續(xù)復(fù)制。岡崎片段：DNA復(fù)制時(shí)，一股以5 3方向的母鏈作為模板，指導(dǎo)新合成的鏈沿5 3合成10002000個(gè)核苷酸不連續(xù)的小片段

4、稱之為崗崎片段。崗崎片段由DNA連接酶連成一條完整的新鏈。前導(dǎo)鏈：DNA復(fù)制時(shí)，一股以3 5方向的母鏈作為模板，指導(dǎo)新合成的鏈以5 3方向連續(xù)合成的鏈稱為前導(dǎo)鏈。（復(fù)制方向與解鏈方向一致）隨從鏈：DNA復(fù)制時(shí)，一股以5 3方向的母鏈作為模板，指導(dǎo)新合成的鏈沿5 3合成，10002000個(gè)核苷酸不連續(xù)的小片段的鏈稱為隨從鏈。（復(fù)制方向與解鏈方向相反)3.RNA引物：提供3-OH，減少突變，提高DNA復(fù)制的真實(shí)性4.復(fù)制的真實(shí)性的保證：DNA的半保留復(fù)制；遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；復(fù)制出錯(cuò)時(shí)有即時(shí)的校讀功能(3 5外切酶功能）；DNA損傷的修復(fù)機(jī)制；RNA引物（DNA復(fù)制開始時(shí)摻入的核苷酸往往容易出

5、錯(cuò)，加在RNA引物中可以被切除，不會(huì)影響DNA的準(zhǔn)確性 ）（一）DNA復(fù)制過程（原核生物為例，掌握過程）（起始、延長、終止）1.確定復(fù)制的起始點(diǎn)復(fù)制有固定的起始點(diǎn)，稱為ori；oriC的跨度為245 bp，有特定的堿基順序3組串聯(lián)重復(fù)序列識別區(qū)；2對反向重復(fù)序列AT rich區(qū)（容易解鏈）2.解開雙鏈DNA,提供單鏈DNA模板DNA解成單鏈，提供模板形成引發(fā)體及合成引物提供3-OH末端解鏈過程：由拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用下解開負(fù)超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點(diǎn)處解開雙鏈；SSB在一定時(shí)間內(nèi)使復(fù)制叉保持適當(dāng)長度，穩(wěn)定解開的單鏈。3.形成復(fù)制叉：復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA要解開成兩股鏈分別進(jìn)行，所以，這個(gè)

6、復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，被稱為復(fù)制叉。4.DNA合成的起始和延長：DNA合成的起始：拓?fù)洚悩?gòu)酶松馳螺旋引發(fā)體和引物：復(fù)制過程需要引物 短鏈RNA；引發(fā)前體與六種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，并與引發(fā)酶共同形成引發(fā)體。在適當(dāng)位置上，引物酶依據(jù)模板的堿基序列，從5 ® 3 方向催化NTP聚合，生成短鏈RNA引物DNA-pol 催化下，引物的3-OH末端與新鏈的第一個(gè)dNTP形成磷酸二酯鍵，開始復(fù)制。復(fù)制的延長：指在DNA-pol的催化下，以母代單鏈DNA為模板，按照堿基互補(bǔ)原則，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入而延長子代DNA新鏈，其化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì)是生成磷酸二酯鍵。5.形成帶有新合成的DNA片段的復(fù)

7、制泡6.復(fù)制的終止：去除RNA引物DNA聚合酶的小片段5 3外切酶補(bǔ)充空缺DNA聚合酶的大片段3 5外切酶； 5 3聚合酶連接DNA連接酶 （二）解開成單鏈的過程中，拓?fù)洚悩?gòu)酶、解旋酶和單鏈結(jié)合蛋白分別起什么作用？ 1拓?fù)洚悩?gòu)酶I：切斷DNA單鏈和解旋后或再螺旋后連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。 拓?fù)洚悩?gòu)酶II：切斷DNA雙鏈和解旋后或再螺旋后連接，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子，同復(fù)制有關(guān)。2解旋酶：解開DNA雙鏈，每個(gè)bp消耗2個(gè)ATP3單鏈結(jié)合蛋白（SSB）：與單鏈DNA結(jié)合,維持單鏈狀態(tài) ，使其不受核酸酶水解，避免單鏈DNA自身發(fā)夾螺旋形成，使前端螺旋易解開

8、。復(fù)制叉：復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA要解開成兩股鏈分別進(jìn)行，所以，這個(gè)復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，被稱為復(fù)制叉復(fù)制子：DNA的復(fù)制是由固定的起始點(diǎn)開始的。一般把生物體的復(fù)制單位稱為復(fù)制子。一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。無論是原核生物還是真核生物，DNA的復(fù)制主要是從固定的起始點(diǎn)以雙向等速復(fù)制方式進(jìn)行的。 線性DNA雙鏈的復(fù)制和環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制的常見復(fù)制類型 （三）大腸桿菌的DNA聚合酶I和III的特點(diǎn)DNA聚合酶IDNA聚合酶III多功能酶 53外切酶53外切酶53聚合酶多功能酶53聚合酶 35外切酶單鏈多肽大小二個(gè)片段不對稱二聚體切除RNA引物，填補(bǔ)空缺損傷后修復(fù)DNA 復(fù)制的主要酶高續(xù)進(jìn)性高聚合酶活

9、性高產(chǎn)物真實(shí)性端粒： 位于真核生物染色體末端（一條鏈的3¢-OH），由蛋白質(zhì)和DNA（人類：“TTAGGG”重復(fù)序列）緊密結(jié)合的結(jié)構(gòu)。特征: 3端是由數(shù)百個(gè)串聯(lián)重復(fù)G豐富的6個(gè)核苷酸組成端粒酶（唯一攜帶RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄酶）：防止端粒縮短的酶，能不斷地延長染色體末端已縮短的端粒，由蛋白質(zhì)(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板)組成。端粒復(fù)制過程：本身提供RNA模板，再逆轉(zhuǎn)錄，延長母鏈，然后反皺-爬行模型（四）DNA的損傷修復(fù)1. DNA損傷原因：復(fù)制錯(cuò)誤、DNA重組、物理化學(xué)因子損傷部位：堿基、戊糖或是磷酸二酯鍵2DNA損傷修復(fù)的類型：錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、

10、DNA直接修復(fù)DNA轉(zhuǎn)座：一段DNA順序可以從原位上單獨(dú)復(fù)制或斷裂下來，環(huán)化后插入另一位點(diǎn)，并對其后的基因起調(diào)控作用，此過程稱轉(zhuǎn)座。這段序列稱跳躍基因或轉(zhuǎn)座子。麥克林托克(B. McClintock)因首先在玉米中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座因子而獲得了1983年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。轉(zhuǎn)座子的種類：插入序列、類插入序列、復(fù)合轉(zhuǎn)座子、 TnA家族 第三章 生物信息的傳遞(上) 轉(zhuǎn)錄（從DNA-RNA）基本概念：轉(zhuǎn)錄：生物體以DNA的一條鏈為模板，按照堿基配對原則，在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下合成一條與DNA鏈的一定區(qū)段互補(bǔ)的RNA鏈，這個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)錄。編碼鏈：與RNA序列相同的那條DNA鏈，又稱正(+) 鏈、有意義鏈

11、模板鏈：指導(dǎo)RNA合成的DNA鏈稱，又稱負(fù)(-)鏈 、反意義鏈不對稱轉(zhuǎn)錄：在多基因的雙鏈DNA分子中，每個(gè)基因的模板不是全在同一條鏈上，也就是在雙鏈DNA分子中的一條鏈，對于某基因是有義鏈，但對另一個(gè)基因則可能是反義鏈。這就是我們所說的不對稱轉(zhuǎn)錄，即模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。不對稱轉(zhuǎn)錄。它有兩方面含義：一是在DNA雙鏈分子上，相對某基因來說，一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；其二是模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上一、幾種類型的RNA：含量及作用1，信使RNA(mRNA)：它占全部RNA的5%左右。大腸桿菌中占總RNA的2%。2，轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)：tRNA在全部RNA中約占15%，種類在40種以

12、上3，核糖體RNA(rRNA)： rRNA一般與核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成核糖體。在大腸桿 菌中，rRNA占細(xì)胞總RNA的75%85% 。除了上述3種主要的RNA外，還有一些類型的RNA 二、轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制的異同 相同：模板，新鏈延伸方向，堿基的加入原則。相異：引物。信息全保留與信息半保留。底物、與T配對的堿基模板的數(shù)量（一條與兩條）。所需要的酶，及酶的外切活性的有無。三、大腸桿菌RNA聚合酶的組成1，E. coli RNA聚合酶的核酶：由2 組成。作用：參與轉(zhuǎn)錄的全過程，但不能精確起始2. E. coli RNA聚合酶的全酶：核酶因子因子負(fù)責(zé)模板鏈的選擇與轉(zhuǎn)錄的起始。不僅能增加聚合酶對啟動(dòng)

13、子的親和力，還降低它對非專一位點(diǎn)的親和力。 功能 2個(gè)亞基 決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄 核心酶 1個(gè)亞基 結(jié)合底物，形成磷酸二酯間（催化）全酶 1個(gè)亞基 結(jié)合模板（開鏈）1個(gè)亞基 識別起始點(diǎn)啟動(dòng)子(延長是脫落) RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別 RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8×105dol小，1.09×105dol引物無有產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時(shí)進(jìn)行外切酶活性無5 33 5校對合成能力無有修復(fù)能力無有相關(guān)概念：啟動(dòng)子：位于結(jié)構(gòu)基因5，端上游的一段DNA序列，能被RNA聚合酶識別,結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列

14、轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)：指RNA開始轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基，此點(diǎn)通常用+1表示上游：轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的左側(cè)，用負(fù)的數(shù)碼表示 下游：轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)右側(cè)（轉(zhuǎn)錄區(qū)），用正的數(shù)碼表示 轉(zhuǎn)錄單元(transcription unit)：一段從啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的DNA序列.在細(xì)菌中，一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元可以是一個(gè)基因，也可以是幾個(gè)基因。 足跡法與啟動(dòng)子: 啟動(dòng)子是RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。利用DNase 足跡法和DNA測序法可以確定啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)。DNase 足跡法的基本原理與DNA 化學(xué)測序法有些相似. 首先將待測雙鏈DNA 片段中一條單鏈的一端選擇性地進(jìn)行末端標(biāo)記, 然后加入恰當(dāng)濃度的DNase , 使在DNA

15、 鏈上隨機(jī)形成缺口, 經(jīng)變性后電泳分離, 放射自顯影, 即可形成以相差一個(gè)核苷酸為梯度的DNA 條帶. 但當(dāng)DNA 片段與相應(yīng)的序列特異性DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合后, DNA 結(jié)合蛋白可保護(hù)相應(yīng)的DNA 序列不受DNase 的攻擊, 因而在放射自顯影圖譜上, DNA 梯度條帶在相應(yīng)于DNA 結(jié)合蛋白的結(jié)合區(qū)域中斷, 從而形成一空白區(qū)域, 恰似蛋白質(zhì)在DNA 上留下的足跡,因而被形象地稱作足跡法. 如果同時(shí)進(jìn)行DNA 化學(xué)測序, 即可判斷出結(jié)合區(qū)的精確順序。原核生物啟動(dòng)子基本結(jié)構(gòu)：原核生物中經(jīng)對啟動(dòng)子的比較，它們有共有序列：在上游10bp處為TATAAT，又稱為Pribnow盒在上游35bp處為TT

16、GACA，又稱為sextama盒典型原核啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)RNA聚合酶 主要接觸位點(diǎn) -35區(qū)-10區(qū) TTGACA16-17bpTATAAT5-9bp轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 決定啟動(dòng)子的強(qiáng)度 保守序列 AT含量多，有利于DNA雙鏈解鏈原核啟動(dòng)子保守區(qū)的功能：1，sextama box(-35區(qū))：RNA聚合酶識別位點(diǎn)，該序列提供了RNA聚合酶識別的信號。 亞基識別-35序列，為轉(zhuǎn)錄選擇模板。這一序列的核苷酸結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度。2，Pribnow box（-10區(qū)）： RNA聚合酶牢固結(jié)合位點(diǎn)，此處AT含量多，有助于DNA局部雙鏈解開。是使起始復(fù)合物由關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)變成啟動(dòng)狀態(tài)的特定序列-10區(qū)序

17、列對轉(zhuǎn)錄的效率影響:TATAATAATAAT，轉(zhuǎn)錄效率下降,稱為下降突變（down mutation）。TATGTTTATATT，轉(zhuǎn)錄效率上升，為上升突變（up mutation）。由于堿基的改變可能導(dǎo)致DNA雙鏈的雙螺旋發(fā)生改變，最終導(dǎo)致酶與DNA結(jié)合所需要的自由能增加或者降低，從而使轉(zhuǎn)錄的效率上升或者下降四、轉(zhuǎn)錄的基本過程：1.啟動(dòng)子的識別 2.轉(zhuǎn)錄起始 3.RNA鏈的延伸 4.終止啟動(dòng)子識別、轉(zhuǎn)錄的起始：1.全酶與模板的DNA接觸，生成非專一的,不穩(wěn)定的復(fù)合物在模板上移動(dòng)。2. 起始識別：全酶與35序列結(jié)合，產(chǎn)生封閉的酶-啟動(dòng)子二元復(fù)合物。3.全酶緊密地結(jié)合在-10序列處，模板DNA局部

18、變性，形成開放的啟動(dòng)子二元復(fù)合體；4. 酶移動(dòng)到起點(diǎn)，第一和二個(gè)NTP相連，因子釋放,形成酶-啟動(dòng)子-NTP三元復(fù)合物轉(zhuǎn)錄的延伸：延伸的過程中，RNA聚合酶沿著轉(zhuǎn)錄泡（DNA雙鏈解開而形成，約18堿基對）向前移動(dòng)。轉(zhuǎn)錄泡：在轉(zhuǎn)錄延長過程中，由局部打開的DNA雙鏈、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者結(jié)合在一起的復(fù)合體，為空泡狀結(jié)構(gòu)，又稱轉(zhuǎn)錄復(fù)合。轉(zhuǎn)錄的終止：1不依賴于(rho)因子 的終止（強(qiáng)終止子）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(1) 有富含GC的二重對稱區(qū)；(2)莖的區(qū)域富內(nèi)含G-C；(3) 強(qiáng)終止子3端上有poly(U) ，一般為6個(gè)強(qiáng)終止子終止轉(zhuǎn)錄的機(jī)制：（1）發(fā)夾結(jié)構(gòu)改變RNA聚合酶構(gòu)象，使酶停止移動(dòng)

19、；（2）DNA、RNA各自形成自身雙鏈?zhǔn)闺s交體不穩(wěn)定而分離；（3）3´端一連串U，UA配對最不穩(wěn)定，易從模板上脫落。2依賴于因子的終止結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(1)轉(zhuǎn)錄的RNA也具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但發(fā)夾結(jié)構(gòu)后無poly(U)；(2)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)較疏松，莖環(huán)上不富含GC；(3)終止需要因子的參與；（4）與不依賴于因子的終止一樣，終止信號存在于新生的RNA鏈上而非DNA鏈上。五、真核生物的轉(zhuǎn)錄和原核轉(zhuǎn)錄的不同點(diǎn)：（1） 原核只有一種RNA聚合酶，而真核細(xì)胞有三種聚合酶；（2）啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，真核有三種不同的啟動(dòng)子和有關(guān)的元件；（3） 真核的轉(zhuǎn)錄有很多蛋白質(zhì)因子的介入。真核生物啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu)：-8

20、0-110區(qū) 75區(qū) -25區(qū) +1 GC box CAAT box TATA box 起始位點(diǎn)1核心啟動(dòng)子：指保證RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的，最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)l錄起始位點(diǎn)及起始位點(diǎn)上游的TATA盒。核心啟動(dòng)子單獨(dú)起作用時(shí)，只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)： mRNA的第一個(gè)堿基傾向A TATA框： 其一致序列是T85A97T93A85A63A83A50，TATA框的作用：(1) 選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證精確起始，故也稱為選擇子。(2) 影響轉(zhuǎn)錄的速率。2真核生物的上游啟動(dòng)子元件包括通常位于75 bp 附近的CAAT box（相當(dāng)于原核啟動(dòng)子的sextama

21、box）和GC box作用：控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定六、真核mRNA前體的加工真核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄后加工步驟：（1）加帽5端：m7GpppGpN帽子（甲基化的鳥苷酸）的類型：在末端鳥苷的第7位上存在單個(gè)甲基化位點(diǎn)的稱O型帽子在次末端核苷酸的核糖上的2-0H位點(diǎn)上還有一個(gè)甲基位點(diǎn)的稱1型帽子此外，在第三個(gè)核苷酸的核糖上（2-0H）有甲基化位點(diǎn)的稱2型帽子 這三種帽子都有特殊面對面核苷酸結(jié)構(gòu) 帽子結(jié)構(gòu)的功能：(1)有助于mRNA越過核膜，進(jìn)入胞質(zhì)；(2)保護(hù)5'不被酶降解；(3)翻譯時(shí)供IF（起始因子）和核糖體識別。（2）加尾3端：polyA尾巴過程：1.特殊組分(C

22、PSF)識別AAUAAA并指導(dǎo)其它的活性2.剪切因子(CF)在加尾位點(diǎn) AAUAAA下游1130nt 處剪切RNA；3.末端腺苷轉(zhuǎn)移酶poly(A)聚合酶合成poly(A)尾巴；4.PBP（poly A結(jié)合蛋白）與poly(A)結(jié)合，反應(yīng)停止。尾巴的功能：1.PolyA是mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式。2.PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。 （3）mRNA前體的剪接剪除內(nèi)含子，連接外顯子選擇性剪接：基因的初始轉(zhuǎn)錄物通過不同的剪接方式而實(shí)現(xiàn)的外顯子的選擇性使用。選擇性剪接可以利用同一初級轉(zhuǎn)錄物得到不同的mRNA，翻譯成不同的蛋白質(zhì)。在人類基因中大約有的基因具有選擇性剪接的形式選擇性剪

23、接的意義：1，選擇性剪接極大地增加了蛋白質(zhì)的多樣性和基因表達(dá)的復(fù)雜程度2，性別決定與發(fā)育：選擇性剪接可以調(diào)節(jié)決定性別及發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá)3，許多疾病與mRNA前代選擇性剪接有關(guān)RNA編輯：是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入，丟失或轉(zhuǎn)換等現(xiàn)象。它導(dǎo)致了DNA所編碼的遺傳信息的改變。形式：，單堿基突變，尿苷酸的缺失和添加原核生物和真核生物mRNA的不同比較類別原核生物真核生物轉(zhuǎn)錄發(fā)生的場所類核/擬核核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的形式多順反子，有操縱子單順反子，無操縱子轉(zhuǎn)錄所需要蛋白質(zhì)RNA聚合酶聚合酶加大量輔助因子轉(zhuǎn)錄后是否需要加工不需加工與翻譯相偶聯(lián)需加工故與翻譯相分離mRNA的壽命短較長第四章 生物信息的傳

24、遞（下）1，翻譯：以mRNA為模板，按照mRNA分子上的三個(gè)核苷酸決定一種氨基酸的規(guī)則（三聯(lián)體密碼）合成具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)。包括翻譯的起始、肽鏈的延伸、肽鏈的終止與釋放。2，核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所，mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）是模板與氨基酸之間的接合體。此外，在合成的各個(gè)階段還有許多蛋白質(zhì)、酶和其他生物大分子參與。實(shí)驗(yàn)證實(shí)三聯(lián)子密碼（遺傳學(xué)證據(jù)）：1、mRNA模板中插入、刪除一個(gè)核苷酸后，該密碼子后面的氨基酸序列全部改變。2、同時(shí)插入、刪除一個(gè)不同核苷酸后，后續(xù)蛋白質(zhì)不變。3、同時(shí)刪除三個(gè)核苷酸后，翻譯減少一個(gè)氨基酸，序列沒有變化。 煙草花葉病毒外殼蛋白亞基由4

25、00個(gè)氨基酸組成，而相應(yīng)的RNA片段長約1200個(gè)核苷酸實(shí)驗(yàn)破譯三聯(lián)子密碼：一，以均聚物、隨機(jī)共聚物和特定序列的共聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成二，核糖體結(jié)合技術(shù)/三聯(lián)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)操作： 以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等為模板，在含核糖體、AA-tRNA的適當(dāng)離子強(qiáng)度的反應(yīng)液中保溫，然后使反應(yīng)液通過硝酸纖維素濾膜。游離的AA-tRNA因相對分子質(zhì)量小能自由通過濾膜，加入三核苷酸模板可以促使其對應(yīng)的AA-tRNA結(jié)合到核糖體上，體積超過膜上的微孔而被滯留，這樣就能把已結(jié)合到核糖體上的AA-tRNA與未結(jié)合的AA-tRNA分開。（一）遺傳密碼的性質(zhì)一、遺傳密碼的簡并性：1 簡并：個(gè)

26、氨基酸有多個(gè)密碼子的現(xiàn)象或多個(gè)密碼子為1個(gè)氨基酸編碼。 2編碼同一種氨基酸的密碼子稱同義密碼子 3 簡并性減少變異對生物的影響二、密碼子的普遍性與特殊性：遺傳密碼無論在體內(nèi)還是體外，也無論是對病毒、細(xì)菌、動(dòng)物還是植物而言都是適用的，所以，密碼子具有普遍性。已經(jīng)查明，在支原體中，終止密碼子UGA被用來編碼色氨酸；在嗜熱四膜蟲中，另一個(gè)終止密碼子UAA被用來編碼谷氨酰胺。密碼子具有特殊性。三、密碼子的變偶性： 即在密碼子與反密碼子配對時(shí)，前面兩對堿基嚴(yán)格按堿基配對原則，而第三時(shí)堿基允許有一定的自由度擺動(dòng)假說，變偶假說。 密碼子的第三位堿基比前三個(gè)堿基具有較小的專一性。四、密碼子無標(biāo)點(diǎn)、不重疊（二）

27、tRNA(第二遺傳密碼)tRNA在蛋白質(zhì)合成中處于關(guān)鍵地位，它不但為每個(gè)三聯(lián)密碼子翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準(zhǔn)確無誤地將所需氨基酸運(yùn)送到核糖體上提供了運(yùn)送載體。1 tRNA的三葉草型二級結(jié)構(gòu)：五臂四環(huán)tRNA的三級結(jié)構(gòu)：L型2 tRNA的功能：識別mRNA鏈上的密碼子；轉(zhuǎn)移氨基酸作用3 tRNA的分類：（1）起始tRNA和延伸tRNA：能特異地識別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA：代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA，同工t

28、RNA既要有不同的反密碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被AA- tRNA合成酶識別。（3）校正tRNA：分為無義突變及錯(cuò)義突變校正tRNA 。無義突變：在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個(gè)核苷酸的改變可能使代表某個(gè)氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。錯(cuò)義突變：是由于結(jié)構(gòu)基因中某個(gè)核苷酸的變化使一種氨基酸的密碼變成另一種氨基酸的密碼。錯(cuò)義突變的校正tRNA通過反密碼子區(qū)的改變把正確的氨基酸加到肽鏈上，合成正常的蛋白質(zhì)。校正tRNA在進(jìn)行校正過程中必須與正常的tRNA競爭結(jié)合密碼子。無

29、義突變的校正tRNA必須與釋放因子競爭識別密碼子；錯(cuò)義突變的校正tRNA必須與該密碼的正常tRNA競爭，都會(huì)影響校正的效率。（三）核糖體核糖核蛋白的結(jié)構(gòu)：1 由大小二亞基組成 2 給位（P位，肽位）： 起始時(shí)， tRNAimet結(jié)合于核糖體的肽位延長成肽后，肽鏈轉(zhuǎn)到此位。3 受位（A位，氨基酰位）：延長成肽時(shí)，氨基酰tRNA就加入此位。核糖核蛋白的種類(胞質(zhì)中)4 游離的核糖核蛋白-合成細(xì)胞固有蛋白 5 與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的核糖核蛋白-合成帶有信號肽的分泌性蛋白質(zhì)原核與真核生物中核糖體的組成分別怎樣？原核生物核糖體：由2/3的RNA及1/3蛋白質(zhì)組成，核糖體的大小為70S，可分為30S小亞基和5

30、0S大亞基。真核生物核糖體：由3/5的RNA及2/5蛋白質(zhì)組成，核糖體的大小為80S，可分為40S小亞基和60S大亞基。（四）蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機(jī)制1 氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)酶tRNA合成酶絕對專一性 1個(gè)A.A1個(gè)氨基酰tRNA合成酶催化反應(yīng)活化A.A-活化“-COOH”消耗2個(gè)ATP活化A.A+tRNA 氨基酰tRNA2 肽鏈合成的起始原核生物的起始tRNA是fMet-tRNAfMet，而真核生物是Met-tRNAiMet。原核生物中30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大亞基結(jié)合。而在真核生物中，40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結(jié)合，

31、再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大亞基結(jié)合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始復(fù)合物。起始復(fù)合物的生成除了需要GTP提供能量外，還需要Mg2+、NH4+及3個(gè)起始因子（IF-1、IF-2、IF-3）。 真核生物蛋白質(zhì)生物合成的起始機(jī)制與原核生物基本相同，其差異主要是核糖體較大，有較多的起始因子參與，其mRNA具有m7GpppNp帽子結(jié)構(gòu)，Met-tRNAMet不甲?；琺RNA分子5' 端的“帽子”和3' 端的多聚A都參與形成翻譯起始復(fù)合物。3 肽鏈的延伸生成起始復(fù)合物，第一個(gè)氨基酸（fMet/Met-tRNA）與核糖體結(jié)合以后，肽鏈開始伸長。

32、按照mRNA模板密碼子的排列，氨基酸通過新生肽鍵的方式被有序地結(jié)合上去。肽鏈延伸由許多循環(huán)組成，每加一個(gè)氨基酸就是一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括AA-tRNA與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和移位、無負(fù)載的tRNA 的脫落。 肽鏈延伸的具體過程：1）后續(xù)AA-tRNA與核糖體結(jié)合（進(jìn)位）、2）肽鍵的生成(轉(zhuǎn)肽)、3）移位、4）脫落4 肽鏈的終止  肽鏈的延伸過程中，當(dāng)終止密碼子UAA、UAG或UGA出現(xiàn)在核糖體的A位時(shí)，沒有相應(yīng)的AA-tRNA能與之結(jié)合，而釋放因子能識別這些密碼子并與之結(jié)合，水解P位上多肽鏈與tRNA之間的二酯鍵。接著，新生的肽鏈和tRNA從核糖體上釋放，核糖體大、小亞基解體，蛋白

33、質(zhì)合成結(jié)束。釋放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽鏈與核糖體解離。     細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)存在三種不同的終止因子（或稱釋放因子，RF1，RF2，RF3），RF1能識別UAG和UAA，RF2識別UGA和UAA。一旦RF與終止密碼相結(jié)合，它們就能誘導(dǎo)肽基轉(zhuǎn)移酶把一個(gè)水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽鏈上。RF3可能與核糖體的解體有關(guān)。真核細(xì)胞只有一個(gè)（RF）終止因子。 (五)蛋白質(zhì)前體的加工新生的多肽鏈大多數(shù)是沒有功能的，必須經(jīng)過加工修飾才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)。 1N端fMet或Met的切除2二硫鍵的形成3特定氨基酸的修飾4切除新生肽鏈中非功能片段蛋白質(zhì)合成

34、抑制劑：    蛋白質(zhì)生物合成的抑制劑主要是一些抗生素，如嘌呤霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素等，此外，如5-甲基色氨酸、環(huán)已亞胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖體滅活蛋白等都能抑制蛋白質(zhì)的合成。1 鏈霉素是一種堿性三糖，能干擾fMet-tRNA與核糖體的結(jié)合，從而阻止蛋白質(zhì)合成的正確起始，也會(huì)導(dǎo)致mRNA的錯(cuò)讀。 2 嘌呤霉素是AA-tRNA的結(jié)構(gòu)類似物，能結(jié)合在核糖體的A位上，抑制AA-tRNA的進(jìn)入，嘌呤霉素是通過提前釋放肽鏈來抑制蛋白質(zhì)合成的 蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制：一般說來，蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)可分為兩大類：翻譯運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制:蛋白質(zhì)的合成和運(yùn)轉(zhuǎn)同時(shí)發(fā)生的翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制：

35、蛋白質(zhì)從核糖體上釋放后才發(fā)生運(yùn)轉(zhuǎn)。 第5-6章分子生物學(xué)的研究法（一）限制性核酸內(nèi)切酶: 是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸水解酶。（只催化非甲基化的DNA的水解，不兼有甲基化酶的活性，修飾由其他酵素進(jìn)行）1.限制性核酸內(nèi)切酶的分類根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為、型三類。其中型較重要，主要特征是主要特征型限制修飾單功能（專一）蛋白結(jié)構(gòu)同源三聚體（單一的亞基）輔助因子反應(yīng)需要Mg2+識別序列48bp回文序列切割為點(diǎn)識別序列內(nèi)或附近特異切割。功能：型限制性核酸內(nèi)切酶有嚴(yán)格的識別、切割順序，識別序列一般為48個(gè)

36、堿基對，具有迴文結(jié)構(gòu)。它以核酸內(nèi)切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5端為P，3端為OH。限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口（5粘性末端、3粘性末端和平頭末端）。2.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)操作大部分II型限制性核酸內(nèi)切酶需要相似反應(yīng)條件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100L Temperature Time 1-1.5h1個(gè)單位限制性核酸內(nèi)切酶：在建議使用的緩沖液及溫度下，在50L反應(yīng)液中反應(yīng)1h，使1g標(biāo)準(zhǔn)DNA完全消化所需的酶

37、量。3.限制性核酸內(nèi)切酶的星活性：指由于反應(yīng)條件改變，酶切的核酸序列不同于它特定的識別序列,即酶切反應(yīng)的特異性發(fā)生了改變。星活性產(chǎn)生的原因如下：反應(yīng)體系中甘油的濃度大于5%。 酶用量過大，大于100U/微克DNA。 低離子強(qiáng)度，小于25mmol/L。 高pH，大于8.0。 含有機(jī)劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價(jià)離子的存在。 常發(fā)生星活性的內(nèi)切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。 （二）DNA分子的連接DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5-磷酸根和3-羥基生成磷酸二酯鍵。這種反應(yīng)需要能量。大腸

38、桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。粘性末端：用DNA連接酶連接 平頭末端：用T4-DNA連接酶連接（三）細(xì)菌轉(zhuǎn)化：是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致遺傳性狀特征發(fā)生改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。步驟：1.將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。2.外源DNA粘附在細(xì)胞表面,形成復(fù)合物。3.立即將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會(huì)被

39、細(xì)胞所吸收。4.在全培養(yǎng)基中生長一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)、細(xì)胞活性恢復(fù)5. 涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。（四）核酸的凝膠電泳1.基本原理：一種帶電分子被放置到電場中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強(qiáng)度、電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)、分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)系。 在一般情況下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子，把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。2.凝膠電泳方法及其分辨力：瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范

40、圍為0.250kb之間 （瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物）。 聚丙烯酰胺凝膠電泳其分辨范圍為1個(gè)堿基對到1000個(gè)堿基對之間 凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。 （五）PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))及其應(yīng)用 概念：在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定DNA序列進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。由多個(gè)循環(huán)組成。每個(gè)循環(huán)包括了變性（95oC 20-30秒）、退火（溫度由引物長度和GC含量決定）以及延伸（70-75oC）三個(gè)階段。能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)

41、增至十萬乃至百萬倍。標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/LPCR中應(yīng)注意的事項(xiàng)（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設(shè)立對照：陽性對照： 陽性模板陰性對照： 陰性模板試劑對照： 除模板外的所有組分（六）基因克隆技術(shù)基因克隆：通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當(dāng)載體,并導(dǎo)入受體細(xì)胞，進(jìn)行永久保存和復(fù)制的過程。具體流程：（一）目的基因的獲取（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接（四）重組DNA導(dǎo)入受

42、體菌（五）重組體的篩選基因克隆技術(shù)具體過程（1）目的基因的獲取方法 1. 化學(xué)合成法（要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列，由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列） 2.基因組DNA文庫(genomic DNA library)：存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。 3. cDNA文庫(cDNA library)：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲(chǔ)存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫。 將帶poly(A)的mRNA經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，再與原核載體連接 制備用于克隆cDNA的mRNA cDN

43、A 的合成和克隆()cDNA 第一鏈的合成: 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈。 自身引導(dǎo)合成法 (）雙鏈 cDNA 的合成(第二條鏈的合成)： 置換合成法 自身引導(dǎo)合成法 ：單鏈cDNA的3端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物，在大腸桿菌聚合酶I Klenow的作用下，合成cDNA的第二鏈。 缺點(diǎn)：在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA 5端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。 S1核酸酶的純度不夠時(shí)，會(huì)偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。置換合成法：以RNA酶H在第一鏈

44、合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二鏈。 優(yōu)點(diǎn)：a）合成cDNA的效率高 b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化 c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA （）雙鏈cDNA分子與載體進(jìn)行連接：將合成的雙鏈重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主細(xì)胞增殖。 RACE技術(shù)獲取全長cDNA序列。（RACE技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends）是一項(xiàng)在已知cDNA序列的基礎(chǔ)上克隆5端或3端缺失序列的技術(shù)。） （）基因文庫的篩選：通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含

45、有所需重組DNA分子的特定克隆過程。（如核酸雜交法、PCR篩選法、免疫篩選法）P176 4. 分離克隆差別表達(dá)的基因：根據(jù)表達(dá)特性的差異可將高等真核生物的基因分為兩大類：一類叫做看家基因，以其組成型表達(dá)模式維持細(xì)胞的基本代謝活動(dòng)；另一類叫做發(fā)育調(diào)控基因，以其時(shí)空特異性表達(dá)模式完成個(gè)體的正常生長、發(fā)育與分化，我們將不同基因在生物個(gè)體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細(xì)胞中發(fā)生的按時(shí)間、空間進(jìn)行有序表達(dá)的方式稱為基因的差別表達(dá)。操作:(a）從不同發(fā)育階段或不同類型的細(xì)胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，合成第一鍵cDNA； （b）用5'隨機(jī)引物和某個(gè)3'

46、端錨定引物對擴(kuò)增第一鏈(摻入32P-dNTP)； (c) DNA變性測序膠分離擴(kuò)增產(chǎn)物，X光片曝光后檢測差別條帶；(d）回收特異性差別條帶；(e）用同一引物對擴(kuò)增已回收的DNA條帶；(f）用Northern，Southern及測序法分析所得的條帶；(g）以該DNA片段做探針，篩選全長cDNA。（2）克隆載體的選擇和構(gòu)建1.載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力為外源基因的擴(kuò)增提供必要的條件 2.載體特點(diǎn) 1) 至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。2) 至少應(yīng)有一個(gè)克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入。3) 至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體

47、或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞 3.載體類型l 質(zhì)粒載體l 噬菌體載體l cosmid克隆載體l 噬菌粒載體l 酵母人工染色體載體l 細(xì)菌人工染色體載體分子克隆載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞的DNA分子（3）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接、(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接2. 平端連接：適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端、粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端3. 同聚物加尾連接： 在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。任何兩條DNA分子，只要分別獲得poly（dA）和poly（dT）尾巴，

48、就會(huì)彼此連接起來。4. 人工接頭(linker)連接：由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 （4）重組DNA導(dǎo)入受體菌受體菌條件：安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài)(competent) （5）重組體的篩選 標(biāo)記基因篩選法 (利用標(biāo)記基因指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞) 根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征的篩選法1）PCR法 2）限制性核酸內(nèi)切酶酶切法 3）DNA測序法 (六) 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理 蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與核酸的相互作用是功能的基礎(chǔ)。酵母雜交就是研究相互作用的方法?；驹恚航湍鸽p雜交系統(tǒng)巧妙地利用了真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式結(jié)

49、構(gòu)（modular）特征，酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域BD 和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。只有當(dāng)他們在空間上接近時(shí)才能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。將編碼待測蛋白的基因分別與編碼BD及編碼AD基因構(gòu)成融合基因，并導(dǎo)入酵母細(xì)胞中。如果待測蛋白間存在相互作用，則轉(zhuǎn)錄因子GAL4發(fā)揮作用，促使報(bào)告基因表達(dá)；如果待測蛋白間不存在相互作用，則轉(zhuǎn)錄因子GAL4不能發(fā)揮作用，報(bào)告基因不表達(dá)。 用途：1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興

50、趣的蛋白質(zhì)基因與BD基因構(gòu)建成“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列，并推測其蛋白質(zhì)序列。（八）核酸雜交技術(shù) 1.Southern Blot 原理：將待檢測的DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小

51、。用途：檢測DNA樣品中的基因及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。 操作步驟：DNA 瓊脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色2.Northern Blot 原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。用途：檢測RNA樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。 操作過程：mRNA提取 甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或化學(xué)發(fā)光（九）RNA 干擾 RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。 RNA

52、i可以作為一種簡單、有效的基因沉默工具，因而在醫(yī)藥開發(fā)、基因治療和功能基因組研究等方面的應(yīng)用得到飛速發(fā)展。 原理： RNAi具有特異性和高效性。是一個(gè)依賴ATP的過程，一種稱為Dicer的核酸酶負(fù)責(zé)將dsRNA酶切轉(zhuǎn)化為3端有23nt突出、長2123bp 的小分子雙鏈RNA ，這種RNA稱為小干擾RNA（siRNA）。siRNA形成之后，與一系列特異性蛋白結(jié)合形成siRNA誘導(dǎo)干擾復(fù)合體(RISC)，此復(fù)合物通過堿基互補(bǔ)配對識別靶mRNA 并使其降解，從而導(dǎo)致特定基因沉默。（十）基因組：1.基因組：生物所具有的攜帶遺傳信息的遺傳物質(zhì)的總和。真核生物基因組：核基因組、線粒體基因組、葉綠體基因組原

53、核生物基因組：染色體、質(zhì)粒2. 基因組作圖：簡單來說，就是把一些分子標(biāo)記在基因組上的位置標(biāo)記出來。分子標(biāo)記是具有特征性的DNA序列。（1）遺傳圖與物理圖 ：遺傳作圖：采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其它DNA順序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。這一方法包括雜交實(shí)驗(yàn)，家系分析等。物理作圖：采用分子生物學(xué)技術(shù)直接將DNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組實(shí)際位置。（2）常用的物理作圖方法： 由于遺傳圖的局限，須用物理圖對其進(jìn)行驗(yàn)證，校正和補(bǔ)充。l 限制性作圖（將限制酶的酶切位點(diǎn)標(biāo)定在DNA分子的相對位置） l 熒光原位雜交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）作圖l 順序標(biāo)簽位點(diǎn)（Sequence tagged site, STS）作圖 序列標(biāo)記位點(diǎn)（STS）作圖· 目前最有效的物理作圖技術(shù)，也是能對大基因組作