固定化酶技術(shù)及應(yīng)用的研究進(jìn)展

1、固定化技術(shù)研究進(jìn)展摘要：固定化酶技術(shù)作為一門交叉學(xué)科技術(shù)，在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、化學(xué)化工及環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。新型載體材料的合成是今后固定化酶發(fā)展的一個(gè)非常重要的研究領(lǐng)域。本文主要介紹了固定化酶的載體，固定化技術(shù)以及在不同行業(yè)的應(yīng)用，主要介紹了在污水處理和醫(yī)療行業(yè)的應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)。關(guān)鍵詞：固定化 載體 污水 醫(yī)療 應(yīng)用酶是重要的生物催化劑，具有專一性強(qiáng)、催化效率高、無污染、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，在制藥、食品、環(huán)保、釀造、能源等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。但在實(shí)際應(yīng)用中，酶也存在許多不足，如大多數(shù)的酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活，不夠穩(wěn)定；與底物和產(chǎn)

2、物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用，這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)；并且分離純化困難，也會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本的提高等。固定化酶技術(shù)(Immobilized enzyme technology)克服了酶的上述不足。酶的固定化是指采用有機(jī)或無機(jī)固體材料作為載體，將酶包埋起來或束縛、限制于載體的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重復(fù)使用的酶化學(xué)方法與技術(shù)。1.傳統(tǒng)酶固定化技術(shù)傳統(tǒng)酶的固定化方法可分為吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等4 種。吸附法是指通過載體表面和酶表面間的次級(jí)鍵相互作用而達(dá)到酶固定化的方法，根據(jù)吸附劑的特點(diǎn)又可分為物理

3、吸附和離子交換吸附。該法具有操作簡(jiǎn)便、條件溫和及吸附劑可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，但也存在吸附力弱，易在不適pH、高鹽濃度、高底物濃度及高溫條件下解吸脫落的缺點(diǎn)。共價(jià)偶聯(lián)法是將酶的活性非必須側(cè)鏈基團(tuán)與載體的功能基通過共價(jià)鍵結(jié)合，故表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，有利于酶的連續(xù)使用，是目前應(yīng)用和研究最為活躍的一類酶固定化方法，但共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)容易使酶變性而失活。交聯(lián)法是利用雙功能或多功能基團(tuán)試劑在酶分子之間交聯(lián)架橋固定化酶的方法，其更易使酶失活。包埋法包括網(wǎng)格包埋、微囊型包埋和脂質(zhì)體包埋等，包埋法中因酶本身不參與化學(xué)結(jié)合反應(yīng)，故可獲得較高的酶活力回收，其缺點(diǎn)是不適用于高分子量底物的傳質(zhì)和用于柱反應(yīng)系統(tǒng)，且常有擴(kuò)散限制等

4、問題。上述各種固定化酶的方法所表現(xiàn)出的不足之處限制了其廣泛應(yīng)用，因此，設(shè)計(jì)和合成性能優(yōu)異的新型酶固定化材料，研制開發(fā)簡(jiǎn)便、實(shí)用的固定化方法是目前固定化酶研究的重點(diǎn)之一。2.新型載體材料及固定化技術(shù)傳統(tǒng)酶的固定化方法雖在一定程度上可以增強(qiáng)生物催化劑的穩(wěn)定性，但增強(qiáng)幅度有待進(jìn)一步提高，并且在此過程中，生物催化劑酶催化活力通常損失嚴(yán)重。運(yùn)用當(dāng)代高新技術(shù)設(shè)計(jì)合成新型載體以及兩者的有機(jī)結(jié)合是引人注目的研究動(dòng)向。因此目前不斷地有新的載體和技術(shù)引入酶的固定化領(lǐng)域，如：無載體固定化、微波/超聲輔助的固定化、微膠囊固定化、電輔助固定化等，且固定化生物催化劑也越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療、生物醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)、食品工業(yè)、

5、化學(xué)工業(yè)、能源等領(lǐng)域。2.1 酶固定化過程中的新載體2.1.1介孔材料孔道的結(jié)構(gòu)和尺寸對(duì)酶活力及穩(wěn)定性有著明顯的影響，在合適的孔道中酶固定化后其活力提高到游離酶的2倍，大孔道有利于固定化與催化過程中酶蛋白和底物、產(chǎn)物的傳輸，從而能提高酶的固定化和催化效果。目前，大孔道、高比表面積和孔容的新型介孔材料不斷被引入酶固定化領(lǐng)域，因?yàn)樵诖罂椎?、高比表面積、高孔容的介孔材料中酶的負(fù)載量大。2.1.2 納米管碳納米管是一種新型納米材料。它是由石墨片層卷曲而成的無縫納米管。將生物大分子，如氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、DNA 等結(jié)合在碳納米管的表面或端口上，可提高它在水溶液中的溶解度，為實(shí)現(xiàn)碳納米管的各種生物應(yīng)用奠定

6、了基礎(chǔ)。納米管的內(nèi)表面與酶之間存在強(qiáng)烈的相互作用，從而使得管內(nèi)酶蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且保留相當(dāng)?shù)拇呋盍?，并且用其制成電極能夠有效實(shí)現(xiàn)底物氧化及電子的傳遞。硅納米管用于固定化酶時(shí)，能夠保持酶的活性，并且提高酶的熱穩(wěn)定性及對(duì)PH的耐受性。2.1.3 磁性高分子微球磁性高分子微球是由無機(jī)磁性納米粒子與有機(jī)高分子通過包埋法、單體聚合法合成的具有磁響應(yīng)性和微球特性的粒子。通過共聚合和表面改性，磁性高分子微球表面可被賦予多種活性功能基團(tuán)（如-OH、-COOH、-CHO等）。無機(jī)磁性納米粒子應(yīng)用較多的是Fe3O4，單體聚合法主要包括乳液聚合、無皂乳液聚合、微乳液聚合、種子乳液聚合。磁性微球有良好的表面效應(yīng)和體積效

7、應(yīng)，如比表面積較大，微球官能團(tuán)密度較高，選擇性吸附能力較強(qiáng)，吸附平衡時(shí)間較短等。它的物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具備一定的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，能耐受一定濃度的酸堿溶液和微生物的降解，通過表面改性賦予多種活性的功能基團(tuán)，這些功能基團(tuán)可以連接生物活性物質(zhì)。2.2新型固定化技術(shù)2.2.1 微波/超聲輔助固定化法微波是一種電磁波。微波加熱的主要原理是介質(zhì)材料的極性分子在微波高頻電場(chǎng)的作用下反復(fù)快速取向轉(zhuǎn)動(dòng)而摩擦生熱，從物質(zhì)內(nèi)部開始，瞬時(shí)達(dá)到需要的溫度。微波加熱具有許多傳統(tǒng)加熱不具備的優(yōu)點(diǎn)等。超聲波是指振動(dòng)頻率大于20 kHz以上的一種縱波，在介質(zhì)中傳播時(shí)，使介質(zhì)發(fā)生物理和化學(xué)變化，從而產(chǎn)生一系列超聲效應(yīng)，包括

8、熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)。研究認(rèn)為，超聲波對(duì)液體化學(xué)反應(yīng)速度和產(chǎn)率的影響主要是由超聲波在液體介質(zhì)中的空化作用引起的。超聲可使液體介質(zhì)中形成微泡，其破裂伴隨能量的釋放，可以提高許多化學(xué)反應(yīng)的速度。到目前為止，超聲波技術(shù)對(duì)物質(zhì)提取，高分子降解，酶解反應(yīng)等都有很好的促進(jìn)作用。2.2.2無載體固定化法無載體固定化酶技術(shù)是通過將結(jié)晶酶、物理共沉淀的酶進(jìn)行交聯(lián)形成固定化酶，包括交聯(lián)酶結(jié)晶（CLEC）、交聯(lián)酶聚集體（CLEA）。交聯(lián)酶聚集體技術(shù)是一種將蛋白質(zhì)先沉淀后交聯(lián)形成不溶性的、穩(wěn)定的固定化酶，這種技術(shù)是通過基本純化的高濃度的蛋白質(zhì)樣品的共價(jià)交聯(lián)來實(shí)現(xiàn)的。2.2.3微膠囊固定化法微膠囊是一種

9、采用高分子聚合物或其他成膜材料將物質(zhì)的微?；蛭⒌伟菜纬傻奈⑿∪萜?，其粒徑一般在微米至毫米級(jí)范圍，通常為5400m。將酶用微膠囊包覆后形成的微膠囊固定化酶，由于被催化物質(zhì)和產(chǎn)物可自由通過囊壁,因而能起到酶催化劑的作用。 3.固定化酶的應(yīng)用 3.1醫(yī)療行業(yè)的應(yīng)用3.1.1 抗生素上應(yīng)用 自20世紀(jì)70年代初，歐美國家已開始用特殊的合成樹脂固定化青霉素酞化酶來生產(chǎn)6 -APA5，但價(jià)格昂貴，酶活還較低。中國關(guān)于固定化青霉素酞化酶的研究工作起步較晚，還要靠進(jìn)口價(jià)格昂貴的固定化載體或固定化青霉素酞化酶來滿足半合成青霉素生產(chǎn)的需要。用于生產(chǎn)內(nèi)酞胺類抗生素中問體青霉素酞化酶在偏堿性環(huán)境下，可以催化青霉素

10、G和頭抱菌素G水解，制備生產(chǎn)半合成p內(nèi)酞胺類抗生素所需的中問體:6-氨基青霉烷酸(6 -A PA)和7氨基脫乙酞頭抱烷酸7(7 -ADCA )。傳統(tǒng)上多采用氧化反應(yīng)酒旨化及擴(kuò)環(huán)重排等化學(xué)反應(yīng)來合成7- ADCA，但其過程存在著步驟多、反應(yīng)條件要求高、成本高、三廢污染等問題，現(xiàn)在已逐漸被固定化方法所替代。3.1. 2 氨基酸上應(yīng)用 氨基酸是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位，對(duì)維持機(jī)體蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡有極其重要的意義。自然界的天然蛋白質(zhì)中存在20余種基本氨基酸，皆為L型，非基本氨基酸多為外消旋體，然而D型和L型對(duì)映體的生理作用迥異。氨基酸主要通過發(fā)酵法和合成法生產(chǎn)，D-氨基酸一般通過光學(xué)拆分得到。D-氨基?；?/p>

11、酶利用其立體專一性反應(yīng)，從化學(xué)合成的底物生產(chǎn)具有光學(xué)活性的D -氨基酸 現(xiàn)在技術(shù)研究了利用基因重組工程技術(shù)構(gòu)建高活性的氨基酞化酶工程菌連續(xù)拆分D, L蛋氨酸。氨基酞化酶工程菌經(jīng)發(fā)酵收集高活性的菌體，通過海藻酸鈉包埋技術(shù)制備固定化酶，連續(xù)拆分D,L蛋氨酸，結(jié)果比酶活性大于6 000 u/g濕菌體，酶柱比酶活性大于4 000 u/g酶，半衰期20d,可連續(xù)拆分24d,拆分率達(dá)90%，收率達(dá)74.5%左右。隨著基因工程藥物和固定化技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)D氨基酸的需求日益增加，因此篩選具有高活力D氨基?；傅木辏⑶医⑵鸷?jiǎn)單快捷生產(chǎn)D氨基酸的方法有著廣闊的工業(yè)前景。3.1.3 酶制劑上應(yīng)用 脂肪酶不僅

12、能夠催化酷的水解反應(yīng)，而且能在有機(jī)溶劑中催化醇和酸的酷合成反應(yīng)酒旨交換反應(yīng)、氨解反應(yīng)馱合成反應(yīng)等等?，F(xiàn)在技術(shù)以cM-纖維素為載體固定化脂肪酶的最適制備條件，固定化酶的酶學(xué)特性以及操作的穩(wěn)定性，結(jié)果表明本法制備得到的固定化酶酶活力較高，回收率也較高，最適溫度，pH都有了提高，穩(wěn)定性也提高了，酶和載體問的結(jié)合力較牢固。目前脂肪酶制造油化學(xué)品的重要障礙就是脂肪酶價(jià)格較高，而固定化酶具有可以回收、重復(fù)使用、穩(wěn)定性高產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，所以脂肪酶的固定化技術(shù)可以在藥物制備、食品及輕工等方面廣泛應(yīng)用。3.1.4藥物篩選上應(yīng)用 藥物篩選就是對(duì)可能作為藥物的物質(zhì)進(jìn)行初步的藥理活性的檢測(cè)和試驗(yàn)，以求發(fā)現(xiàn)其藥用價(jià)值

13、和臨床用途，為發(fā)展新藥提供最初始的依據(jù)和資料。直到20世紀(jì)70年代中期，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一直是藥物篩選的主要方法，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在需時(shí)長、勞動(dòng)強(qiáng)度大、操作技術(shù)要求高、受試樣品需要量大等缺點(diǎn)?，F(xiàn)代科技的發(fā)展為高效率的篩選藥物提供了技術(shù)條件，高通量藥物篩選技術(shù) (HTS)就是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的一種新的技術(shù)體系。 用于藥物篩選的膜蛋白微陣列，由于類脂環(huán)境影響膜蛋白的功能難以很好發(fā)揮，使微陣列制作有困難。最近微陣列技術(shù)取得了突破性進(jìn)展，解決了膜和蛋白的固定化問題，發(fā)明了一種機(jī)械上穩(wěn)定又允許單個(gè)分了在固定化膜內(nèi)移動(dòng)的系統(tǒng)，這種水平方向流動(dòng)性是生物膜的特性之一。3.1.5 手性藥物上應(yīng)用 手性藥物的臨床

14、意義已引起了人們的注意，并成為國際開發(fā)熱點(diǎn)，世界正在開發(fā)的1 200種新藥種有三分之一是手性藥物，同時(shí)手性藥物又是藥品開發(fā)中的難點(diǎn)，往往是一種對(duì)映體具有很大的藥用價(jià)值，而另一對(duì)映體沒有藥效，甚至對(duì)人體有毒害作用。如何從對(duì)映異構(gòu)體中分離出有效成分或合成有效成分是目前面臨的一大課題。 手性藥物相互作用的研究也應(yīng)用了固定化的方法。如應(yīng)用親合色譜技術(shù)時(shí)，可以在色譜柱上固定化HAS15或AGP16來研究手性藥物發(fā)生在分布環(huán)節(jié)的相互作用，就是在流動(dòng)相中添加并用藥物來考察并用藥物與對(duì)映體在分布環(huán)節(jié)有無相互作用。3.2食品行業(yè)固定化酶可應(yīng)用于食品檢測(cè)。固定化酶技術(shù)的發(fā)展使生物傳感器也得到相當(dāng)大的發(fā)展，它不僅使

15、食品成分的高選擇性、快速、低成本分析測(cè)定成為可能，而且生物傳感器技術(shù)的持續(xù)發(fā)展將很快實(shí)現(xiàn)食品生產(chǎn)的在線質(zhì)量控制，降低食品生產(chǎn)成本，并且可以保證安全可靠及高質(zhì)量的食品生產(chǎn)。3.3生物傳感器方面在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，生物傳感器因快速、靈敏、專一、響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)發(fā)揮著越來越重要的作用。目前，在檢測(cè)多種細(xì)菌、病毒及其毒素等多個(gè)方面生物傳感器已有較廣泛應(yīng)用。比如高精度血糖分析儀是采用固定化酶的生物傳感分析儀，其分析精度可以達(dá)到0.5%-2%，比家用保健類生物傳感器幾乎高一個(gè)數(shù)量級(jí)，比目前醫(yī)用生化分析儀的精度也高2%-3%，這在血糖分析領(lǐng)域是非常重要的。酶電極現(xiàn)已用于測(cè)定各種糖類、抗生素、氨基酸、有機(jī)酸、脂肪、醇類、

16、胺類以及尿素、尿酸等的含量。3.4固定化細(xì)胞技術(shù)在廢水處理中的應(yīng)用研究 3.4.1處理氨、氮廢水微生物去除氨氮需經(jīng)過好氧硝化、厭氧（缺氧）反硝化兩個(gè)階段。硝化菌、脫氮菌的增殖速度慢，要想提高去除率，必須要較長的停留時(shí)間和較高的細(xì)菌濃度，采用固定化細(xì)胞技術(shù)可做到這點(diǎn)。固定化細(xì)胞技術(shù)在處理氨氮廢水中的主要優(yōu)勢(shì)在于可通過高濃度的固定細(xì)胞，提高硝化和反硝化速度，同時(shí)還可以使在反硝化過程低溫時(shí)易失活的反硝化菌保持較高的活性。3.4.2難降解有機(jī)廢水含酚廢水的處理普遍采用活性污泥法，但此法存在污泥產(chǎn)率較高，易產(chǎn)生污泥流失，處理效率低等缺點(diǎn)。固定化細(xì)胞對(duì)廢水中酚類等有毒物質(zhì)的降解能力遠(yuǎn)大于游離態(tài)細(xì)胞。用海藻

17、酸鈉包埋對(duì)酚具有高效降解作用的小球藻細(xì)胞和紫色非硫光合細(xì)菌混合菌株，在好氧條件下處理含酚廢水，可以明顯提高除酚效率，縮短廢水停留時(shí)間，其共生體系對(duì)溫度、pH值適應(yīng)范圍廣，對(duì)焦化廠工業(yè)廢水處理24h，去除率為95以上。3.4.3含芳香烴廢水利用固定化混合菌群可降解芳香烴廢水。固定化細(xì)胞能利用這些物質(zhì)進(jìn)行生長并使之完全降解，例如酚、奈和菲均能被徹底降解。與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞表現(xiàn)出生長穩(wěn)定，降解能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。據(jù)報(bào)道用海藻酸鈣凝膠包埋固定化PinelohactersP細(xì)胞進(jìn)行降解吡啶的研究，結(jié)果表明：與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞的比降解速率和對(duì)吡啶毒性的承受能力并沒有提高，但由于固定化細(xì)胞具有較高

18、的生物濃度，所以其體積降解速率較高，而且可以重復(fù)利用，因此利用固定化細(xì)胞降解吡啶是可行的。3.4.4處理重金屬廢水由于微生物經(jīng)固定化后，其穩(wěn)定性增加，抗生物毒性物質(zhì)的能力也大大增加，因此，可以被廣泛地用于各種有機(jī)廢水中重金屬離子的去除。GeoffeyW等將小球藻固定在藻阮酸鹽中，用來聚集Co，Zn，Mn等金屬，在5h內(nèi)62的Co，40的Mn，54的Zn被吸附；與之相比，在相同的條件下，懸浮細(xì)胞的吸附量要小得多。吳乾蓄等利用聚丙烯酸胺固定化酵母菌細(xì)胞去除電鍍廢水中的Cd2+，在pH=9，Cd2+的質(zhì)量濃度為1400mgL時(shí)，反應(yīng)lh，Cd2+的去除率98.9；采用未固定化細(xì)胞則去除率為37.6。

19、分別用0.lmolL的HCI和0.lmolL的EDTA解吸，Cd2+的回收率為88.5和87.6。在環(huán)境監(jiān)測(cè)方面，固定化酶也可以用于測(cè)定有毒物質(zhì)含量以進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)。在廢水處理中，固定化酶也越來越受科學(xué)家的關(guān)注。在水環(huán)境污染日益嚴(yán)重的今天，固定化酶的污水處理技術(shù)有著廣闊的研究潛力和應(yīng)用前景。4.展望近幾年來，酶的固定化技術(shù)取得了長足的進(jìn)步，并成為生物化學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。研究者不斷對(duì)傳統(tǒng)固定化技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，并開發(fā)新的固定化方法，一定程度上改善了一些酶的性能，包括穩(wěn)定性、催化活力、立體選擇性和回收再利用性能，他們用實(shí)踐證明了酶的固定化仍然是最好的改善酶的催化性能的手段。酶固定化技術(shù)已在食品工業(yè)、精細(xì)化學(xué)品工業(yè)、醫(yī)藥，尤其是手性化合物等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，在廢水處理方面也取得了一定進(jìn)展。用酶技術(shù)生產(chǎn)化工產(chǎn)品，條件溫和，無“三廢”產(chǎn)生，隨著人類對(duì)環(huán)保的日益關(guān)注，酶的固定化及應(yīng)用研究已得到長足進(jìn)展。然而，固定化酶研究具有的高新技術(shù)特征與基礎(chǔ)理論意義，仍使其處于國際學(xué)科前沿，具有很大的研究發(fā)展空間。設(shè)計(jì)和開發(fā)新的合成載體材料，利用和改性質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的天然高分子載體材料，探索和研究新的固定化技術(shù)將是這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。而固定化酶在各行業(yè)的應(yīng)用研究也必將推動(dòng)酶固定化技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展參考文獻(xiàn)：【1】 李黎,馬力,李鶴.中國組織工程研究與臨床康。 【2】 李