酵母各種雜交

1、2016-7相關(guān)知識(shí)： 1、順式作用元件：存在于基因旁側(cè)序列中能影響基因表達(dá)的序列。包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控。2、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）：能直接或間接地識(shí)別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)。3、報(bào)告基因：是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因。4、cDNA文庫(kù)：以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA ，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫(kù)?；驹碚婧松L(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)的、功能上也相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激

2、活結(jié)構(gòu)域(AD)(activation domain) DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNA binding domain) 轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子 BD：識(shí)別DNA上特定序列，轉(zhuǎn)錄激活域定位調(diào)控 基因的上游。 AD：與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體其他成分作用，從而啟動(dòng)所調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分開(kāi)時(shí)仍具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有他們以適當(dāng) 途徑在空間上相互靠近時(shí)，才能具有轉(zhuǎn)錄因子活性，激活報(bào)告基因的表達(dá)。 酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過(guò)激活報(bào)告基因的表達(dá)，探測(cè)蛋白-蛋白的相互作用。酵母雙雜交原理示意圖XDBDReporter genePreyBaitADYExpressionUASnDNA結(jié)合域

3、（DNA-BD）：N端1-147氨基酸,可識(shí)別并結(jié)合酵母半乳糖苷酶的上游激活序列(UAS) 。n轉(zhuǎn)錄激活域（AD）：C端786-881氨基酸,通過(guò)同轉(zhuǎn)錄機(jī)制的其它成分之間的結(jié)合以啟動(dòng)上游激活序列（UAS）下游的基因轉(zhuǎn)錄。1、構(gòu)建質(zhì)粒（誘餌蛋白不發(fā)生自激活）2、轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（本身不表達(dá)GAL4）3、陽(yáng)性篩選1.（1）BD-plasmid 靶基因(蛋白A基因)按正確的讀碼結(jié)構(gòu)和取向克隆在GAL4的BD之后。 篩選標(biāo)志：TRP（2）AD-plasmid 蛋白B基因按正確閱讀框 克隆到GAL4的AD片斷 之后。 篩選標(biāo)志：LEU2 （1）雙載體轉(zhuǎn)化能合成亮氨酸和色氨酸。Trp- -Leu- -2. 兩

4、種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母菌（HF7c）3.篩選觀察 （2）篩選蛋白A和蛋白B能相互作用的雙載體轉(zhuǎn)化子。Trp- -Leu- -His- -酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞cDNA文庫(kù)文庫(kù) 誘鉺蛋白基因誘鉺蛋白基因多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)DNA-BD 載體載體 AD 載體載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞篩選平板篩選平板生長(zhǎng)菌苔生長(zhǎng)菌苔篩選平板篩選平板生長(zhǎng)菌苔生長(zhǎng)菌苔同一個(gè)三重篩選平板同一個(gè)三重篩選平板克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用）克隆（誘餌與靶蛋白相互作用）鑒定鑒定-半乳糖苷酶半乳糖苷酶酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用：（1）發(fā)現(xiàn)新蛋白和蛋白的新功能（2）研究抗原和抗體的作用（細(xì)胞內(nèi)）（3）檢測(cè)已知蛋白質(zhì)之間的相互作用（4）確

5、定未知蛋白之間的相互作用（5）確定基因治療中多肽類藥物的作用機(jī)理應(yīng)用舉例應(yīng)用酵母雙雜交篩選與 FAM172A相互作用蛋白的研究實(shí)驗(yàn)步驟：（1）誘餌質(zhì)粒構(gòu)建：擴(kuò)增誘餌蛋白基因與質(zhì)粒載體連接重組載體鑒定誘餌蛋白自我轉(zhuǎn)錄激活檢測(cè)：將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株，若轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒的酵母菌落表達(dá)-半乳糖苷酶，則可使底物X-Gal 變藍(lán)，說(shuō)明存在自激活（假陽(yáng)性），否則無(wú)自激活。（2）人胎腦cDNA質(zhì)粒構(gòu)建（3）酵母雙雜交篩選人胎腦 cDNA 文庫(kù)人胎腦 cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化誘餌酵母菌及初步篩選: 菌液，分別涂布于培養(yǎng)基（A：Leu-/Trp-、B: Leu-/Trp- /His-），A平板上的克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋度

6、計(jì)算轉(zhuǎn)庫(kù)效率（轉(zhuǎn)庫(kù)效率只有達(dá)到 1X107-1X108cfu/gDNA以上才能進(jìn)行文庫(kù)的篩選，以保證不會(huì)丟失陽(yáng)性克隆半乳糖苷酶克隆轉(zhuǎn)移濾紙實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選: 從B: Leu-/Trp- /His-平板上挑取 35 個(gè)單克隆進(jìn)行 -半乳糖苷酶克隆轉(zhuǎn)移濾紙實(shí)驗(yàn)，變藍(lán)色的為陽(yáng)性克隆。（3）陽(yáng)性雜交克隆的質(zhì)粒抽提及一對(duì)一驗(yàn)證: 對(duì)上述篩選的陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，再次進(jìn)行抗性篩選和質(zhì)粒抽提后，一對(duì)一與誘餌質(zhì)粒 p GB-FAM172A共轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞 Y190 驗(yàn)證。（4）再次陽(yáng)性者抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析: 利用 NCBI 對(duì)測(cè)序所得到的序列進(jìn)行 BLAST 比對(duì)分析。對(duì) 10個(gè)陽(yáng)性克隆相應(yīng)的質(zhì)粒進(jìn)

7、行測(cè)序后，通過(guò) BLAST在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng) 6個(gè)不同的基因，編碼6種已知的蛋白質(zhì)： RTCD1、 MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和TOX2，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)獲得了它們的功能信息。其中 A2M與糖尿病血管病變密切相關(guān)，也進(jìn)一步提示 FAM172A參與了糖尿病大血管病變的發(fā)病。n（1）用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究蛋白質(zhì)的相互作用，方法精確，不受外界影響，易于操作; n（2）所有操作均在核酸水平進(jìn)行，無(wú)需純化大量的蛋白質(zhì)，可以精確測(cè)定蛋白質(zhì)的弱相互作用；n（3）運(yùn)用范圍較大：酵母雙雜交系統(tǒng)中的誘餌蛋白可以是完整的蛋白質(zhì)，也可以是蛋白質(zhì)的一個(gè)功能區(qū)，可以大到一個(gè)完整的

8、腫瘤抑制蛋白，也可以小到一個(gè)約22個(gè)氨基酸的多肽。局限性1、它并非對(duì)所有蛋白質(zhì)都適用。 有其原理決定，融合蛋白的相互作用激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的，而表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)能否正確折疊并運(yùn)至核內(nèi)是檢測(cè)的前提條件。2、假陽(yáng)性較多： 某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。 如AD融合靶蛋白有DNA的特異 結(jié)合，則可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽(yáng)性結(jié)果一定要通過(guò)其它的實(shí)驗(yàn)手段來(lái)驗(yàn)證。3、陰性干擾：兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來(lái)。 蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。 某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。4、融合

9、蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性，應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了酵母單雜交、酵母三雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫(kù)蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究。 酵母單雜交體系是借鑒酵母雙雜交體系的基本原理，通過(guò)觀察酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因的表達(dá)狀況，研究DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 n設(shè)計(jì)含目的基因（誘餌）和下游報(bào)告基因的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。n 將文庫(kù)蛋白的編碼基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入同一酵母細(xì)胞中。n 若文庫(kù)蛋白與目的基因相互作用，可通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)將其篩選。n實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)短：能直接識(shí)別并找出與特異順式作用元件相

10、結(jié)合的蛋白質(zhì)及其編碼序列，而不需通過(guò)制備純化蛋白或抗體等繁瑣的生化手段來(lái)建立這種相互作用關(guān)系；n酵母屬于真核生物，且蛋白質(zhì)處于自然構(gòu)象，避免了體外研究的不足。n與內(nèi)源性的表達(dá)激活因子發(fā)生相互作用；n假陽(yáng)性：插入的靶元件有可能不需要轉(zhuǎn)錄激活因子就可以直接激活報(bào)道基因的表達(dá)；n假陰性：融合蛋白有毒性、不能穩(wěn)定地表達(dá)，錯(cuò)誤折疊不能準(zhǔn)確定位于酵母細(xì)胞核內(nèi)、DNA 結(jié)合位點(diǎn)被封閉；n酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白修飾缺乏；TF: 介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的第三種因子， 可以是蛋白質(zhì),DNA,RNA或小分子配體。兩個(gè)蛋白之間通過(guò)第三者發(fā)生相互作用，用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)與RNA、蛋白、小分子配體間相互作用酵母三雜交技術(shù)1、研究RNA-蛋白質(zhì)間相互作用2、研究小分子受體與蛋白質(zhì)受體間相互作用 在該系統(tǒng)中, 第三個(gè)雜交小分子為Dex(地塞米松)-FK506 偶聯(lián)體, 利用已知的地賽米松受體和FK506 受體FKBP12 分別構(gòu)建AD 和BD 融合蛋白, 三種分子相互作用后, 成功的激活了報(bào)道基因的表達(dá);而當(dāng)單體FK506 分子引入時(shí), 由于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FKBP12 , 導(dǎo)致三元復(fù)合物無(wú)法形成, 幾乎完全抑制了報(bào)道基因的表達(dá)。3、研究復(fù)雜的蛋白-蛋白間相互作用